Extracto
La hipoxia se produce en una amplia variedad de condiciones fisiológicas y patológicas, incluyendo la tumorigénesis. Las células tumorales tienen que adaptarse a la hipoxia mediante la alteración de su expresión génica y la síntesis de proteínas. Aquí, hemos demostrado que la hipoxia inhibe la traducción a través de la activación de PERK e inactivación de mTOR en las células HCT116 de cáncer de colon humano. hipoxia prolongada (1% O
2, 16 h) inhibe drásticamente la traducción general en las células HCT116, sin embargo, los ARNm seleccionado permanecerán traduce eficazmente en virtud de tal condición. Utilizando el análisis de microarrays de mRNAs polysome- asociada, hemos identificado un gran número de genes regulados por hipoxia a nivel de traducción. ARNm de manera eficiente traducidos durante la hipoxia fueron validados por polisomas perfiles y cuantitativa en tiempo real RT-PCR. Pathway análisis enriquecimiento mostró que muchos de los genes regulados están involucrados en lisosoma, el metabolismo de lípidos y glicano, la presentación de antígenos, la adhesión celular, y la remodelación de la matriz extracelular y el citoesqueleto. La mayoría de las reguladas por los genes están involucrados en la apoptosis, la proteólisis mediada por ubiquitina, y la fosforilación oxidativa. Investigaciones posteriores mostraron que la hipoxia induce la autofagia lisosomal y la disfunción mitocondrial a través de la regulación de traducción en las células HCT116. La abundancia de varios factores de traducción y de la actividad de mTOR quinasa están implicados en la autofagia mitocondrial inducida por hipoxia en las células HCT116. Nuestros estudios ponen de relieve la importancia de la regulación de traducción para la adaptación de las células tumorales a la hipoxia
Visto:. Lai MC, Chang CM, Sun HS (2016) La hipoxia induce la autofagia través traslacional sobre regulación de lisosomales proteínas en células de cáncer de colon humano . PLoS ONE 11 (4): e0153627. doi: 10.1371 /journal.pone.0153627
Editor: Vladimir Trajkovic, Escuela de Medicina de la Universidad de Belgrado, Serbia
Recibido: 2 de noviembre de 2015; Aceptado: 2 Abril de 2016; Publicado: 14 de abril 2016
Derechos de Autor © 2016 Lai et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de Ministerio de Ciencia y Tecnología, Taiwán (NSC100-2320-B-006-021-MY3 al MCL y NSC101- 2627-B-006-005 al HSS) y Chang Gung Memorial hospital, Taiwán (CMRPD3E0012). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cánceres más comunes en los seres humanos. Cada año, más de 1 millón de pacientes son diagnosticados con CRC en el mundo. La incidencia de CCR ha aumentado constantemente en los últimos 20 años [1]. Los estudios de CRC han proporcionado información valiosa sobre el proceso genético de varias etapas de la carcinogénesis [2, 3]. La mayoría de CRC se desencadena por mutaciones en la poliposis coli adenomatosa (
APC
) de genes [4], que induce la formación de adenoma temprano. El desarrollo del cáncer de colon se promueve aún más por una serie de mutaciones genéticas hereditarias, como
KRAS
,
SMAD4
, y
TP53
, que permiten el crecimiento y la progresión de adenoma carcinoma. Una mejor comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión de CRC puede facilitar el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer. Durante la última década, varias nuevas dianas moleculares están siendo investigados actualmente para el tratamiento de CCR [5].
Debido a la rápida proliferación y la angiogénesis aberrante, tumores contienen zonas con distintos grados de hipoxia [6]. Las células tumorales tienen que adaptarse al estrés hipóxico mediante la alteración de su expresión génica y la síntesis de proteínas [7]. Estas alteraciones incluyen el metabolismo energético, la angiogénesis, la migración celular, la invasión tumoral y la metástasis, la regulación del ciclo celular, la respuesta inflamatoria, y la regulación del pH [8-10]. La hipoxia tumoral se cree que desempeñan un papel clave en la progresión tumoral y la malignidad. La presencia de células hipóxicas en tumores sólidos se asocia con un mal pronóstico en muchos tipos de cáncer [6]. Estudios anteriores han demostrado que las células tumorales hipóxicas son más resistentes a la radioterapia [11, 12] y muchos agentes quimioterapéuticos utilizados comúnmente [13]. Por lo tanto, vale la pena investigar la regulación de la expresión génica en las células cancerosas humanas en condiciones de hipoxia
.
