Extracto
Objetivo
La metástasis es la causa más común de muerte de pacientes con cáncer de próstata. Identificación de marcadores biológicos específicos de metástasis y nuevas dianas terapéuticas se considera esencial para un mejor pronóstico y la gestión de la enfermedad. MicroARNs (miRNAs) forman una clase de no codificante pequeñas moléculas de ARN que se consideran los principales reguladores de la expresión génica. Su desregulación se ha demostrado que desempeñan un papel en la aparición del cáncer, la progresión y la metástasis, y miRNAs representan una nueva clase prometedora de biomarcadores de cáncer. El objetivo de este estudio fue identificar abajo y hasta regulado miRNAs en el cáncer de próstata que podrían proporcionar biomarcadores potenciales y /o dianas terapéuticas para la metástasis del cáncer de próstata.
Métodos
La tecnología de secuenciación de nueva generación se aplicó para identificar miRNAs expresados diferencialmente en una metastásico transplantable frente a una línea de xenoinjerto de cáncer de próstata no metastásico, ambos derivados de cáncer primario de un paciente. Los xenoinjertos se desarrollaron a través de injerto cápsula sub-renal de cáncer de
tejidos en ratones NOD /SCID, una metodología que tiende a preservar las propiedades de los cánceres originales (por ejemplo, la heterogeneidad del tumor, los perfiles genéticos)
. resultados
fueron identificados
expresados diferencialmente miRNAs, isomiRs y 36 nuevos miRNAs conocido. Un número de estos miRNAs (21/104) han sido previamente informado para mostrar abajo similar o regulación en los cánceres de próstata en relación con el tejido normal de la próstata, y algunos de ellos (por ejemplo, el miR-16, miR-34a, miR-126 *, miR-145, miR-205) se han relacionado con la metástasis del cáncer de próstata, apoyando la validez del enfoque analítico.
Conclusiones
el uso de sub-renal metastásico y el cáncer de próstata no metastásico xenoinjertos cápsula derivadas de cáncer de un paciente hace que sea probable que los miRNAs expresados diferencialmente identificados en este estudio incluyen biomarcadores potenciales y /o dianas terapéuticas para la metástasis del cáncer de próstata humano
Visto:. Watahiki a, Wang y, J Morris, Dennis K, O'Dwyer HM, Gleave M, et al. (2011) Los microARN asociados con cáncer de próstata metastásico. PLoS ONE 6 (9): e24950. doi: 10.1371 /journal.pone.0024950
Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Febrero, 2011; Aceptado: August 24, 2011; Publicado: 30 de septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Watahiki et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por los Institutos canadienses de Investigación en Salud (YZW /MG). YZW es un destinatario de un Premio Académico de Chinos de Ultramar de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No 30928027), y un receptor de un premio innovador Académico de la Alianza contra el Cáncer Internacional para la Investigación del Cáncer y la Fundación Educación y fibrolamelar cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores declaran que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer
próstata es el cáncer más común en hombres y la segunda causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos [1]. Mientras considerables avances se han hecho en el tratamiento de tumores localizados, órgano-confinados, cáncer de próstata es actualmente incurable, una vez que ha progresado a la metástasis, y la mayoría de las muertes por esta enfermedad se deben a metástasis que son altamente resistentes a las terapias convencionales. Actualmente, el antígeno prostático específico (PSA) es un biomarcador de suero principales que se utilizan para la detección y el seguimiento de la progresión del cáncer de próstata. Sin embargo, el valor pronóstico de aumento de los niveles de PSA es limitado, ya que el cáncer de próstata avanzado se puede asociar con valores muy bajos o normales de PSA. Por tanto, existe una necesidad urgente de nuevos biomarcadores más específicos que se pueden utilizar para predecir la progresión del cáncer solos o en cooperación con un biomarcador actual, como PSA [2]. Por otra parte, se necesitan urgentemente nuevos objetivos terapéuticos asociados a la metástasis del cáncer de próstata.
