Extracto
Antecedentes
La tiorredoxina reductasa selenoenzima 1 tiene un complejo papel en relación con el crecimiento celular. Es inducida como un componente de la respuesta celular a los oxidantes potencialmente mutagénicos, pero también parece proporcionar ventajas de crecimiento para las células transformadas mediante la inhibición de la apoptosis. Además, seleniocisteína deficientes o formas alquilados de tiorredoxina reductasa 1 también han demostrado oxidativo, actividad pro-apoptótica. Por lo tanto, se justifica una mayor comprensión del papel de la tiorredoxina reductasa redox en marcha los procesos de apoptosis.
Metodología
El papel de la tiorredoxina reductasa 1 en células RKO se evaluó mediante la atenuación de la tiorredoxina reductasa endógena 1 de expresión con siRNA y luego o bien la inducción de una tiorredoxina reductasa deficiente en selenio o el tratamiento con desafíos redox distintas incluyendo, peróxido de hidrógeno, un lípido oxidado, 4-hidroxi-2-nonenol, y un óxido nítrico donación de profármaco. tiorredoxina estado redox, la viabilidad celular y la actividad caspasa efectora se midieron.
Conclusiones /Importancia
En las células con atenuada tiorredoxina reductasa endógena 1, se indujo una forma seleniocisteína deficientes integrado de forma estable de la enzima pero no altera ni el estado redox de tiorredoxina o la cinética de crecimiento celular. El lípido oxidado y el donante de óxido nítrico demostraron una mayor citotoxicidad cuando la tiorredoxina reductasa 1 fue derribado; sin embargo, el efecto fue más pronunciado con el profármaco del óxido nítrico. Estos resultados son consistentes con la hipótesis de que la atenuación de la tiorredoxina sistema puede promover la apoptosis de una manera dependiente del óxido nítrico
Visto:. Edes K, Cassidy P, Shami PJ, Moos PJ (2010) JS-K , una citotoxicidad del óxido nítrico profármaco, ha mejorado en células de cáncer de colon con Desmontables de tiorredoxina reductasa 1. PLoS ONE 5 (1): e8786. doi: 10.1371 /journal.pone.0008786
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Septiembre, 2009; Aceptado 30 de diciembre de 2009; Publicado: 20 de enero 2010
Derechos de Autor © 2010 Edes et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto fue apoyado por un Servicio de Salud Pública de subvención CA115616 (PJM). Reconocemos también la utilización de instalaciones centrales apoyados por CA042014 P30 otorgado al Instituto de Cáncer Huntsman. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: Dra. Moos es apoyado por el NIH, pero el diseño y la ejecución es la suya propia. El Dr. Shami es uno de los fundadores de y participa en el capital de JSK Therapeutics, Inc. El Dr. Cassidy y Sra Edes declaran no tener conflictos de intereses potenciales.
Introducción
El sistema tiorredoxina de mamíferos consiste en la reductasa selenoprotein tiorredoxina (TR), tiorredoxina (Trx), y NADPH donante de electrones. El sistema TR-Trx participa en diversas reacciones redox en las células [1], desde el apoyo a la síntesis de ADN [2] para redox dependientes de vías de señalización celular [3] - [6]. Trx y TR pueden facilitar el crecimiento y /o supervivencia de las células malignas como su expresión es elevada en algunos tumores [7], [8]. actividad tiorredoxina reductasa enzimática no se limita a la tiorredoxina, en cambio, muchos sustratos han sido identificados, incluyendo; selenocompounds, ascorbato, lipoato y lípidos oxidados [9] - [11]. Sin embargo, alguna función lípidos oxidados para inhibir la actividad TR1 mediante la reacción con el nucleófilo C-terminal que incluye el residuo Sec [12] - [14]. Residuos
El selenocysteine adyacente (Sec) y cisteína (Cys) en se requiere el C-terminal de los TR mamífero para la actividad de la reductasa cuando Trx es el sustrato; Sin embargo, Sec deficiente puede tener TR1 [15] y [16] actividades biológicas bioquímicas distintas de Sec-TR1 suficiente que pueda ser relevante en el cáncer u otra enfermedad. Sec-deficientes TR1 ha demostrado una actividad pro-apoptótica en los estudios que evalúan el papel de TR1 en interferón y ácido apoptosis inducida por retinoico [17], así como más datos que apoyan reciente que ha demostrado seg deficientes especies TR1 (SecTRAPs designados) son por sí mismos potentes iniciadores de apoptosis en líneas celulares de cáncer humano [16]. La apoptosis en estos casos se planteó la hipótesis de que es mediado por un aumento del estrés oxidativo en las células. Estos ejemplos sugieren que la interrupción de la C-terminal de los resultados TR1 en una proteína de ganancia de función que podría ser un agente pro-apoptótico útil si pudiera ser dirigido a las células malignas.