En respuesta a la hipoxia, las células rápidamente aumentan el nivel de factor de inducible por hipoxia 1 (HIF-1) [14, 15], un heterodímero compuesto por una subunidad HIF-1α sensible al oxígeno y una subunidad HIF-1β se expresa constitutivamente. HIF-1 regula la homeostasis de oxígeno durante la hipoxia por la orientación transcriptionally más de 100 genes, que contienen elementos de respuesta a hipoxia (HREs) dentro de sus promotores [16, 17]. Además de la transcripción, la traducción es considerado como un contribuyente importante a la expresión del gen regulado por la hipoxia [18, 19]. etiquetado estudios metabólicos mostraron que la hipoxia inhibe la traducción global en muchas diversas líneas de células [20-23]. Traducción general se inhibe de manera significativa por la anoxia aguda (& lt; 0,02% de O
2) o hipoxia prolongada (≦ 2% de O
2, & gt; 16 h) [21, 22, 24-26]. Se ha informado de que la diana de la rapamicina en mamíferos (mTOR) y el retículo endoplásmico residente quinasa (PERK) desempeñan un papel clave en la regulación de traducción durante la hipoxia [26-28]. Hipoxia inhibe la actividad quinasa de mTOR y conduce a la desfosforilación de proteínas de unión a 4E-traducción factor de iniciación (4E-BPS). Desfosforilación de 4E-BPs aumenta su afinidad de unión al factor de iniciación de la traducción eIF4E y por lo tanto suprime la traducción dependiente de la cubierta mediante la interrupción de la asociación de eIF4E con eIF4G. Por otro lado, la hipoxia induce la respuesta de la proteína desplegada (UPR), que se produce como consecuencia del estrés retículo endoplasmático (ER), y conduce a la activación de PERK [21, 24, 27]. PERK activada fosforila la traducción eucariótica factor de iniciación 2 subunidad α (eIF2α) y por lo tanto inhibe la iniciación de la traducción mediante la prevención de la formación de la eIF2-GTP-tRNA (i) Met ternario complejo [29].
Aunque traducción general es en gran parte inhibido durante la hipoxia, mRNAs seleccionados permanecen traducidos eficientemente bajo tal condición. Traducción de genes sensible a la hipoxia requiere mecanismos alternativos, como sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) [30, 31] y el marco de lectura abierto aguas arriba (uORF) [32]. IRES es un elemento estructural de ARN complejo que inicia la traducción mediante la contratación directamente ribosomas para encontrar el codón de inicio en un ARNm. Se cree que la hipoxia reprime la tapa que dependen pero no iniciación de la traducción IRES mediada [29]. genes sensible a la hipoxia HIF-1α y VEGFA se han demostrado para mantener la traducción a través IRES durante la hipoxia [33, 34]. Sin embargo, el mecanismo de regulación de traducción durante la hipoxia todavía no se entiende completamente, y puede variar dependiendo de los tipos de células y condiciones de hipoxia.
autofagia es un proceso biológico celular que degrada las proteínas y orgánulos para mantener innecesarios o disfuncionales homeostasis de nutrientes y de energía durante condiciones de estrés [35]. Se ha informado de que la hipoxia induce la autofagia de una manera HIF-1 dependiente de [36, 37]. Sin embargo, la regulación de traducción también juega un papel importante en la autofagia inducida por hipoxia. En este estudio, hemos utilizado polisomas perfiles acoplado a toda matriz de la expresión del genoma humano para identificar genes candidatos cuya traducción está regulado por la hipoxia en las células HCT116 de cáncer de colon humano. anotación funcional de los genes candidato indica que la hipoxia regula la traducción de una gran cantidad de genes implicados en el lisosoma y diferentes vías metabólicas. Ofrecemos pruebas de que la hipoxia induce la autofagia a través de traslación sobre regulación de las proteínas lisosomales en las células HCT116. Nuestros estudios hacen hincapié en la importancia de la regulación de traducción para la adaptación de las células tumorales a la hipoxia.
