Extracto
El objetivo del presente estudio fue investigar el patrón de expresión y el significado clínico-patológica de trim24 en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). El perfil de expresión de trim24 en los tejidos de NSCLC y tejidos pulmonares cancerosos adyacentes se detectó mediante inmunohistoquímica. Trim24 se encontró que se sobreexpresa en 81 de 113 (71,7%) muestras de cáncer de pulmón humano y se correlacionó con p-TNM etapa (p = 0,0006), pobre diferenciación (p = 0,004), el índice de Ki67 (p & lt; 0,0001), ciclina D1 ( p = 0,0096) y la expresión de P-Rb (p = 0,0318). Además, el agotamiento de expresión trim24 por interferente pequeño ARN inhibe el crecimiento y la invasión en líneas celulares de pulmón. Por otra parte, el agotamiento inducido trim24 la detención del ciclo celular en la transición G1 /S frontera y la apoptosis inducida. análisis de transferencia Western reveló que desmontables de trim24 disminuyó los niveles de proteína de la ciclina A, ciclina B, ciclina D1, ciclina E y p-Rb y el aumento de expresión de P27. Estos resultados indican que trim24 juega un papel importante en la progresión del NSCLC
Visto:. Li H, Sun L, Tang Z, Fu L, Xu Y, Li Z, et al. (2012) La sobreexpresión de trim24 correlaciona con la progresión tumoral en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (5): e37657. doi: 10.1371 /journal.pone.0037657
Editor: Rana Pratap Singh, Jawaharlal Nehru University, India
Recibido: 2 Enero, 2012; Aceptado: April 23, 2012; Publicado: 30 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es una de las principales causas de todo muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo y la incidencia de cáncer de pulmón está aumentando [1], [2]. La mayoría de los casos de cáncer de pulmón diagnosticados son los cánceres de pulmón no microcítico (NSCLC de células). Aunque se han establecido tres modalidades terapéuticas (resección quirúrgica, quimioterapia, y radioterapia), la supervivencia a largo plazo para los pacientes con cáncer de pulmón sigue siendo generalmente pobre [3]. Una variedad de complejos genética, epigenética, y factores microambientales juegan un papel importante en la supervivencia y la colonización de las células tumorales en nuevas ubicaciones [4], [5]. Una mejora en la comprensión de los procesos moleculares implicados en la carcinogénesis pulmonar ha dado lugar a nuevas opciones de tratamiento con moléculas pequeñas y vacunas destinatarios que demuestren fomentar potencial. Por lo tanto, definir mejor la patogénesis del cáncer de pulmón, en busca de biomarcadores útiles, y la exploración de nuevas dianas terapéuticas son exigentes tareas.
trim24 fue originalmente llamado factor de transcripción intermediario 1-alfa (TIF1α), que fue identificado como un co -regulator de retinoide señalización [6] - [8]. la expresión aberrante de trim24 podría promover el desarrollo de tumores por múltiples mecanismos. Trim24 es un objetivo de translocaciones cromosómicas para formar proteínas de fusión oncogénicos en la leucemia promielocítica aguda, carcinoma papilar de tiroides y síndrome mieloproliferativo [9] - [11]. Trim24 podría ubiquitylate y negativamente regular los niveles de p53, lo que hizo trim24 una diana terapéutica para restaurar la supresión tumoral por p53 [12]. Trim24 también se une la cromatina y los receptores de estrógenos para activar genes dependientes de estrógeno que se asociaron con la proliferación celular y el desarrollo de tumores [13], [14]. La expresión elevada de trim24 podría promover la progresión del cáncer de próstata y una correlación negativa con la supervivencia de pacientes con cáncer de mama [14], [15]. Estos hallazgos sugieren que trim24 era un oncogén en el desarrollo tumoral. Sin embargo, estudios recientes muestran que la pérdida de trim24 en ratones llevó al desarrollo de carcinoma hepatocelular y trim24 interactuó con trim28 y TRIM33 para formar complejos de regulación que suprimieron carcinoma hepatocelular murino, lo que sugiere su papel como un supresor tumoral en el carcinoma hepatocelular [16]. Además, calcificaciones arteriales y la expresión de los objetivos de receptor de vitamina D se incrementaron en los ratones que carecen trim24, mostrando que trim24 podría prevenir la calcificación de las arterias por la disminución de la actividad de la vía de señalización de la vitamina D [17].