Los microARN (miRNA) son pequeños ARN no codificantes (17 a 27 nucleótidos) que regulan negativamente la expresión de los genes diana mediante la unión a 3 'sin traducir regiones (UTRs) de los ARNm y la inhibición de la traducción o la promoción de la degradación del ARNm [3]. Estudios recientes han demostrado la desregulación de miRNAs en tumores humanos que indica un papel para estas moléculas en la patogénesis del cáncer, incluyendo la aparición del cáncer, la progresión y la metástasis [4], [5]. Hasta el momento, sólo un pequeño número de estudios han investigado la expresión de los genes miARN en el cáncer de próstata, y sólo unos pocos se han ocupado de la metástasis de esta enfermedad. Las diferencias en los perfiles de expresión de miRNAs identificados hasta ahora pueden tener valor pronóstico para los distintos aspectos de la enfermedad y una mejor comprensión del papel de los miRNAs en el desarrollo y progresión del cáncer de próstata que se necesita [6]. La investigación adicional también puede conducir a la identificación de nuevos miRNAs que están específicamente relacionados con la progresión del cáncer de próstata y metástasis. Tales miRNAs asociados a metástasis pueden servir como biomarcadores metastásicas y /o nuevos objetivos para la terapia de la enfermedad metastásica.
Los estudios dirigidos a la identificación de factores genéticos con un papel clave en la metástasis del cáncer de próstata se han visto obstaculizados por la falta de modelos experimentales óptimas . Mientras que los modelos de xenoinjerto en base a líneas celulares de cáncer establecidas que representan diferentes etapas de la progresión del cáncer puede ser útil para identificar los mecanismos de la metástasis subyacente, que no imitan adecuadamente la enfermedad clínica [7]. Por lo tanto, los esfuerzos se han centrado en el uso de cáncer de próstata de los pacientes
tejidos
. Sin embargo, la heterogeneidad típico de tales tejidos, que consta de las dos subpoblaciones no metastásicos y potencialmente metastásico, hace que sea difícil la identificación de factores tales como los genes que subyacen en el desarrollo de metástasis [8]. Además, es difícil de obtener tejidos de cáncer de próstata metastásico de pacientes con fines experimentales, ya que no son una biopsia o resección de pacientes habitualmente o que sea viable, y los programas de autopsia rápidos son muy caros y difíciles de manejar. Para superar los obstáculos anteriores, hemos desarrollado modelos de xenoinjertos de cáncer de próstata los pacientes derivados de próxima generación, que se asemejan más a la situación clínica, mediante el uso de injertos de cápsula sub-renal de tejido de cáncer de los pacientes en ratones inmunodeficientes. Esta metodología favorece la retención de las propiedades de los tipos de cáncer originales [9] - [11]. Además, se ha podido establecer sublíneas de cáncer de próstata trasplantables, metastásicos y no metastásicos de xenoinjertos heterogéneos [12], [13]. El uso de metastásicos y no metastásicos xenoinjertos ya ha sido eficaz en la identificación de genes asociados a metástasis de cáncer de próstata [13].
secuenciación de ADN masivamente paralelo de Illumina por tecnología de síntesis es una plataforma de secuenciación de próxima generación adoptado ampliamente . Es compatible con la secuenciación paralelo utilizando un método basado en terminador reversible de propiedad que permite la detección de las bases individuales, ya que se incorporan en cadenas crecientes de ADN. Un terminador marcado con fluorescencia se forma la imagen que se añade cada dNTP y luego se escinde para permitir la incorporación de la siguiente base. Desde los cuatro dNTP terminador de ruedas reversibles están presentes durante cada ciclo de secuenciación, competencia natural minimiza el sesgo de incorporación, lo que lleva a la verdadera secuencia de base por base [14].