Materiales y Métodos
Cultivo celular y tratamiento hipóxico
células HCT116 (ATCC
® CCL247
™) fueron cultivadas en medio MEM suplementado con suero bovino fetal al 10% a 37 ° C en 5% de CO
2 incubadora. Para hipóxico tratamiento (1% O
2), las células se transfirieron a una cámara de hipoxia especialmente diseñada (NexBiOxy Inc., Hsinchu, Taiwan), que se lavó abundantemente con 95% N
2 y 5% de CO
2 a 37 ° C
plásmidos y transfección
Los plásmidos que expresan la bandera de etiquetado mTOR tipo salvaje o mutantes constitutivamente activos (L1460P & amp; E2419K). fueron adquiridos de Addgene (Cambridge, MA). Transfección de células se realizó usando el reactivo de transfección Lipofectamine
® 2000 (Thermo Fisher Scientific), esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
RNAi mediada desmontables
Todos los plásmidos requeridos para RNAi caída mediada fueron proporcionados por el Fondo Nacional de ARNi Core (Academia Sinica, Taiwán). Los vectores de dos pLKO.1-shRNA utilizan para desmontables PSAP y LAMP2 fueron los siguientes: TRCN0000217974 (shPSAP), y TRCN0000029263 (shLAMP2). El reactivo de transfección Lipofectamine
® 2000 (Thermo Fisher Scientific) se utiliza para transferir ADN de plásmido en células HCT116. Las células se recogieron 3 días después de la transfección para su análisis.
La sacarosa gradiente de sedimentación y polisomas se recogieron perfiles
Las células en PBS frío que contenía 100 mg /ml de cicloheximida. Todos los pasos posteriores se realizaron a 4 ° C. Los sedimentos celulares se resuspendieron en RSB-150 (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), MgCl 3 mM
2, y NaCl 150 mM) que contiene 100 mg /ml de cicloheximida, 40 mg /ml de digitonina (Calbiochem), 20 U /ml RNasin (Promega) y 1X de cóctel inhibidor de la proteasa (Thermo Fisher Scientific). Después de la incubación en hielo durante 5 min, las células se rompieron mediante el paso a través de una aguja de calibre 26 cinco veces. extractos citoplasmáticos se recogieron por centrifugación a 3000 xg durante 2 min, y aclararse mediante más centrifugación a 11.000 xg durante 15 min. Las muestras se cargaron en un gradiente lineal de sacarosa 15 a 40% y se centrifugaron a 38.000 rpm durante 3 h en un rotor Beckman SW41. Después de la centrifugación, el ARN total se extrajo de cada fracción utilizando extracción con fenol /cloroformo en presencia de 1% SDS y 0,25 M NaCl, seguido de precipitación con etanol. Para polisomas análisis del perfil, los gradientes se monitorizaron a 254 nm usando un sistema de fraccionamiento de ISCO (Lincoln, NE).
Immunoblotting
Las proteínas se transfirieron a una membrana de transferencia de PVDF (PerkinElmer). manchas de proteínas se bloquearon con 3% de leche descremada en tampón TBST (100 mM Tris-HCl (pH 7,6), NaCl 150 mM, y 0,05% de Tween 20) a TA durante 1 h. Los anticuerpos primarios de conejo incluido anti-fosfo-eIF2α (Ser51) (1: 1000 dilución; Cell Signaling), ratón anti-eIF2α (0,4 g /ml; Santa Cruz Biotechnology), de conejo anti-fosfo-4E-BP1 (Thr37 /46 ) (1: 1000 dilución; Cell Signaling), ratón-4E-BP1 contra (0,4 g /ml; Santa Cruz Biotechnology), ratón anti-β-actina (1: 2500 dilución; Sigma-Aldrich), ratón anti-HIF- 1 alfa (0,2 g /ml; BD Transduction Laboratories), de cabra anti-Glut1 (1 mg /ml; Santa Cruz Biotechnology), de conejo anti-VEGF (0,4 g /ml; Santa Cruz Biotechnology), de conejo anti-LC3B (1: 1000 dilución; Cell Signaling), de conejo anti-p62 (1: 2000 dilución; MBL), de conejo anti-α-tubulina (1: 2000 dilución; Cell Signaling), de conejo anti-GNS (dilución 1: 200; GeneTex), anti conejo -PSAP (dilución 1: 1000; GeneTex), ratón anti-TPP1 (1 mg /ml; Abcam), ratón anti-ATPB (0,5 mg /ml; Abcam), de conejo anti-LAMP2 (dilución 1: 1000; GeneTex), de conejo anti-eIF4E (1 g /ml; Abcam), y de conejo anti-eIF4A1 (1 mg /ml; Abcam). Las transferencias se incubaron con anticuerpos primarios en tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 2 h, seguido de incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP a temperatura ambiente durante 2 h. La detección se realizó utilizando Immobilon occidental quimioluminiscente de HRP Sustrato (Millipore) para la exposición de la película de rayos X.