La expresión de la proteína de trim24 en el cáncer de pulmón primario y su relación con los factores clínico-patológicos aún no han sido examinados. Además, las funciones biológicas de trim24 en células de cáncer de pulmón aún no están claros. Con el fin de hacer frente a las preguntas anteriores, se analizó la expresión de trim24 de células no pequeñas de cáncer de pulmón tejidos mediante inmunohistoquímica. Además, también se exploró la asociación de trim24 con la proliferación y capacidad de invasión en varias líneas celulares de cáncer de pulmón.
Resultados
sobreexpresión de la proteína trim24 de células no pequeñas de cáncer de pulmón tejidos
Se analizó la expresión de trim24 en 113 muestras de NSCLC y sus tejidos normales correspondientes mediante técnicas de inmunohistoquímica. expresión trim24 se observó en los compartimentos nucleares de las células tumorales (Figura 1 C-G), mientras que el epitelio bronquial normal y neumocitos exhibieron negativo o bajo la tinción (Figura 1 A, B). La intensidad de la tinción del epitelio respiratorio normal adyacente al tumor podría ser evaluado en varias secciones que contienen los tumores malignos y los tejidos normales en el mismo portaobjetos. Considerando que se ha detectado ninguno de tinción débil para trim24 en los tejidos pulmonares normales, se detectó una fuerte tinción de trim24 en las células tumorales adyacentes (Figura 1 C). Se investigó la relación entre la expresión trim24 total y los parámetros clínicos. Como se muestra en la Tabla 1, no se encontró diferencia estadística entre la sobreexpresión trim24 y las características de la edad (p = 0,4697), el sexo (p = 0,1814), el estado del tumor (p = 0,1812), el estado ganglionar (p = 0,0825) y tumor tipo (p = 0,6327). Sin embargo, los pacientes con expresión de alto trim24 mostró pobre diferenciación (p = 0,004) y tenía etapa avanzada de NSCLC (I vs II + III + IV, p = 0,0006). Se examinó la expresión de Ki-67 para investigar la relación entre la positividad trim24 y la actividad proliferativa de tejidos de cáncer por inmunohistoquímica. Los casos que tenían altos niveles de expresión trim24 tendían a tener un alto índice de proliferación indicado por Ki-67 etiquetado (p & lt; 0,0001). análisis de inmunofluorescencia doble se realizó y co-localización de Ki-67 y trim24 se observó (Figura 2A, B). La inmunotinción para p53, retinoico alfa del receptor de ácido (RAR), ciclina D1, p-Rb, p27 y también se llevaron a cabo y se analizó su asociación con la expresión trim24 (Figura 2 C-H). Como se muestra en la Tabla 1, trim24 sobreexpresión correlacionada con alta ciclina D1 (p = 0,0096) y p-Rb expresión (p = 0,0318), mientras que no se encontró diferencia estadística entre la sobreexpresión trim24 y p53 (p = 0,9028), RAR (p = 0,1025), y el estado de p27 (p = 0,6335).
A. tinción negativa en el epitelio bronquial normal en el tejido pulmonar no cancerosa. B. tinción negativa en los neumocitos normales en los alvéolos de tejido pulmonar no cancerosa. C. trim24 inmunotinción fue negativa en el epitelio bronquial adyacente al adenocarcinoma de pulmón. D. tinción trim24 negativa en un caso de Stagel, moderadamente diferenciado carcinoma de células escamosas. E. tinción negativa en Stagel, bien diferenciado adenocarcinoma de pulmón. tinción positiva F. trim24 en un caso de la Etapa II, carcinoma de células escamosas escasamente diferenciado. tinción positiva G. trim24 en un caso de la Etapa III, adenocarcinoma moderadamente diferenciado. H. Control negativo utilizando inmunoglobulina de conejo.