En el presente estudio, Illumina tecnología de secuenciación de próxima generación se utilizó para comparar los perfiles de miARN de un metastásico transplantable frente a una línea de xenoinjerto de cáncer de próstata no metastásico, tanto deriva a través de la cápsula subrenal injerto [10] - [12] a partir de tejido de cáncer primario de un paciente. Expresados diferencialmente conocido y se encontró novela miRNAs que pueden tener funciones específicas en la metástasis del cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
modelos de xenoinjertos de cáncer de próstata derivados de los pacientes
NOD /los ratones SCID utilizados para los xenoinjertos fueron criados y mantenidos en el Centro de Investigación del cáncer de Columbia británica Animal Centre (Vancouver, Canadá). Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por la Universidad de British Columbia Cuidado de Animales (A10-0100). Una muestra de biopsia del cáncer de próstata se obtuvo en la BC Cancer Agency con el consentimiento informado por escrito del paciente. La aprobación ética fue proporcionado por la Universidad de Columbia Británica -. Junta Ética de Investigación British Columbia Cancer Agency (UBC BCCA REB#H04-60131)
El establecimiento de líneas de xenoinjertos de cáncer de próstata tejido trasplantables a través de injerto cápsula sub-renal se ha descrito anteriormente [9]. En el presente estudio, una preparación reciente de próstata metastásico línea de xenoinjerto de cáncer, LTL-313H [15], y una contraparte no metastásico, LTL-313B (no publicado), se utilizaron que habían sido derivados de diferentes loci de la biopsia del cáncer de próstata de un paciente muestra (www.livingtumorlab.com). Ambas líneas fueron PSA-y AR-positivo, como se muestra por medio de inmunohistoquímica ([15], datos no publicados). Se mantuvieron rutinariamente bajo cápsula renal de ratones NOD /SCID machos suplementados con testosterona, como [9] se describe anteriormente. Los xenoinjertos LTL-313H mostraron invasión del riñón anfitrión ratón y se detectaron células de cáncer en los pulmones de los anfitriones después de 3 meses de injerto. En contraste, los xenoinjertos LTL-313B no mostraron invasión obvia del riñón del ratón y no mostraron metástasis a distancia (datos no mostrados).
Construcción pequeña biblioteca de ARN y ADNc secuenciación
LTL- 313H y de los tejidos de xenoinjerto LTL-313B se recogieron y el ARN se extrajo usando TRIzol (Invitrogen, Mississauga, ON, Canadá) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN se somete al Centro Ciencias del Genoma en la British Columbia Cancer Agency (www.bcgsc.bc.ca) para los pequeños ARN-ADNc construcción de la biblioteca y la secuencia como se describe anteriormente [16], con modificaciones menores. Cada biblioteca tiene una secuencia específica en su índice de 'adaptador 5, es decir, "ACATCGA" para la biblioteca LTL-313H y "CGTGATA" para la biblioteca LTL-313B; ambas bibliotecas se mezclaron y la secuenciación se realizó en una celda de flujo en la plataforma de la iluminación.
mapeo ARN pequeño y detección de la expresión diferencial
El 5 'indexados secuencias de cDNA se utilizan para distinguir el origen de los ARN. Secuencias 3 'Adaptador fueron retirados de todas las lecturas y los restantes etiquetas que eran 16 a 27 nucleótidos de longitud y expresan en una cuenta de etiquetas de 2 o más en cada biblioteca se utilizaron para el análisis adicional. Las secuencias recortadas fueron asignadas a miRBase 15 secuencias tallo-bucle humanos (http://www.mirbase.org/) utilizando el programa Novoalign (www.novocraft.com) permitiendo hasta 3 desajustes. Aquellos que coincidía con una secuencia de miRBase fueron agrupados como: 1) conocido madura miARN y miARN *, 2) putativo miARN *, no se informó anteriormente en el miRBase, 3) secuencias de bucle y 4) las secuencias que han concordado con el bucle de secuencia, pero no lo hicieron han conocido las secuencias maduras. Las secuencias coincidentes miRNAs conocidas se agruparon más, en función de sus posiciones de partida, y se contaron. Las etiquetas de posición de variación /partida más abundantes fueron utilizados para la comparación entre las bibliotecas. etiqueta cuenta se normalizaron a los recuentos totales de aquellas secuencias que coincidan con las secuencias tallo-bucle miRBase 15 y las dos bibliotecas se compararon la expresión diferencial de las secuencias utilizando la prueba exacta de Fisher con la corrección de Bonferroni. Las secuencias fueron consideradas significativamente diferencialmente expresado por las dos bibliotecas si el valor de p fue. & Lt; 0,001 y había por lo menos un cambio de 2 veces en los recuentos normalizados las secuencias '
identificación Novel miARN
Las secuencias que no coincidía con las secuencias conocidas de tallo-bucle miARN se separaron por filtración con secuencias conocidas transcripciones descargados de la UCSC [17]. Para identificar nuevos candidatos miARN entre las secuencias restantes sin igual, se utilizó el programa miRanalyzer [18] (http://web.bioinformatics.cicbiogune.es/microRNA/miRanalyser.php). Los candidatos de salida se comprueban uno por uno para homologías con ARN no codificante conocida, y las secuencias no homólogas fueron tomadas como nuevos candidatos miARN.