Análisis de microarrays
Para el análisis de microarrays, ARN aislado fue limpiado con el kit RNeasy Mini (Qiagen) . Aproximadamente 6 g de ARN total se transcribió de forma inversa en ADNc usando un cebador oligo d (T) que contiene la secuencia promotora de ARN polimerasa de T7 en el extremo 3 '. Marcado con biotina RNA complementario (cRNA) fue producido por
in vitro
transcripción en seguida de hidrólisis metal inducida a 94 ° C. Posteriormente, fragmentación de cRNA se hibridó a Affymetrix Human Genome U133 Plus 2,0 Array a 45 ° C durante 16 h. El lavado posterior y la tinción se realizaron con un neumático Estación-450 y GeneChips se escanean con Affymetrix GeneChip escáner 7G. microarrays de datos en bruto fueron analizados utilizando el software GeneSpring GX 10 (Silicon Genética).
RT-PCR cuantitativa y PCR en tiempo real
RT-PCR se utilizó para detectar el nivel de expresión del ARNm. ARN extraído fue inverso-transcrito en cDNA utilizando la alta capacidad de cDNA de transcripción inversa Kits (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc resultante se sometió a PCR convencional o análisis de PCR cuantitativa en tiempo real. PCR convencional se realizó utilizando ADN polimerasa GoTaq (Promega) y la cebadores directos e inversos: ß-actina (cebador directo (FP): 5'CATCCACGAAACTACCTTCAACT3 'y el cebador (RP) inversa: 5'TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG3'), HIF-1α (FP : 5'TGGACTCTGATC ATCTGACC3 'y RP: 5'CTCAAGTTGCTGGTCATCAG3'), y VEGFA (FP: 5'CCTGGT GGACATCTTCCAGGAGTACC3 'y RP: 5'GAAGCTCATCTCTCCTATGTGCT GGC3'.) [38]
cuantitativo en tiempo real PCR se realizado utilizando StepOnePlus
™ Sistemas de Tiempo real PCR de acuerdo con las recomendaciones de los proveedores (Thermo Fisher Scientific). Los cebadores usados para cuantitativa en tiempo real PCR se enumeran en la Tabla S1. Se detectaron los niveles de ARNm con SYBR rápida
® Green Mix Master (Thermo Fisher Scientific). El análisis cuantitativo se realizó mediante la medición de los valores de CT durante la fase exponencial de amplificación. los valores de cuantificación relativa se calcularon utilizando el 2
-ΔΔCT método [39].
Pathway análisis de enriquecimiento
anotación funcional de los genes regulado por la hipoxia se realizó utilizando el DAVID Bioinformática Recursos Versión disposición del público 6,7 software (http://david.abcc.ncifcrf.gov/) con la Enciclopedia de Kyoto de genes y la base de datos vía Genomas (KEGG). La significación estadística se evaluó mediante la prueba exacta de Fisher modificada. P-valor = 0 representa el enriquecimiento perfecta. Valor de p & lt; 0,05 se considera fuertemente enriquecido en las categorías de anotación
La citometría de flujo análisis
Los cultivos de células se tiñeron con naranja de acridina vital. (AO; Sigma-Aldrich) a una concentración de 5 g /ml durante 15 min y después se lavaron con PBS. AO es un colorante catiónico fluorescente que se puede emplear para medir los niveles de orgánulos vesiculares ácidos (lisosomas) dentro de las células. Los niveles de orgánulos vesiculares ácidos se analizaron mediante el FACSCalibur (BD Biosciences) con excitación ajustado a 488 nm, y la emisión de AO fluorescente se detectó por FL-3 de canal (670 nm).
El potencial de membrana mitocondrial se determina usando éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM). Los cultivos celulares se tiñeron con 0,5 M de vital TMRM durante 30 min a 37 ° C y después se lavaron con PBS. La intensidad de fluorescencia de TMRM se analizó mediante citometría de flujo con FL-2 de canal (564 ~ 606 nm). Las muestras se analizaron utilizando el software CellQuest Pro 4.0.2 (BD Biosciences) y la cuantificación se realizó utilizando el software WinMDI 2.9 (Instituto de Investigación Scripps, La Jolla, CA, EE.UU.).