La tinción de inmunofluorescencia mostró co-localización de trim24 y Ki-67 en el adenocarcinoma (A) y carcinoma de células escamosas (B). Tinción inmunohistoquímica para trim24 (C) y RAR (D), cyclinD1 (E), p-Rb (F), p27 (G) y p53 (H) tinción en un caso de NSCLC.
trim24 agotamiento inhibe la proliferación, invasión e induce la apoptosis en líneas celulares de cáncer de pulmón
la expresión de trim24 se analizó por Western blot en un panel de líneas celulares de cáncer de pulmón (Figura 3). Encontramos el nivel de expresión trim24 en células H1299 y A549 fue mayor que otras líneas celulares. Dado que el papel de trim24 está estrechamente asociada con p53 y RAR en algunos tipos de tumor, que también examinó la expresión de p53 y RAR en líneas celulares de cáncer de pulmón. No hubo asociación evidente entre estos factores. Con el fin de explorar la función biológica de trim24 en cáncer de pulmón, se emplearon siRNA desmontables expresión trim24 tanto en líneas celulares A549 y H1299. -Trim24 siRNA reduce considerablemente tanto mRNA así como los niveles de expresión de proteínas de trim24 después de 48 horas de tratamiento siRNA (Figura 3). Nuestro análisis de proliferación celular demostró que el agotamiento de trim24 en H1299 y las células A549 condujo a una reducción significativa de la tasa de proliferación (A549 reducción de 39% en el día 5, p & lt; 0,05; reducción H1299 23% en el día 5, p & lt; 0,05) y números de focos así como los tamaños (control A549 vs TRIM24si: 400 ± 38 vs 130 ± 20, P & lt; 0,05; H1299 de control vs TRIM24si: 235 ± 25 vs 85 ± 18, p & lt; 0,05), lo que sugiere que trim24 modula la proliferación de cáncer de pulmón las células (Figura 4). Análisis de ciclo celular mostró que en desmontables células trim24 el porcentaje de S y la fase G2 fue mucho menor que las células de control y se aumentó el porcentaje de la fase G1 (Figura 5A). Por lo tanto trim24 caída progresión del ciclo celular inhibida.
A. Los niveles de expresión de trim24, p53 y RAR se analizaron por Western blot en un panel de líneas celulares de cáncer de pulmón. blot B. Western de la eficiencia agotamiento trim24 en células de cáncer. C. análisis PCR en tiempo real de la eficiencia agotamiento trim24 en las células cancerosas.
A. ensayo de MTT se realizó después del tratamiento trim24 siRNA. Se observó una reducción de la absorbancia (p & lt; 0,05 en el día 5 para ambos A549 y H1299). B. Evaluación de los potenciales de clonogénicas de las células de cáncer de trim24-agotado. Se contaron los números de colonias. El número de colonias formadas por las células tratadas con trim24 siRNA era mucho menor que la de las células de control (p & lt; 0,05). Columnas, significan; bares, Dakota del Sur. * P & lt;. 0.05
El porcentaje de la fase G1 se incrementó en las células con trim24 desmontables (H1299 y A549, p & lt; 0,05), mientras que los porcentajes de la fase S (H1299, p & lt; 0,05) y fase G2 (H1299 y A549, p & lt; 0,05) se redujo en estas células en comparación con células de control (a). Trim24 desmontables también indujo apoptosis de las células tanto en líneas celulares H1299 (B, P & lt; 0,05) y A549. * P & lt;.
0,05
Además, se empleó el kit Anexina V para caracterizar la función de muerte de las células H1299 y A549 con trim24 desmontables (Figura 5B). Claramente, una población significativa de apoptosis temprana y tardía (H1299: 7,22%; A549: 10,45%) se observó en células con trim24 caída en comparación con los controles revueltos (H1299: 3,76%; A549: 8,43%), lo que demuestra que los trim24 resultados caída en la apoptosis de las células del cáncer de pulmón, especialmente en H1299 células que tienen una expresión de alto trim24 endógeno.
para determinar si trim24 contribuye a la invasión de células no pequeñas de cáncer de pulmón de células, que llevó a cabo los ensayos de invasión de matrigel. Como se muestra en la Figura 6A, trim24 la invasión de células desmontables inhibido (control A549 vs TRIM24si: 91 ± 15 vs 68 ± 11, p & lt; 0,05; H1299 de control vs TRIM24si: 62 ± 4 vs 38 ± 8, p & lt; 0,05).
tratamiento trim24 siRNA tiene un efecto mensurable sobre el bloqueo de la invasión celular en ambas líneas celulares. Se contaron el número de células invasoras en la superficie inferior del filtro, se observó una diferencia significativa (A, p & lt; 0,05). Columnas, significan; bares, Dakota del Sur. No hubo ningún cambio significativo de los niveles de MMP2 y MMP9 expresión después de trim24 desmontables (B). * P & lt;.