miARN objetivo de predicción y análisis vía
Los genes diana para cada miARN expresados diferencialmente se prevé utilizar microcosmos versión 5 [19], [20] con un umbral de
p = 0,001
. Como algunos de los genes fueron regulados por tanto, potencialmente hasta reguladas y las reguladas miRNAs, nos hemos centrado para su posterior análisis de los genes que son potencialmente regulados únicamente por hasta reguladas o hacia abajo-regulado miRNAs. Identificación de KEGG vías potenciales asociados con genes diana se llevó a cabo utilizando DAVID 6.7 (base de datos para anotación, y Visualización Integrada Discovery http://david.abcc.ncifcrf.gov/). Además, se compararon las listas de genes diana con los datos de expresión génica mediante microarrays de ensayo utilizando los mismos tejidos de xenoinjerto de identificar aquellos supuestos objetivos que podrían ser regulados en el ARNm.
análisis de microarrays de expresión génica
el ARN que se utilizó para la biblioteca de la secuenciación de los genes miARN también se utilizó para el análisis de expresión génica basada en ARNm utilizando la plataforma humana GE 44K de Agilent en el Centro de Vancouver de próstata Centro de microarrays (www.mafpc.ca). Todos los datos son MIAME compatible con los datos en bruto y se han depositado en el GEO (número de acceso GSE28029). La señal de expresión se transformó en z-score y Z-cociente calculado y los ARNm con más de 1,96 de z-relación se trataron hasta regulada y menos de -1.96 como las reguladas [21]. Los datos también fueron filtradas por la bandera.
cultivo celular
La línea celular de cáncer de próstata 22Rv1 se cultivó en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2.
miARN precursor de transfección
la secuencia precursora de miR-486, que se muestra en el miRBase, y un control negativo no silenciar se subclonaron en el plásmido pcDNA6.2-GW /EmGFP MIR (Invitrogen). 22Rv1 células fueron sembradas en placas de 12 pocillos a una densidad de 1,0 x 10
5 células por pocillo, 24 horas antes de la transfección. La transfección se realizó utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. La eficacia de transfección fue validado por la monitorización de señales de GFP usando un sistema de microscopio de fluorescencia invertido (Zeiss). Para confirmar aumento de los niveles de objetivo madura miARN, se utilizó una porción de las células transfectadas para la validación por cuantitativa (qPCR). Con este fin, el ARN total se extrajo utilizando un kit de miRNeasy mini (Qiagen) y la cantidad de ARN determinada por espectrofotometría NanoDrop (Thermo Scientific). Las porciones (25 ng) de cada una de las preparaciones de ARN total se transcrito de forma inversa a cDNA utilizando un kit de síntesis de ADNc universal (Exiqon) siguiendo las instrucciones del fabricante. El cDNA se diluyó y se mezcló con los cebadores de PCR y microRNA LNA SYBR Green mezcla maestra (Exiqon). qPCR se llevó a cabo utilizando un 7900HT ABIPrism (Applied Biosystems) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ΔΔCT se utilizó para calcular el pliegue cambios en relación con el control y se utilizó U6 como control endógeno.
MTT ensayo
Las células transfectadas se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10
4 células /pocillo. Se añadió solución MTT (20 l de 5 mg /ml) a los cultivos (200 volúmenes mu l) para una incubación de 4 horas a 37 ° C. Después de la eliminación del medio de cultivo, los cristales restantes se disolvieron en DMSO y se midió la absorbancia a 570 nm.