En este estudio hemos examinado los efectos sobre las células de cáncer de colon de dos escenarios en los que la actividad TR1 canónica (es decir, la capacidad de reducir Trx) se ha mitigado, ya sea por tratamiento siRNA o mutación de los residuos de Cys Sec y C-terminales. Comenzamos por evaluar el estado redox de Trx en células de cáncer de colon RKO donde los niveles endógenos TR1 se atenuaron con siRNA. En estas mismas células deficientes en de tipo salvaje TR1, entonces indujo la expresado un TR1 Sec deficientes y se encontró que esta proteína alterada ni el estado redox Trx ni la cinética de crecimiento celular. Sólo en las células sometidas a estrés oxidativo de tratamiento con diamida Qué encontramos diferencias en las células comprimised-TR1. Esto nos llevó a examinar los efectos de TR1 caída sobre una variedad de factores de estrés oxidativo incluyendo especies reactivas del oxígeno, un lípido y un electrófilo -prodrug óxido nítrico (NO). Los efectos del agotamiento TR1 fueron más pronunciadas en combinación con el último tratamiento.
NO tiene un amplio espectro de efectos fisiológicos, incluyendo los efectos pronunciados en los sistemas nerviosos [18] vascular y, [19]. También es prometedor como un agente farmacológico antineoplásico debido a su citotoxicidad; sin embargo, la respuesta clínica óptima requiere nuevos mecanismos de entrega de la NO al tumor en lugar de la administración sistémica para evitar los efectos adversos vasculares [20].
O
2- (2,4-dinitrofenilo) 1 - [(4-etoxicarbonil) piperazin-1-il] diazen-1-io-1,2-diolato (JS-K) es un profármaco diseñado para liberar NO intracelularmente [21], por lo tanto evitando efectos generalizados sobre la vasculatura. La liberación de NO a partir de JS-K es dependiente sobre el metabolismo de glutatión S-transferasas (GSTs) y esta dependencia puede proporcionar selectividad neoplásica adicional desde GSTs se sobreexpresa frecuentemente en el cáncer [22]. JS-K ha demostrado eficacia antineoplásica en ambas líneas celulares de cáncer humano, así como sistemas de modelos animales [23].
NO puede tener diversos efectos en las células. Funcionando como un oxidante, que puede reaccionar con iones metálicos, o modificar directamente las proteínas sobre residuos de cisteína que forman S-nitrosotioles. Esta modificación puede modular la función de la proteína [24]. La gestión redox celular de nitrosilación cisteína es un área activa de investigación, y el sistema de TR-Trx se ha identificado como un regulador de este fenómeno [25]. En particular, las proteínas apoptóticas han sido identificadas como proteínas diana modificados por nitrosilación [26]. De hecho, la caspasa efectora, caspasa-3, es objetivo de nitrosilación que se modula por los sistemas de Trx mitocondriales [27] citosólico y. Por lo tanto, el NO y el sistema TR-Trx sean parte esencial de los procesos celulares de la muerte celular programada. En el presente trabajo se amplía el estudio de esta interacción para incluir los efectos de la TR1 en la actividad de un agente terapéutico importante nuevo cáncer candidato, JS-K.