0,05
Para profundizar en los mecanismos por los cuales trim24 promueve la invasión de células NSCLC, se analizó la expresión de MMP-2 y MMP-9 expresión antes y después de la transfección de siRNA. Como se muestra en la Figura 6B, los niveles de mRNA de MMP-2, MMP-9 fueron examinados por cuantitativa en tiempo real RT-PCR. Sin embargo, no se observaron cambios notables de su expresión.
El agotamiento de trim24 Downregulated ciclina A, B, E y D1 Expresión y P27 regulada por incremento en células de cáncer de pulmón
El ciclo celular se realizaron análisis células de cáncer, con o sin trim24 desmontables, y encontraron que el porcentaje de la fase G1 se incrementó en las células con trim24 caída, mientras que el porcentaje de la fase S se redujo en estas células en comparación con células de control (Figura 5). Estos resultados indican que el agotamiento de trim24 induce la detención del ciclo celular en la transición G1 /S límite. Además, se redujo la proporción de células en fase G2. Para investigar la detención del ciclo celular subyacente mecanismo, hemos probado el efecto de la caída en trim24 ciclina A, ciclina B, ciclina D1, ciclina D3, ciclina E, CDK2, CDK4, CDK6, P-Rb, los niveles de p21 y p27. Como se muestra en la Figura 7A, el análisis de transferencia de Western reveló que desmontables de trim24 disminuyó los niveles de proteína de la ciclina A, B, D1, E, p-Rb y aumento de la expresión P27. En conjunto, estos resultados sugieren que la inhibición de la expresión trim24 induce la detención del ciclo celular en la transición G1-S y suprime el crecimiento de células de cáncer de pulmón. Para medir directamente la actividad transcripcional de p53, un plásmido indicador de luciferasa sensible a p53 se utilizó para examinar la relación entre la actividad de p53 trim24 y en líneas celulares de cáncer de pulmón. No hubo ningún cambio significativo de la actividad de p53 celular después de trim24 desmontables (Figura 7B).
análisis de transferencia de Western de una serie de factores relacionados con el ciclo celular mostró los niveles de proteína de la ciclina A, B, D1, E y p- Rb se redujeron y la expresión de P27 se incrementó después de silenciar trim24 en H1299 y células A549 (a). No hubo ningún cambio significativo de la actividad de luciferasa p53 tras el tratamiento siRNA en ambas líneas celulares (B).
Discusión
Sobre regulación de la expresión trim24 había sido implicado en varios cánceres humanos tales como la leucemia promielocítica aguda, carcinoma papilar de tiroides y el cáncer de mama [9] - [11], [14]. Por otra parte, la sobreexpresión trim24 correlacionada con la supervivencia de pacientes con cáncer de mama [14], [15]. Sin embargo, el patrón de expresión de trim24 así como su correlación con factores clínicos y patológicos todavía no se ha definido en el cáncer de pulmón humano. En este estudio, hemos demostrado que la expresión de proteínas trim24 en tejidos de cáncer de pulmón fue mayor que en los correspondientes tejidos pulmonares normales. Hubo una estrecha correlación entre trim24 regulación y la etapa pTNM y diferenciación.
La investigación anterior en relación con su patrón de expresión mostró que trim24 se sobreexpresa en los cánceres de mama, tanto a nivel de ARNm y proteínas y su sobreexpresión se correlaciona con ER, PR estado y mal pronóstico [15]. Nuestro estudio encontró una correlación entre la sobreexpresión trim24 y la etapa pTNM y pobre diferenciación en el cáncer de pulmón, que estaba de acuerdo con los datos anteriores, lo que sugiere trim24 puede jugar un papel importante en la progresión del cáncer de pulmón. Para validar el papel potencial de trim24 en el desarrollo del cáncer de pulmón, nos registramos por primera vez su nivel de expresión en varias líneas celulares y recogimos A549 y H1299 con un nivel relativamente alto trim24 en estudio. Empleamos siRNA desmontables expresión trim24 en estas dos líneas celulares. Hemos encontrado una alteración de la capacidad de proliferación y capacidad de formación de colonias de ambas células A549 y H1299 después trim24 caída. Por otra parte, ensayo de invasión de matrigel mostró disminución de la capacidad de las células tratadas ARNsi invasor. Por lo tanto, nuestro estudio sugiere que trim24 funcionó como un oncogén en el desarrollo del cáncer de pulmón.