de la migración /invasión de ensayo
Se utilizaron cámaras de invasión BioCoat Matrigel (BD Biosciences) para medir invasividad tisular de células. En las cámaras superiores, 1 × 10
5 células /pocillo se sembraron en 0,50 ml de medio libre de suero. En las cámaras inferiores, 0,75 ml de medio /10% de FBS fue entregado. Las cámaras se incubaron durante 30 horas a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO
2. Las células que permanecieron en la cámara superior se retiraron y las células transmigradas fijaron en metanol y se tiñeron con cristal violeta y las células teñidas se contaron por análisis microscópico. la invasión de células del tumor se expresa como el porcentaje de células que habían pasado a través de las membranas recubiertas con Matrigel en relación con el número de células que habían pasado a través de las membranas no recubiertas (índice de invasión). Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Resultados
secuenciación y anotación de los genes miARN
Los pequeños ARN fueron aisladas de metástasis LTL-313H y xenoinjertos de tejido de cáncer de próstata LTL-313B no metastásico y procesado para permitir la secuenciación profunda usando la plataforma de la iluminación. La lee con índice de secuencias de adaptador "ACATCGA" y "CGTGATA" se les dio origen LTL-313H y origen LTL-313B, respectivamente. lee se obtuvieron más de 10 millones total para cada una de las bibliotecas. Estas lecturas se compararon con los datos de la secuencia en la base de datos de microARN miRBase 15 Secuencia. Para las bibliotecas de tejido de cáncer de próstata metastásico y no metastásico, 3,445,642 y 2,272,677 etiquetas, respectivamente, fueron totalmente asignan a las secuencias tallo-bucle miARN humano presentes en la base de datos miRBase (Tabla 1). El totalmente calzados lecturas fueron anotados, según su posición en la estructura tallo-bucle. Se dejó un desplazamiento de hasta 2 bases en las posiciones inicial y final para las secuencias a ser anotado como
isómeros Red de madurez miRNAs conocidos (isomiRs). El número total de miRNAs conocidos más miARN * s en la metastásico y no metastásico bibliotecas fueron 447 y 509, respectivamente (Tabla 1). El miARN más altamente expresado (y isomiR) fue el miR-148a con el recuento total de 270.801 y 763.877 lecturas por bibliotecas metastásicos y no metastásicos, respectivamente. Cuando los isomiRs se agruparon utilizando la misma posición de partida, el miR-148a sigue siendo el más abundante miARN en la biblioteca no metastásico con un recuento total de 846.468, mientras que en la biblioteca metastásico miR-21 fue más abundante con un recuento total de 310.102 .
miARN y miARN * expresiones
En el miRBase, miRNAs derivado de un precursor de miARN se designan, el brazo se expresa predominantemente, y miARN * al menos expresado, brazo opuesto. Si los dos brazos se expresan de manera similar, que se conocen como 5p y 3p brazos. La expresión de miRNAs conocidos en los xenoinjertos de cáncer de próstata fue en general superior a la de los genes miARN * s. En un número de casos, los genes miARN * s (identificada por miRBase) fueron más expresa que los miRNAs correspondientes (Tabla 2). Por lo tanto el miR-144 * fue sustancialmente más expresó que el miR-144 en las dos bibliotecas metastásicos y no metastásicos; Del mismo modo el miR-126 * se expresa más que el miR-126, pero sólo en la biblioteca no metastásico. También se encontraron diferencias en los patrones de expresión de 3p y 5p miRNAs brazo (Tabla 2). Los 3p brazos de miR-28 y miR-339 mostraron expresiones más altas que las correspondientes 5p brazos en la línea metastásica, mientras que mostraron expresiones más bajos que los correspondientes 5p brazos en la línea de no metastásico. En la línea metastásica, el miR-542 mostró sobre regulación del brazo 3p pero baja regulación del brazo 5p. Fragmentos que fueron homólogos de miRNAs maduros conocidos, pero que hasta ahora no habían sido notificados a la base de datos miRBase, se designaron "novela putativo miARN *" especies (Tabla 3). Se observó un total de 32 de tales putativo miARN * s que muestra al menos dos lecturas en una de las dos bibliotecas. Algunos de estos miARN * s también mostraron una mayor expresión de sus correspondientes miRNAs, por ejemplo, el miR-1277 * y miR-1307 *.
Novel miARN candidatos
Una de las ventajas de utilizar un enfoque de secuenciación de los genes miARN perfiles es la oportunidad de identificar nuevos miRNAs o miARN * s. Con este fin, se utilizó un miRanalyzer, una detección microRNA y herramienta de análisis [18], en combinación con búsquedas de homología para identificar transcripciones conocidos, incluyendo los ARN no codificantes (por ejemplo, ARNr, ARNt, etc.). El uso de software miPred distinguir pre-miRNAs reales de otras secuencias de horquilla con tallo de bucles similares [22], hemos identificado 36 nuevos candidatos miARN. Sus secuencias, localizaciones cromosómicas y número de lecturas en el metastásico y no metastásico bibliotecas se presentan en la Tabla 4 y la Tabla S1. Análisis comparativo de las dos bibliotecas mostró expresión diferencial significativa de algunos de estos nuevos miRNAs, incluyendo las reguladas miR-5680-3p y miR-5681a-3p.