Resultados
tiorredoxina reductasa de mamífero sin una Sec fue pensado para tener un mínimo de actividad; Sin embargo, informes recientes sugieren que la tiorredoxina reductasa Sec deficiente podría tener otras actividades redox. Por lo tanto, hemos construido una línea celular inducible donde pudimos expresar un mutante C-terminal de TR1 que era resistente a siRNA desmontables. Se midió la expresión de TR1 mediante transferencia Western y se midió la actividad de TR en base a la reducción de la insulina, así como la reducción del ácido lipoico (Figura 1). El siRNA golpear con eficacia por la TR1 endógeno por ~ 70% y la inducción de la tetraciclina integrado de forma estable del mutante C-terminal fue ~ 75% del nivel endógeno de la TR1 (Figura 1A). Además, la caída resultó en la reducción de ~ 70% de la actividad TR, medido por el ensayo bioquímico de la oxidación de NADPH con Trx como el intermedio y la insulina que sirve en el aceptor final de electrones (Figura 1B). Desde TR1 puede reducir sustratos alternativos a Trx
in vitro
, también se evaluó la capacidad del mutante C-terminal de TR1 para reducir el ácido lipoico en un ensayo basado en células (Figura 1C). Varias enzimas celulares pueden reducir lipoato pero sí se observó una disminución de ~ 40% de reducción de lipoato en las células RKO con endógena TR1 atenuadas por el siRNA y en las células que expresan el mutante C-terminal de TR1.
Las células fueron expuestas a siRNA dirigido contra TR1 para un total de 96 horas, y se indujo un mutante deficiente Sec-C-terminal TR1 para las últimas 24 horas. A) El análisis por inmunotransferencia de la expresión de proteínas TR1 después de los tratamientos de siRNA y la inducción del mutante TR1 Sec-deficiente. B) actividad bioquímica TR medida en los lisados celulares mediante el control de la oxidación de NADPH en un ensayo que depende de Trx y utiliza la insulina es el aceptor final de electrones. La primera barra de la izquierda representa la actividad del control (si-Scramble) sin Trx añade a la mezcla de reacción, lo que indica la señal de fondo. C) la actividad TR basado en células, medida por la reducción de ácido lipoico en un ensayo colorimétrico usando el reactivo de Ellman. La primera barra de la izquierda representa la actividad del control (si-Scramble) sin ácido lipoico añadido a la mezcla de reacción. Los lisados de células con TR1 derribados muestran reducciones significativas en la actividad en comparación con el control (si-Scramble) en ambos ensayos (***, p & lt; 0,001).
Desde Trx es un sustrato primario de TR1 y desde otro Sec deficientes TR1 han demostrado el estrés oxidativo, que mide el estado redox Trx para determinar si el mutante deficiente Sec-C-terminal TR1 alterado el estado redox de Trx. Evaluación del estado redox Trx se realizó a través de alquilación con ácido yodoacético, la reducción de Cys oxidado con DTT, y la alquilación a continuación, yodoacetamida, como se ha descrito [28]. No se observaron cambios en el estado redox Trx entre las células con endógeno TR1, las células con TR1 derribado, y células con endógeno TR1 derribado más inducción del mutante Sec deficientes en C-terminal TR1 (ejemplo conjunto de datos en la Figura 2 y resumen de múltiples experimentos de la Tabla 1). Si las células se estimularon con diamida 1 mM, no se observaron cambios en el estado redox de Trx, y una diferencia entre las células si-TR1 tratadas y la si-Scramble fue evidente lo que sugiere que el ensayo detecta alteraciones en el estado redox después de un desafío oxidativo .
en las células sin estimulación (a la izquierda tres carriles), Trx es principalmente en el estado reducido, incluso con TR1 derribado y el mutante C-terminal TR1 expresó. Con 1 mM de estimulación diamida durante 30 min (a la derecha tres carriles), las células con endógena TR1 demuestran más reducidas que las células con Trx endógena TR1 derribado con siRNA.