Informe anterior indicó que trim24 puede p53 directamente ubiquitinate y negativamente regular el nivel de la proteína p53 en líneas celulares de cáncer de mama, lo que implica su papel en la proliferación y apoptosis [12]. La mayoría de los factores de proliferación influir en el crecimiento celular al afectar la progresión del ciclo celular. Así se empleó el análisis del ciclo celular y se encontró que desmontables células trim24 mostraron niveles más altos de la fase G1 y la fase inferior S que las células control. Así trim24 G1 desmontables inhibido a S transición en la progresión del ciclo celular, lo que podría explicar el mecanismo de trim24 sobre la proliferación celular del cáncer de pulmón. Trim24 caída también indujo apoptosis en células H1299 y A549, que puede en parte debido a la obstrucción de transición G1 /S. Además, demostramos que trim24 siRNA bloqueó la invasión celular. Para explorar más a fondo el mecanismo, se analizó la expresión de MMP-2 y MMP9 relacionados invasión. No se observaron cambios notables a estas moléculas. Se podría argumentar que hay otros aspectos funcionales de trim24 que contribuyen a la regulación, que necesita más investigación.
Para averiguar el mecanismo potencial de trim24 en la regulación del ciclo celular, se analizó el efecto de la caída en un trim24 número de moléculas relacionadas con el ciclo celular. Se verificó la expresión de ciclina A, B, D1, D2, D3, E, H, CDK2 /4/6, p-Rb, p21 y p27. Se encontró que los niveles de ciclina A, B, D1, E y P-Rb se redujeron después de trim24 caída, mientras que el nivel de expresión de p27 era elevada. Ciclina D1 interactúa con Cdk4 /6 para formar una Rb de fosforilación complejo, que regula la proliferación celular mediante el control de la progresión a través del punto de restricción dentro de la fase G1 del ciclo celular [18]. Ciclina D1 se sobreexpresa en una variedad de tipos de cáncer y se asocia con la proliferación de células del cáncer [19] - [21]. Ciclina A es necesaria para que las células progresan a través de la fase S [22]. Ciclina B es una ciclina mitótica y su acumulación sólo se encuentra en la transición G2-M [23]. La proteína p27 supresor de tumores actúa como un inhibidor de la progresión del ciclo celular. En asociación con complejos de CDK2, P27 sirve para inhibir la actividad de la quinasa y la progresión bloque a través de G1 /S [24], [25]. Así, nuestros resultados que muestra disminución del nivel de ciclina A, B, D1, E, p-Rb y aumento de la proteína p27 se correlacionó con el hecho de la disminución del nivel de S y las células en fase G2 y el aumento de células en fase G1 después de trim24 desmontables, lo que sugiere trim24 juega un importante papel en el control del ciclo celular de células de cáncer de pulmón. Además, la sobreexpresión trim24 se asoció con altos niveles de ciclina D1 y p-Rb en las muestras de cáncer de pulmón.
Algunos datos mostraron que el papel de trim24 se asoció con p53 y retinoico alfa del receptor de ácido. Examinamos estos dos factores en muestras clínicas y líneas celulares. Sin embargo, no encontramos relación significativa entre trim24 y estos factores. Además, no se observó ningún cambio evidente de la actividad de p53 celular después de trim24 caída en A549 (p53 de tipo salvaje) y las líneas celulares H1299 (p53 null) utilizando el sistema indicador de luciferasa, lo que sugiere el papel de trim24 en la regulación del ciclo celular es independiente de la actividad de p53.
en conclusión, el presente estudio investigó el patrón de expresión y el significado clínico-patológica de trim24 en CPNM y se dirigió a la función biológica y el mecanismo potencial de trim24 en la progresión del cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
pacientes y muestras
Este estudio se llevó a cabo con la aprobación de la junta de revisión institucional local de la Universidad médica de china. 113 casos de CPNM muestras se obtuvieron del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de China durante el período de 2007 a 2009. El diagnóstico histológico y el grado de diferenciación de los tumores fueron definidas por la evaluación de las secciones de tejido hematoxilina y eosina-manchado, según las directrices de la Organización Mundial de la Salud de la clasificación. Las 113 muestras fueron reevaluados con respecto a sus subtipos histológicos, estado de diferenciación, y las fases del tumor. Para las muestras de NSCLC, el carcinoma de células escamosas y el adenocarcinoma se identificaron en el 42 y 71 de los 113 casos, respectivamente. No se observaron metástasis en los ganglios linfáticos en 46 pacientes. Se utilizó el sistema taging p-TNM de la Unión Internacional Contra el Cáncer (7ª edición) para clasificar las muestras como los estadios I (n = 49), II (n = 35), III y IV (n = 29).