LysoTracker tinción
La LysoTracker Red DND-99 (Thermo Fisher Scientific) se utiliza para investigar la biosíntesis y acumulación de los lisosomas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células HCT116 cultivadas en cubreobjetos se marcaron con LysoTracker Red DND-99 (dilución 1: 5000) durante 1 h bajo condiciones de crecimiento. Después del marcaje, las células se lavaron con PBS frío y se fijaron con formaldehído al 3% en PBS durante 30 min. Después de un extenso lavado con PBS, las muestras se montaron inmediatamente y observaron utilizando un microscopio de fluorescencia invertido (Zeiss Axio Observador A1, Alemania) equipado con una cámara CCD.
El análisis estadístico
se presentaron todos los datos como media ± error estándar y se analizaron usando el software GraphPad Prism 4.0 (GraphPad software Inc., La Jolla, CA, EE.UU.). El análisis estadístico se realizó mediante una prueba t no pareada. Valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Traducción general es susceptible a la hipoxia en las células HCT116
Se ha informado de que la traducción general es inhibida por la hipoxia. en diversos tipos de células, pero los genes sensible a la hipoxia pueden escapar de la represión de traducción durante la hipoxia [32-34, 40]. Aquí, hemos realizado polisomas de perfiles y la RT-PCR para detectar la distribución polysomal de mRNAs específicos. Los complejos /ribosoma de mRNA fueron separados en 11 fracciones usando una centrifugación lineal desde 15 hasta 40% de sacarosa gradiente (Fig 1A). La distribución de un ARNm dentro de las fracciones polysomal es un reflejo de su eficiencia de traducción. En primer lugar, hemos utilizado diferentes líneas celulares de cáncer colorrectal para estudiar los efectos de la hipoxia en la traducción y observamos que la hipoxia prolongada (1% O
2, ≧ 16 h) causó una inhibición dramática de traducción general en las células HCT116 (S1 FIG). la eficiencia de traducción de los cambios de ß-actina de limpieza de genes a partir de ~ 60 ~% a 30% dentro de 16 h de exposición a la hipoxia (Figura 1B). Debido PERK y mTOR quinasas se han propuesto como factores importantes en la regulación de traducción durante la hipoxia [27], por lo tanto, analizaron el estado de fosforilación de sus sustratos aguas abajo, eIF2α y 4E-BP1, en las células HCT116 en condiciones de hipoxia. El análisis por inmunotransferencia mostró que la hipoxia prolongada conduce a un ligero aumento en la fosforilación eIF2α (Fig 1C), y 4E-BP1 se desfosforiló gradualmente dentro de 16 h de exposición a la hipoxia en las células HCT116. Esto indica que la hipoxia inhibe la traducción en general al menos en parte a través de la activación de PERK y la inactivación de mTOR en células HCT116.
A. extractos citoplasmáticos se cargaron en una ultracentrifugación en gradiente de sacarosa 15-40% lineal. Después de la centrifugación, el perfil de polisomas se representó por A
254 valores (superior), y se extrajo el ARN de cada fracción para el análisis. El ARN purificado se resolvió en un gel de formaldehído /agarosa al 1%, y rRNA se visualizó por tinción con bromuro de etidio (inferior). La distribución de las subunidades ribosomales y polisomas se indican. células B. HCT116 se trataron con la hipoxia (1% O
2) durante 0, 4, 8, 16, y 24 h. La distribución polysomal de mRNA β-actina se detectó mediante perfiles de polisomas y RT-PCR. la eficiencia de traducción del ARNm de β-actina se calcula y se muestra como un porcentaje en diferentes puntos temporales. C. El estado de fosforilación de eIF2α y 4E-BP1 se determinó por análisis de inmunotransferencia en células HCT116 expuestas a hipoxia durante el período de tiempo indicado. Los niveles de fosforilados (PI) y las proteínas totales se detectaron mediante anticuerpos específicos contra fosfo-eIF2α (Ser51), eIF2α, fosfo-4E-BP1 (Thr37 /46), y 4E-BP1. La detección de la proteína β-actina sirvió como control de carga. D. Análisis de inmunotransferencia de HIF-1α, GLUT1, VEGFA, y las proteínas beta-actina en células HCT116 expuestas a hipoxia durante 16 h. La detección de la proteína β-actina sirvió como control de carga. células E. HCT116 se cultivaron en normoxia (21% O
2) o hipoxia (1% O
2) durante 16 h. Las células se recogieron y se lisaron en tampón RSB-150. extractos citoplasmáticos se cargaron en una ultracentrifugación en gradiente de sacarosa 15-40% lineal y se recogió en 11 fracciones (1 ml /fracción). aislado RNA de cada fracción se detectó mediante RT-PCR y se sometió a electroforesis en gel de agarosa. La región polisomico del gradiente incluye fracciones 7-11. la eficiencia de traducción de β-actina, HIF-1α, y VEGFA mRNAs se calculó y se muestra como un porcentaje. 28S y 18S rRNAs se visualizaron directamente por tinción con bromuro de etidio. La distribución de las subunidades ribosomales y polisomas se indican.