Desde Sec deficientes TR1 ha demostrado una mayor citotoxicidad en otros sistemas y por lo tanto una posibilidad era que las células con el inducible Sec deficientes TR1 no están proliferando a una tasa similar como células con TR1 endógeno. Se midió la tasa de crecimiento celular después de siRNA desmontables y la inducción de la expresión de la Sec deficiente TR1 contando los números de población celular (Figura 3). El tiempo de duplicación celular para las tres condiciones fue de ~ 24 horas, después de un período de retraso inicial. Por lo tanto, este mutante Sec deficientes TR1 no parece alterar la cinética de crecimiento de las células RKO como no hay diferencias significativas en las pendientes de las curvas de crecimiento se mide (0.35 ± 0.004 células /hr para si-Scramble, 0.36 ± 0.006 células /hr para si-TR1, y 0,33 ± 0.008 células /hr para si-TR1 más inducción del mutante C-terminal TR1).
a revueltos siRNA se utilizó como control para medir la tasa de crecimiento basal (llenos cuadrado) TR1 fue derribado por siRNA (círculo relleno) y con la inducción de la Sec-deficientes, mutante C-terminal de TR1 (triángulo relleno). No se observaron diferencias significativas en las tasas de crecimiento como las líneas continuas utilizadas para calcular las tasas de crecimiento de estas condiciones son casi paralelos.
Dado que la expresión inducida de la Sec-deficiente construcción TR1 mutante C-terminal hizo no provoca una alteración en el estado redox de Trx, se evaluó la respuesta citotóxica de las células RKO con TR1 endógena, así como células en el que el TR1 se atenuó con siRNA de oxígeno reactivo y nitrógeno en forma de H
2O
2 , el lípido oxidado 4-HNE, o el donante de NO JS-K (Figura 4). Viabilidad tras H
2O
2 exposición no fue diferente (Figura 4A); la exposición de 4-HNE demostró una modesta, ~ 2 veces el aumento de la sensibilidad en las células con TR1 derribado con un LC
50 diferencia de 10,6 ± 0,7 M en las células con TR1 derribado en comparación con 24 ± 3,4 M en las células con TR1 endógeno (Figura 4B); el donante no, JS-K, demostró ~ 6 veces mayor sensibilidad en las células con TR1 atenuadas de siRNA con un LC
50 diferencia de 3,1 ± 0,5 M en las células con TR1 derribado en comparación con 19 ± 2 M en las células con endógena TR1, tal como se mide con un ensayo MTT (Figura 4C).
las células con endógena TR1 (si-Scramble, cuadrado relleno), y células con TR1 derribado por siRNA (si-TR1, círculo relleno) se compararon a dosis equivalentes de los moduladores redox. A) células RKO se trataron con concentraciones crecientes de H
2O
2 y la viabilidad se midió después de una exposición de 24 horas. No se observaron diferencias significativas. B) células RKO se trataron con concentraciones crecientes de 4-HNE y se midió la viabilidad después de una exposición de 24 horas. Las células si-TR1 muestran ~ 2 veces mayor sensibilidad a la 4-HNE. células C) RKO se trataron con concentraciones crecientes de JS-K y se midió la viabilidad después de una exposición de 24 horas. Las células si-TR1 muestran ~ 6 veces mayor sensibilidad a la JS-K.
Dado que el donador de NO promueve una diferencia más prominente en la viabilidad entre las células RKO con endógena TR1 en comparación con las células con TR1 derribado, la evaluación adicional de estado redox celular se realizaron para evaluar el mecanismo de la citotoxicidad mejorada mediada por NO. En primer lugar, en base a las diferencias significativas en la viabilidad celular observada en el ensayo de MTT, el estado redox Trx se evaluó después de 5 micras JS-K incubación. El JS-K tratada desmontables células TR1 muestran una distribución más oxidada de estados redox Trx siguiente 90 min de incubación con el profármaco NO (Tabla 2). A continuación, se evaluó una evaluación más generalizada del estado oxidativo de las células después de 5 micras tratamiento JS-K durante 24 horas mediante la medición de la relación de la reducción de GSH a los niveles totales de GSH. No se observaron diferencias significativas en la reducción de GSH al total de GSH se observaron (Figura 5). Estos datos sugieren que no se observó un cambio global en el estado redox pero que seleccionan proteínas podría ser dirigido.
mediciones de GSH se hicieron después del tratamiento con 5 micras JS-K durante 24 hrs., Y la relación de la reducción del GSH a la GSH total se mide. No se observaron diferencias significativas entre los grupos de tratamiento.