líneas celulares
NHBE, A549, líneas celulares H1299, H157, H460, H1299 y se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). SPC, LTE, y LK2 líneas celulares se adquirieron de Shanghai Banco de Células de la Academia China de Ciencias. BE1 línea celular fue un regalo del Dr. J Zheng (Departamento de Patología de la Universidad de Pekín, Pekín). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) que contenía suero de ternera fetal al 10% (Invitrogen), 100 UI /ml de penicilina (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.), y 100 mg /ml de estreptomicina ( Sigma). Las células se cultivaron en placas de cultivo de tejido estériles y se pasaron cada 2 días utilizando 0,25% de tripsina (Invitrogen).
Inmunohistoquímica
muestras de tumores extirpados quirúrgicamente se fijaron con 10% de formalina neutral, embebidos en parafina y se prepararon 4 micras de grosor. La inmunotinción se realizó mediante el método del complejo avidina-biotina-peroxidasa (Ultra Sensitive TM, Maixin, Fuzhou, China). Las secciones se desparafinaron en xileno, se rehidrataron en alcohol graduado serie y se hirvió en tampón de citrato 0,01 M (pH 6,0) durante 2 minutos en un autoclave. actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno (0,3%), que fue seguido por la incubación con suero de cabra normal para reducir la unión no específica. Las secciones de tejido se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo TRIM-24 (1:150 dilución) (Proteintech, Chicago, IL, EE.UU.). inmunoglobulina de conejo se utilizó como control negativo. coloraciones de inmunohistoquímica para Ki67 (1:200 dilución) (Maixin, Fuzhou, China), RAR (1:200 dilución) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), p53 (1:200 dilución) (DO-7, Santa Cruz de Biotecnología), la ciclina D1 (1:100 dilución) (tecnología de señalización celular, Boston, MA, EE.UU.), p-Rb (1:200 dilución) (tecnología de señalización celular, Boston, MA, EE.UU.) y p27 (1: también se realizaron 150 dilución) (Santa Cruz Biotechnology). La tinción para todos los anticuerpos primarios se realizó a temperatura ambiente durante 2 horas. biotina de cabra IgG en suero anti-ratón, de cabra biotinilado anti-IgG de suero de conejo (listo para usar) (Maixin, Fuzhou, China) se utilizó como anticuerpo secundario. Después del lavado, las secciones se incubaron con peroxidasa de rábano picante conjugada con estreptavidina-biotina, seguido por 3, tetrahidrocloruro 3'-diaminobencidina para desarrollar la reacción de la peroxidasa. Contratinción de las secciones se realizó con hematoxilina, que fueron deshidratados en etanol antes del montaje.
Dos investigadores independientes examinaron todas las diapositivas tumorales al azar. Cinco miradas fueron examinados por diapositiva, y no se observaron 100 células por visión a 400 × magnificación. La inmunotinción de trim24 se obtuvo tras una escala semicuantitativa mediante la evaluación en áreas representativas del tumor, la intensidad y el porcentaje de células que muestran la inmunotinción más alta que las células de control. tinción nuclear de las células tumorales se consideró como la inmunotinción positiva. La intensidad de la tinción nuclear trim24 también se puntuó como 0 (sin tinción), 1 (débil), 2 (marcado). anota Porcentaje fueron asignados como 1- 1-25%, 26-50% 2-, 3- 51-75% y 4- 76-100%. Las puntuaciones de cada muestra de tumor se multiplicaron para dar una puntuación final de 0 a 8 y la expresión total de trim24 se determinó como sea expresión negativa o baja (-): score & lt; 4 o sobreexpresión (+): Puntuación ≥4. Se evaluó la tinción inmunohistoquímica para Ki-67 y anotó como el porcentaje de células cancerosas con inmunorreactividad nuclear con un total de 500 células tumorales examinadas por diapositiva. El valor de la mediana de esta serie (35% de células positivas) se utilizó como un valor umbral para distinguir los tumores con un bajo (& lt; 35%) versus alto índice de proliferación celular (≥35%). De acuerdo con los criterios anteriores para la evaluación de la ciclina D1, p53, pRb expresión, se determinó su nivel de expresión como de alta o baja /negativa [26]. expresión de p27 se determinó como positivo o negativo según el informe anterior [27]. De acuerdo con los criterios anteriores, la expresión de RAR se determinó como una expresión elevada o baja expresión [28].