Para investigar los cambios en la traducción durante la hipoxia, las células HCT116 se cultivaron en condiciones de normoxia (21% O
2) y la hipoxia (1% O
2) las condiciones de cultivo durante 16 h. Como era de esperar, la hipoxia estabiliza la proteína HIF-1α e induce la expresión de HIF-1 genes diana GLUT1 y VEGFA en las células HCT116 (Fig 1D). También se realizó polisomas de perfiles y la RT-PCR para evaluar la eficiencia de traducción de los ARNm seleccionados. Electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa de rRNA mostró un cambio de los ARNm de los polisomas en complejos de iniciación de la traducción (Fig 1E, panel inferior). La acumulación de 18S y 28S ARNr en las fracciones de peso molecular bajo ribosomal (fracciones 5-6; hipoxia) indica la represión de traducción durante la hipoxia. La distribución polysomal de mRNA β-actina se redujo, evidentemente, en las células HCT116 de hipoxia en comparación con el control de normoxia (Fig 1E, panel superior). Una gran parte del ARNm β-actina (68,7%) se asoció con polisomas en las células HCT116 de normoxia, mientras que sólo el 32,0% de los ARNm de β-actina se mantuvo asociado con polisomas en las células HCT116 hipóxicas. Por el contrario, la distribución polysomal de HIF-1α y VEGFa mRNAs fueron relativamente no afectado por la hipoxia (Fig 1E, paneles de media). Más de la mitad de HIF-1α (58,1%) y VEGFA (53,8%) ARNm se mantuvo asociado con polisomas después de 16 h de exposición a la hipoxia. De acuerdo con estudios anteriores [33, 34], HIF-1α y mRNAs VEGFa tienen la capacidad de escapar de la represión de traducción durante la hipoxia. Por lo tanto, se supone que los ARNm seleccionados permanecen traduce eficazmente en las células HCT116 en condiciones de hipoxia.
regulación de traducción de los ARNm seleccionados en las células HCT116 durante la hipoxia
Para investigar los efectos de la hipoxia sobre la traducción, hemos explotado perfiles de polisomas acoplado al análisis de microarrays de ADNc para detectar hipoxia-genes regulados. Ambos mRNAs polisomas asociada y el ARN total de las células HCT116 normóxicas e hipóxicas se aislaron y se sometieron a hibridación de microarrays. mRNAs polisomas asociada se aislaron de un grupo de fracciones polysomal (Fig 1A, fracciones 8-11) para el análisis de translatome. ARN total fue extraído de las mismas muestras para el análisis de transcriptoma. El cambio de la traducción de un ARNm se midió por el cambio en la abundancia de ARN polysomal normalizado con el cambio en la abundancia de RNA total de cada mRNA (Fig 2, polysomal /total). Los genes con cambios ≧ 2 veces después de la exposición a la hipoxia fueron considerados como genes candidatos regulado por la hipoxia. Todos los genes candidatos se dividieron en cuatro categorías: hasta reguladas y abajo de los genes regulados, ya sea en la traslación o de transcripción (Figura 2). Como resultado, los 1.036 hasta los genes regulados y 480 genes regulados fueron identificados por análisis translatome. El análisis del transcriptoma paralelo identificó 144 genes regulados y 134 genes regulados. Sin embargo, sólo ~ 32% de los genes regulado por la hipoxia en las señales de nivel de exposición de la transcripción de traslación co-regulación en las células HCT116 durante la hipoxia (Figura 2, diagramas de Venn). Esto indica que la hipoxia puede afectar a diferentes subconjuntos de genes diana entre translatome y transcriptoma.