Para determinar el mecanismo detrás de los cambios en la viabilidad celular como se determina mediante el ensayo de MTT, análisis de inmunotransferencia de la caspasa 3 y la proteína de reparación del ADN poli ADP ribosa polimerasa (PARP) se evaluaron (Figura 6). Exfoliados caspasa 3 es consistente con el inicio de la apoptosis y la cantidad de la caspasa 3 escisión parecía ser más extenso cuando TR1 fue derribado. PARP escindido también se observó en estos experimentos de una manera dependiente de la dosis.
células RKO tratadas con vehículo, 1,5, o 5 micras JS-K durante 24 hrs. La proteína se separó por SDS-PAGE y se detecta con un análisis de inmunotransferencia. Un aumento dependiente de la dosis en PARP escindida y la caspasa 3 (CASP3) se observó con más material escindido en el derribo TR1. GAPDH se evaluó como control de carga
se observó evidencia de la iniciación de la apoptosis en ambos 1,5 y 5 M JS-K en el análisis de inmunotransferencia.; Por lo tanto, la viabilidad celular y la citotoxicidad donde re-evaluado después de 1,5 M JS-K de incubación (donde las células todavía aparecen & gt; 75% viables, figura 4) en base a la actividad de proteasa utilizando el ensayo de MultiTox. Este ensayos parecían ser más sensible que el ensayo de MTT, ya que incluso a esta baja dosis, JS-K resultó en la citotoxicidad y /o pérdida de viabilidad en los desmontables células TR1 (~ 45% viable) en comparación con las células con niveles endógenos significativa de TR1 (~68% viable, la Figura 7A y 7B). A continuación se midió la relativa actividad de la caspasa-3/7 y consistente con los datos de citotoxicidad, hubo un aumento significativo de la actividad de la caspasa en las células con TR1 derribado (Figura 7C). En experimentos separados, el inhibidor de caspasa competitivo de amplio espectro, Z-Asp-CH
2-DCB, se incluyó durante la incubación con JS-K confirmando la actividad enzimática observada previamente era la actividad de caspasa-dependiente.
células RKO tratadas con 1,5 mu M JS-K durante 24 hrs. Se evaluó la viabilidad A), B) la citotoxicidad y la actividad de la caspasa-3/7 C). En experimentos separados, las células se incubaron con Z-Asp-CH
2-DCB, un amplio espectro, inhibidor de la caspasa competitiva, para determinar que el ensayo de la caspasa fue de hecho demostrando actividad efectora de la caspasa (C). células RKO con TR1 derribado demuestran significativamente mayores pérdidas en la viabilidad, el aumento de la citotoxicidad, y el aumento de la caspasa 3-/7 actividad después del tratamiento JS-K de células RKO con TR1 endógeno (**, p & lt; 0,01; ***, p & lt; 0,001; †††, p. & lt; 0,001) guía empresas
Discusión
Si bien los niveles selenoprotein son generalmente dependiente de selenio y la deficiencia de selenio parece resultar en un mayor riesgo de mortalidad por cáncer [29] , el sistema TR1-Trx puede ser inusual entre selenoenzimas en su capacidad para promover el cáncer [8], [30]. De hecho, Trx es frecuentemente sobreexpresado en muchos tumores, puede tener propiedades anti-apoptóticas, y puede contribuir a algunas formas de resistencia a la terapia [7], [31] - [34]. Desde esta perspectiva, la inhibición de TR1 es un excelente objetivo para inhibir la reducción de tiorredoxina en presencia de estrés oxidativo adicional. Además, varios agentes terapéuticos comúnmente utilizados, como cisplatino, ciclofosfamida, doxorubicina y parecen apuntar a la tiorredoxina reductasa, así como DNA [35] - [39]. Nuestros resultados sugieren que la atenuación de TR1 es insuficiente para alterar el estado de crecimiento de las células, pero que el estrés redox apropiado siguiente atenuación de TR1 pueden ser el medio más eficaz de alcanzar una respuesta citotóxica.