inmunofluorescencia
secciones de 4 micras se deparaffinized en xileno, rehidratada en serie graduada de alcohol y se hierven en 0,01 tampón de citrato M (pH 6,0) durante 2 minutos en un autoclave. análisis de inmunofluorescencia doble se realizó con anticuerpo monoclonal de ratón para Ki67 (Maixin), y anticuerpo policlonal de conejo a trim24. De cabra anti-conejo (Alexa Fluor 488 marcado; Molecular Probes) y de cabra anti-ratón (Alexa Fluor 594 marcado; Molecular Probes) se utilizaron como anticuerpos secundarios. Las señales de fluorescencia fueron analizados mediante el registro de imágenes teñidas utilizando Olympus FV1000 microscopio láser confocal de barrido.
cuantitativa en tiempo real PCR (método SYBR Green)
Cuantitativo en tiempo real PCR se realizó utilizando SYBR Green PCR master Mix (Applied Biosystems) en un volumen total de 20 l en 7900HT Sistema de PCR rápida en tiempo real (Applied Biosystems) como sigue: 95 ° C durante 30 segundos, 40 ciclos de 95 ° C durante 5 segundos, 60 ° C durante 30 segundos . Una etapa de disociación se realizó para generar una curva de fusión para confirmar la especificidad de la amplificación. β-actina se utilizó como gen de referencia. Los niveles relativos de la expresión génica se representan como referencia? Ct = Ct Ct-gen, y el pliegue del cambio de la expresión génica se calculó por el método 2-ΔΔCt. Los experimentos se repitieron por triplicado. El primer secuencias son como seguidores: trim24 hacia adelante, 5 'CGCCACCCAAGTTGGAGT 3', trim24 inversa, 5 'GCTGGGAACCTCAGTAGTGTCCT 3'; β-actina hacia adelante, 5 'ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC 3', β-actina inversa, 5 'CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG 3'. MMP2 adelante, 5'-TGTGTTCTTTGCAGGGAATGAAT-3 '; MMP2 inversa, 5'-TGTCTTCTTGTTTTTGCTCCAGTTA-3 '; MMP9 adelante, 5'-CCTCTGGAGGTTCGACGTGA-3 '; MMP9 inversa, 5'-TAGGCTTTCTCTCGGTACTGGAA-3 ';
Análisis Western Blot
Las proteínas totales de las líneas celulares se extrajeron en tampón de lisis (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) y se cuantificó usando el Bradford Método. Cincuenta microgramos de proteína se separaron mediante SDS-PAGE (12%). Después de la transferencia, el fluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) se incubaron durante la noche a 4 ° C con los siguientes anticuerpos -TRIM24 (1:1000; Proteintech, Chicago, IL, EE.UU.), p53 (DO- 7, 1:500), RAR (1:500), beta-actina (1:500; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), ciclina A (1:1000), ciclina B (1:1000), ciclina D1 (1:1000), ciclina D2 (1:1000), ciclina D3 (1:1000), ciclina E (1:800), CDK2 (1:1000), CDK4 (1:1000), CDK6 (1:1000) , p-Rb (1:2000), P21 (1:800), P27 (1:800) (señalización celular tecnología, Boston, MA, EE.UU.). Después de la incubación con peroxidasa de acoplamiento de anti-ratón /IgG de conejo (Santa Cruz Biotechnology) a 37 ° C durante 2 horas, las proteínas unidas se visualizaron utilizando ECL (Thermo Fisher Scientific) y se detectaron utilizando Sistemas de bioimagen (UVP Inc., Upland, CA, ESTADOS UNIDOS). Los niveles de proteína relativos se calcularon sobre la base de β-actina como control de carga.
Tratamiento interferente pequeño ARN
on-TargetPlus SmartPool siRNA para trim24 (M-005387-03-0005) y ON -TARGETplus no siRNA dirigidos#1 (D-001810-01-20) fueron adquiridos de Dharmacon. Para las transfecciones, las células se sembraron en una placa de 24 pocillos 24 h antes del experimento. Las células fueron transfectadas con siRNA usando el DharmaFECT 1 (0,20 l /pocillo; ThermoFisher Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de la transfección, el ARNm y los niveles de proteína se evaluaron 48 horas más tarde.