Los resultados del análisis de microarrays se analizaron utilizando el software GeneSpring GX 10. Los genes con ≧ 2 veces el cambio en el polisomico relación ARN /o total de ARN total se definieron como hipoxia-genes regulados. Los resultados se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes. hipoxia-genes regulados fueron divididos en cuatro categorías: hasta reguladas y genes regulados en la traducción (translatome) y los niveles de transcripción (transcriptoma), respectivamente. Los diagramas de Venn muestran la superposición de genes regulado por la hipoxia entre translatome y transcriptoma. Los números en áreas superpuestas indican hipoxia-genes regulados, tanto a nivel de la traducción y de la transcripción en células HCT116.
Validación de los genes candidatos cuya traducción está regulado por la hipoxia en las células HCT116
para verificar los datos de microarrays, varios genes candidatos fueron analizados por perfiles de polisomas y cuantitativa en tiempo real RT-PCR. La asociación polysomal de mRNA β-actina se redujo, evidentemente, en las células HCT116 expuestos a la hipoxia (Fig 3A). Por el contrario, los ARNm polisomas asociados de ambos traduccionalmente y transcriptionally hasta reguladas genes
GLUT1
,
ADM
, y
VEGFA
se aumenta en las células HCT116 durante la hipoxia en comparación a normoxia (Fig 3B), lo que indica que los tres genes permanecen traduce eficazmente en condiciones de hipoxia. Resultados similares se obtuvieron de traslación, pero no transcriptionally hasta reguladas genes
HSPA5
,
VCAN
, y
GPR126 gratis (Figura 3C). Después del cálculo, estos genes en traslación hasta reguladas mostraron un aumento en la eficiencia de traducción durante la hipoxia en comparación con la normoxia (Fig 3D). Los resultados de experimentos de validación son en gran parte de acuerdo con las mediciones de microarrays. Esto indica que muchos genes pueden escapar de la represión de traducción y permanecen traducido eficazmente en células HCT116 durante la hipoxia.
Varios genes regulados a nivel de traducción (translatome) en las células HCT116 hipóxicas fueron validados. ARN aislado de fraccionamiento en gradiente de sacarosa se analizó por cuantitativa en tiempo real RT-PCR. La distribución de ARNm en cada fracción se calcula y se muestra como un porcentaje (%). perfil A. polysomal de β-actina sirvió como un control negativo. B. perfiles polisomico de genes regulados, tanto a nivel de la traducción y de la transcripción (
GLUT1
,
ADM
, y
VEGFA
). C. perfiles polisomico de genes regulados en la traslación pero no el ámbito de la transcripción (
HSPA5
,
VCAN
, y
GPR126
). eficiencia D. traslacional de β-actina, GLUT1, ADM, VEGFA, HSPA5, VCAN, y GPR126 mRNAs se calculó y se muestra como un porcentaje (%) en las células HCT116 bajo normoxia e hipoxia. Los gráficos de barras muestran la media ± error estándar de al menos tres experimentos independientes (* P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001) guía empresas
Pathway análisis de enriquecimiento de la hipoxia. -regulated genes a nivel de traducción
con el fin de profundizar en las funciones biológicas de los genes regulado por la hipoxia, la vía de análisis de enriquecimiento se realizó utilizando los recursos de software de bioinformática DAVID 6,7 mapa de los genes a las vías biológicas como se define por la la base de datos KEGG vía. Los resultados mostraron que la hipoxia conduce a traslacional sobre regulación de genes que funcionan en lisosoma, el metabolismo de lípidos y glicano, procesamiento y presentación de antígenos, la adhesión celular, y la remodelación de la matriz extracelular (ECM) y el citoesqueleto (Tabla 1). En contraste, la hipoxia regula por disminución la traducción de los genes implicados en la apoptosis, la proteolisis mediada por ubiquitina, y la fosforilación oxidativa (Tabla 2). Una función importante de los lisosomas es la autofagia digestivo en células eucariotas. Por lo tanto, suponemos que la hipoxia induce la autofagia lisosomal y el reordenamiento metabólica para mantener la homeostasis de la energía a través de un mecanismo de traslación.