La actividad antiapoptótica de Trx tiene sido emplazados lo que justifica la focalización del sistema TR-Trx en el cáncer humano [40], [41]. La reciente observación de que el sistema TR-Trx modula la actividad de la caspasa-3 de una manera nitrosilación dependiente de [27] sugiere un papel prominente para el sistema TR-Trx en la actividad apoptótica mediada por NO. En este trabajo, también se observa que el profármaco NO, JS-K, aumenta la apoptosis cuando TR1 es derribado con siRNA (Figuras 4 y 6). Este mecanismo es consistente con el aumento de la actividad anterior mecanicista que demuestra los datos de la caspasa en células de leucemia mielógena aguda [42]. Además, NO donador de aspirina demostró actividad sinérgica cuando se combina con compuestos que contienen oro que se cree que orientar principalmente el sistema TR-Trx [43].
El papel de TR1 en la apoptosis ha sido objeto de investigación desde que fue identificado como un gen "GRIM" (es decir, genes asociados con la mortalidad inducida por retinoides-IFN, severo 12) en una pantalla de genes relacionados con la apoptosis inducida por los retinoides IFN [17]. Más recientemente, se ha demostrado que la proteína TR1 sin un residuo Sec funcional debido a alquilación o truncamiento, cuando se introducen en las células utilizando
BioPORTER
, la apoptosis inducida por [16], [44]. Sin embargo, los mecanismos de la apoptosis mediada por TR TR1 SecTRAPs siguen siendo desconocidos. La TR1 mutante se utilizó, con el extremo C-terminal Gly-Ser-Ser-Gly, no era una tiorredoxina reductasa funcional, medida por la reducción de la oxidación /insulina NADPH, así como la reducción del ácido lipoico (Figura 1); sin embargo, no parece que también ha funcionado como un iniciador de la apoptosis SecTRAP como se describe por Arner et al [16]. Al igual que en un informe anterior [45], no hemos podido identificar alteraciones basales en Trx o el estado redox celular cuando TR1 fue derribado con siRNA (Figura 2, Tabla 1), pero hizo observar alteración del estado redox Trx después del tratamiento JS-K ( Tabla 2). Además, la expresión de este mutante Sec deficientes TR1 no alteró el estado oxidativo de Trx. Por lo tanto, parece que no todas las proteínas TR Sec deficientes promueven el estrés oxidativo y la apoptosis.
Orientación TR1 para la terapia del cáncer puede no ser, sin efectos adversos no deseables si no se dirige al tumor. Por ejemplo, el supresor de tumor, p53, es un importante regulador del crecimiento celular y la apoptosis, y TR1 mejora la función de p53, probablemente contribuyendo equivalentes de reducción a través de Trx al regulador redox nuclear Ref-1 [12] [13], [46, ], [47]. Varios agentes terapéuticos comúnmente utilizados, como el cisplatino, ciclofosfamida y doxorrubicina parecen apuntar TR1, así como DNA [35] - [39], pero tal vez, una causa de algunos de los efectos adversos observados con estas terapias comunes, puede ser el " fuera del objetivo "inhibición de la TR1. Otro compuesto modulador redox que se ha evaluado en ensayos clínicos sobre el cáncer, motexafin gadolinio, se pensó para dirigirse específicamente a TR1 [7]. Sin embargo, motexafin gadolinio parece ser un sustrato para TR1 y genera especies reactivas del oxígeno a través de esta interacción, además de ser un inhibidor de la ribonucleótido reductasa [48]. Si la actividad clínica de este compuesto es realmente debido a sus interacciones con TR1, todavía no está claro que los tumores deben dirigirse ya que este compuesto ha demostrado resultados mixtos en ensayos clínicos hasta la fecha [49] - [51], pero parece tener promesa particular como un sensibilizador a la radiación [52], [53].
a pesar de las posibles complicaciones de la orientación TR1 en los cánceres, los resultados en este documento sugieren que la combinación de fármacos se acerca, como el donador de NO, JS-K, puede haber más eficaz si se combina con agentes que se dirigen TR1.