Prueba de Proliferación Celular y la formación de colonias de ensayo
ensayo de proliferación celular se realizó utilizando la solución de Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Gaithersburg, MD) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las células se sembraron a una concentración de 5 x 10
3 células /100 l /pocillo en placas de 96 pocillos de cultivo y se trataron con 10 l /pocillo de solución de Cell Counting Kit-8 durante las últimas 4 horas de la cultura . La densidad óptica de los pocillos se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas. Para el ensayo de formación de colonias, se sembraron células en tres placas de cultivo celular de 6 cm (1.000 por plato para A549 y líneas celulares H1299) y se incubaron durante 12 días. Las placas se lavaron con PBS y se tiñeron con Giemsa. Se contó el número de colonias con más de 50 células.
Análisis del ciclo celular
Las células (500.000) fueron sembradas en 6 cm de placas de cultivo de tejidos. Doce horas más tarde, las células fueron transfectadas con cantidades indicadas de siRNA. Las células se sincronizan después de una privación de suero 20 h y luego los puntos de tiempo tomada a las 24 h después de la aplicación de los medios de 10% de suero para medir los efectos sobre el ciclo celular. Se recogieron las células, se fijaron en paraformaldehído al 1%, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se tiñeron en 5 mg /ml de yoduro de propidio en PBS suplementado con RNasa A (Roche, Indianapolis, IN) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los datos fueron recolectados a través de los sistemas de BD.
Matrigel invasión de ensayo
ensayo de invasión celular se realizó utilizando una cámara de 24 pocillos Transwell con un tamaño de poro de 8 mm (Costar, Cambridge, MA). Los insertos se recubren con 20 l de Matrigel (dilución 1:03, BD Bioscience, San José, CA, EE.UU.). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se tripsinizaron las células y 3 × 10
5 células en 100 l de medio libre de suero fueron transferidos a la cámara de Matrigel superior y se incubaron durante 16 horas. Medio suplementado con 10% FBS solo o que contiene 100 ng /ml (Invitrogen, Carlsbad, Carlsbad, CA) se añadió EGF a la cámara inferior como el quimioatrayente. Después de la incubación, las células no invadidas en la superficie de la membrana superior se eliminaron con una punta de algodón, y las células que pasaron a través del filtro se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con hematoxilina. El número de células invadidas se contó en 10 campos de alta potencia seleccionados al azar en el microscopio. Este experimento se realizó por triplicado.
Análisis Apoptosis
Para la detección de la apoptosis, las células adherentes se recogieron tanto y se resuspendieron en PBS frío para el análisis. Las células se tiñeron con Anexina V-FITC Apoptosis Kit (BD Pharmingen, EE.UU.) para supervisar las células de la apoptosis y yoduro de propidio (PI) para detectar las células muertas. Los datos fueron recolectados a través de los sistemas de BD.
transfección transitoria y Luciferase reportero de ensayo
La actividad de luciferasa de transfección de genes reportero y las células de ensayo en 80 confluentes que crecen en una placas de 24 pocillos fueron co-transfectadas con la luciferasa de luciérnaga reportero de P53 que contiene un promotor TA (pp53-TA-luc, Beyotime Biotechnology, china) (0,2 g) junto con el reportero de luciferasa de Renilla (Promega Co.) (0,02 g) durante 12 h usando un reactivo attractene (QIAGEN) de acuerdo con los protocolos suministrados por los fabricantes.
La actividad de luciferasa se midió en los extractos celulares utilizando una luciferasa reportado kit de doble ensayo de gen (Promega, CA, EE.UU.). La actividad relativa del gen indicador se calcula dividiendo las señales de indicador de luciferasa p53 mediante señales obtenidas reportero de luciferasa de Renilla forma.
Análisis estadístico
SPSS versión 16.0 para Windows fue utilizado para todos los análisis. Se utilizó la prueba de Chi-cuadrado para examinar las posibles correlaciones entre la expresión trim24 y los factores clínico-patológicos. Se utilizó la prueba t de Student para comparar otros datos. valor de p se basa en el análisis estadístico de dos caras, y p. & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativo
Reconocimientos
Los autores desean agradecer al Dr. Qingchang Li, por su excelente asistencia técnica .