La hipoxia induce la autofagia lisosomal y la disfunción mitocondrial a través de la regulación de traducción en las células HCT116
Hemos identificado 35 genes en traslación hasta reguladas que funcionan en la vía lisosomal en las células HCT116 expuestos a la hipoxia (Tabla 1). Curiosamente, los 35 genes lisosomales son regulados durante la hipoxia a nivel de traducción independiente de la transcripción (Tabla 3). Esto indica que la regulación de traducción puede jugar un papel crucial en la autofagia inducida por hipoxia. Los lisosomas se pueden cuantificar por citometría de flujo después de teñir las células con naranja de acridina (AO), una base débil lysosomotropic que se acumula dentro de los orgánulos vesiculares ácidos de las células vivas. La intensidad de fluorescencia de AO fue significativamente mayor en las células HCT116 después de la exposición a la hipoxia durante 24 h (Fig 4A), lo que sugiere que la hipoxia conduce a un aumento en el contenido de los lisosomas. A continuación utiliza LysoTracker Red DND-99, un colorante fluorescente acidotropic para el etiquetado y el seguimiento de orgánulos ácidos en las células vivas, para teñir lisosomas. Los lisosomas se tiñeron de color rojo brillante en las células HCT116, y la hipoxia da lugar a los lisosomas ampliada en comparación con la normoxia (Fig 4B). Los resultados indican que la hipoxia aumenta el tamaño del volumen lisosomal. Además, examinó la inducción de la autofagia mediante el control de la cadena ligera autofagia proteína marcadora 3 (LC3) en las células HCT116 en condiciones de hipoxia en comparación con la normoxia. La conversión de LC3-I a LC3-II y la degradación de LC3 total (LC3-I más LC3-II) se utilizaron para determinar los cambios en la extensión de la autofagia [41]. El análisis por inmunotransferencia mostró que LC3-I a LC3-II de conversión (LC3-II /relación de LC3-I) se incrementó y la cantidad total de LC3 se redujo en las células HCT116 expuestas a hipoxia durante 24 h y 48 h (Fig 4C, el panel izquierdo ), lo que sugiere la autofagia inducida por hipoxia. También se detectó la p62 proteína marcadora de la autofagia, que se degrada durante la autofagia [41]. Consistentemente, la cantidad de p62 también mostró una disminución marcada de las células HCT116 de hipoxia (Fig 4C, panel derecho). Para verificar la traslación hipoxia inducida por la sobre regulación de las proteínas lisosomales (Tabla 3), se han detectado niveles de la proteína y mRNA de los genes lisosomales glucosamina (N-acetil) -6-sulfatasa (
GNS
), prosaposina (
PSAP
), y tripeptidil peptidasa 1 (
TPP1
). Después de la exposición a la hipoxia durante 24 h, el nivel de GNS y proteínas PSAP se aumentó por ~ 2 veces en comparación con la normoxia (Fig 5A). El nivel de proteína TPP1 también se aumentó ligeramente durante la hipoxia. Un ensayo cuantitativo mostró que los niveles de mRNA de GNS, PSAP, y TPP1 no se ven significativamente afectados por la hipoxia (Fig 5A). Los resultados indican que la hipoxia enriquece proteínas lisosomales a través de mecanismos de traslación.
A. células HCT116 se cultivaron en normoxia (21% O
2) o hipoxia (1% O
2) durante 24 h. Las células se tiñeron con naranja de acridina (AO) y se analizaron por citometría de flujo para medir el contenido de los lisosomas. Los gráficos de barras muestran la intensidad de fluorescencia media de AO a partir de al menos tres experimentos independientes (** p & lt; 0,01). células B. HCT116 se cultivaron en normoxia (21% O
2) o hipoxia (1% O
2) durante 24 h. Los lisosomas se marcaron con LysoTracker Red DND-99 durante 1 h en las células vivas y se observaron con un microscopio de fluorescencia invertido. células C. HCT116 se expusieron a hipoxia (H) o normoxia (N) durante 24 h y 48 h. extractos celulares totales se analizaron por inmunotransferencia con anticuerpos LC3 y beta-actina (panel izquierdo). Las bandas de LC3-I y LC3-II se cuantificaron, y la autofagia se midió por las variaciones en la proporción de LC3-II /LC3-I y la cantidad total de LC3 (LC3-I más LC3-II) normalizado a ß-actina para cada condición. Los gráficos de barras muestran el nivel de proteína LC3 relativa normalizada para ß-actina de al menos tres experimentos independientes (** p & lt; 0,01). Las muestras anteriores también se analizaron por inmunotransferencia con p62 y anticuerpos α-tubulina (panel derecho).