Materiales y Métodos
Materiales
Avanzado DMEM, Glutamax, 5,5 ', 6,6'-tetracloro-1, 1 ', 3,3'-tetraethylbenzimidazolyl-carbocianina yoduro (JC-1, MitoProbe JC-1 Kit de ensayo), 3- (4,5-dimethylthiaxol-2-il) -2,5-diphenyltretraxolium (MTT), Hank de solución salina equilibrada con Ca y Mg (HBSS), Tris-glicina 8% de geles y albúmina de suero bovino se adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA). El suero bovino fetal se adquirió de Hyclone (Logan, UT). La línea celular RKO se adquirió de American Tissue Type Culture Collection (Manassas, VA). Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra la tiorredoxina reductasa (B-2, sc-28321, lote#J1304); Los anticuerpos policlonales dirigidos contra la tiorredoxina (FL-105, SC-20146, lote#A1907), y GAPDH (FL-335, SC-25778); anticuerpos anti-ratón y anti-conejo de burro policlonales conjugados con peroxidasa de rábano picante se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). anticuerpos policlonales adicionales dirigidos contra la caspasa 3 (9661), se escindió de la caspasa 3 (9662), y PARP (9532) se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). patrón de albúmina de suero bovino y proteína Coomassie Plus reactivo eran de Pierce Biotechnology (Rockford, IL). tabletas proteasa inhibidor de cóctel (Complete®) se adquirieron de Roche (Indianápolis, IN). membrana de PVDF se adquirió de Millipore (Burlington, MA). El inhibidor de la caspasa, Z-Asp-CH
2-DCB, era de Peptides International (Louisville, KY). reactivos de quimioluminiscencia de iluminación occidentales eran de PerkinElmer Life Sciences (Boston, MA). JS-K se sintetizó como se describe anteriormente [54]. Dimetilsulfóxido (DMSO) y tampones y sales comunes fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
fueron utilizados para el cultivo celular
células de cáncer de colon RKO como una línea celular de colon y representativa se mantuvieron en DMEM suplementado con avanzada 1% Glutamax y suero fetal bovino al 2%. Anteriormente, hemos descrito la mutagénesis dirigida al sitio de la C-terminal de TR1 de Gly-Cys-Sec-Gly a Gly-Ser-Ser-Gly además de una mutación silenciosa en el sitio identidad siRNA para hacer resistente a siRNA este constructo dirigido a la TR1 endógeno. Subcloned este TR1 mutado construir en pcDNA5 /FRT /A y luego se inserta en las células RKO con pcDNA6 integrado de forma estable /TR y pFRT /
lac
Zeo, haciendo una línea de células TR1 tetraciclina mutante inducible. Estas mutaciones a TR1, así como el siRNA utilizados para modular endógeno TR1 fueron descritas anteriormente [13]. Experimentalmente, se sembraron las células a 2-3 x 10
5 células bien en la placa 6 /pocillo y se transfectaron con ARNsi dirigido a TR1 (si-TR1) o de control generada por la secuencia de codificación si-TR1 (si-Scramble) durante 72 horas. Luego, las células fueron tratadas o estimuladas con tetraciclina durante 24 horas como se indica.
El análisis por inmunotransferencia
Las células en placas de 6 pocillos se colocaron en hielo. El medio se aspiró y luego las células se lavaron con 1 ml de frío 1 × PBS y PBS el aspirado. Los lisados celulares se recogieron como se ha descrito anteriormente [13]. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando Coomassie Plus Protein reactivo (Pierce). La absorbancia a 595 nm se midió utilizando un Perkin-Elmer Victor
lector de placas de 3V. Diez a 15 g de proteína fueron separadas en cualquiera de los geles 8% de Tris-glicina (por TR1) o geles de 10% de urea nativo (por Trx), transferidos a una membrana de PVDF, se bloquearon con leche en polvo 10% no grasa, se incubaron con el anticuerpo primario (1:200 para TR, 1:250 para Trx, 1:1000 tanto para la caspasa 3 y caspasa 3 escindida, PARP 1:1000 para, y 1:500 para GAPDH) durante la noche a 4 ° C, se lavó 3 ×, se incubaron con anticuerpo secundario (1:5000) durante 45 minutos a 22 ° C, se lavó 3 ×, se incubaron con reactivos de quimioluminiscencia, y se expuso a una película de rayos x.
ensayos de actividad de la tiorredoxina reductasa
celular TrxR1 la actividad se midió como se ha descrito anteriormente [13]. Además, se midió la reducción del ácido lipoico similar a un ensayo descrito previamente [55]. Brevemente, las células se sembraron y se trataron como se describe. A continuación, las células se tripsinizaron, se lavaron con PBS, y se resuspendieron en una solución de 1 ml que contiene glucosa 5 mM en PBS, con o sin ácido lipoico 1 mM y DTNB 0,2 mM con agitación suave a 37 ° C durante 15 min. Las células se centrifugaron y el sobrenadante de la muestra se diluyó 1:01 con agua y se midió la absorbancia a 412 nm. El control negativo era medio sin células. El sedimento celular se lavó con PBS, las células se lisaron en tampón de lisis y la proteína midió usando el ensayo de Bradford. El lipoato reducida se normalizó por el contenido de proteína celular.
se realizó estado redox de Trx
El estado redox de Trx como se describe [28]. Brevemente, las células se lisaron en 8 M urea tamponada con Tris a pH 8,9 que contiene 30 mM de ácido yodoacético, sonicadas, y se incubaron durante 15 min a 37 ° C. La proteína se precipitó con 10 volúmenes de hielo frío acetona-HCl 1 N (98:2, vol /vol), se centrifugó a 11.000 × g durante 5 min a 4 ° C, se lavó con acetona-HCl frío, se resuspendió en 95 l de urea tamponada que contenía DTT 35 mM, se incubaron durante 30 min a 37 ° C, 7,5 l de 200 mM yodoacetamida fue añadir a cada muestra, y se incubaron durante 15 min a 37 ° C. La concentración de proteína se estimó utilizando el reactivo de proteína Coomassie Plus.
MTT ensayo
La viabilidad celular se determinó utilizando un MTT como se describe anteriormente [56], que se basa en la reducción de sal de tetrazolio por NADH en células viables ( Berridge
et al.
, 2005).
El glutatión cuantificación
El glutatión reducido (GSH) y GSH total de los reactivos se midieron utilizando GSH-Glo (Promega). Aproximadamente 2,5 × 10
3 células que se pre-incubaron con siRNA dirigido a TR1 se sembraron en costados blancos placas de 384 pocillos, se dejaron adherir, y luego tratados con 0 o 5 micras JS-K durante 24 hrs. El medio se eliminó por centrifugación, la reducción de GSH se midió directamente de acuerdo con las instrucciones de fabricación, y el GSH total se midió mediante la incubación de las células con TCEP 1 mM para reducir oxidado GSH. Este ensayo es un ensayo de transferasa dependiente de glutatión-S que utiliza GSH para generar luciferina como sustrato para la luciferasa para generar luz. La luminiscencia se midió usando un Perkin-Elmer Victor
lector de placas de 3V.
MultiTox ensayo
Medición de la viabilidad y la citotoxicidad fueron evaluados por la actividad de la proteasa diferenciales utilizando el Ensayo Multiplex MultiTox-Fluor (Promega) . Este ensayo utiliza un sustrato GF-AFC que es permeable a las células para evaluar las células viables, y un sustrato de bis-AAF-R110 que no es permeable a las células para evaluar la actividad proteasa de las células muertas. La fluorescencia de estos sustratos se midieron usando un Perkin-Elmer Victor
lector de placas de 3V; el sustrato viabilidad GF-AFC se midió a 405 nm de excitación, 475 nm de emisión; y el sustrato citotoxicidad bis-AAF-R110 se midió a 485 nm de excitación, 535 nm de emisión.
actividad caspasa ensayo
actividad de la caspasa efectora se midió utilizando la caspasa-GLO 3/7 Ensayo ( Promega) según las instrucciones del fabricante. Este es un ensayo en el que un sustrato peptídico DEVD es escindida por las caspasas activas para liberar aminoluciferin como un sustrato para la luciferasa para producir luz. La luminiscencia se midió utilizando un espectrofotómetro Perkin-Elmer Victor
lector de placas de 3V.
El análisis estadístico
1-way ANOVA se utilizó para determinar la significación estadística entre las muestras (GraphPad INSTAT versión 3.06). comparaciones múltiples de Bonferroni pruebas post hoc se utilizó para establecer la significación entre los grupos de tratamiento con p & lt; 0,05 consideró significativo
.