Potencial miRNAs asociados a metástasis
análisis comparativo de las bibliotecas de genes miARN metastásico y no metastásico de xenoinjertos reveló un total de 104 miRNAs expresados diferencialmente o miARN * s con 55 el regulado y 49 hasta reguladas en la línea metastásico (Tabla 5.6.7). De los miRNAs reguladas por, 24 miRNAs mostraron a & gt; disminución de 5 veces, incluyendo cuatro miRNAs, es decir, el miR-205, miR-503, miR-708 y miR-2115 *, que eran indetectables en la línea metastásica. Dos miRNAs, es decir, el miR-24-2 * y miR-101 *, mostraron una mayor expresión en un formulario de una base de turnos. Una forma de una base de cambio de miR-203 mostró algo de aumento de la expresión en la línea metastásica en relación con la referencia de miR-203, mientras que en la línea de no metastásico que mostró una menor expresión. De los miRNAs hasta reguladas, 23 miRNAs mostraron a & gt; el cambio de 5 veces en los recuentos normalizados. formas de una base del turno de miR-9 *, miR-148b * y miR-1246 mostraron una mayor expresión de los formularios de referencia en ambas líneas metastásicos y no metastásicos.
Algunos de los miRNAs expresados diferencialmente han sido previamente asociado con el cáncer de próstata, metástasis de cáncer de próstata o de metástasis de otros tipos de cáncer (Tabla 5,6,7). De los miRNAs reguladas por haber sido informado de que se las reguladas en el cáncer de próstata en relación con tejidos de la próstata benignos, es decir, el miR-16 [23] un número - [25], el miR-24 [26] - [28], miR 29 bis [26], el miR-145 [23], [24], [27], [29], [30], y miR-205 [24], [31], [32]. La baja regulación de miR-16 [25], el miR-34a [33], el miR-126 * [34], el miR-145 [35] y miR-205 [36] correlacionado con el desarrollo de la metástasis del cáncer de próstata. De los miRNAs hasta reguladas (en la biblioteca metastásico), miR-210 se ha informado de que hasta reguladas en los carcinomas de próstata en relación con las muestras de HPB [23] y miR-301 se ha relacionado con la metástasis del cáncer de próstata [37]. En algunos casos, los miRNAs que se encontró que eran se han reportado hasta reguladas en el presente estudio para ser ya sea hasta reguladas en los carcinomas de próstata en comparación con el tejido normal de próstata [38] - [40], o las reguladas [23], [24], [27] - [29]. Por otra parte, algunos de los miRNAs expresados diferencialmente han informado a desempeñar un papel en la metástasis de otros tipos de cáncer, por ejemplo, los miRNAs hasta reguladas, let-7i, miR-9, miR-30a, miR-125 ter, MIR -142-5p, miR-151-3p, miR-450a y los miRNAs reguladas por, miR-24, miR-145, miR-146b-5p, miR-185, miR-186, miR-203 y miR-335 .
los supuestos genes diana para miRNAs expresados diferencialmente
Como un primer paso en la identificación de miRNAs con potencial importancia en el proceso metastásico, hemos identificado los genes putativo objetivo para cada uno de los miRNAs expresados diferencialmente utilizando el análisis microcosmos, un programa de predicción de destino con un algoritmo específico y la cobertura de los genes miARN, incluyendo variedades en los brazos de estrellas; un umbral
p-valor = 0,001
se mantuvo para obtener una identificación más fiable de destino (microcosmos) [41]. genes diana putativos fueron identificados por 49 de los 55 miRNAs-regulado y el 47 de los 49 miRNAs hasta reguladas (Tabla S2); fueron anotados utilizando el programa DAVID. Los genes diana putativo de la miRNAs reguladas por estaban asociados con una variedad de vías incluyendo KEGG "Fc gamma R mediada por fagocitosis" y "interacción ECM-receptor (Tabla S3). Para los genes diana putativos de los miRNAs hasta reguladas, se observaron las vías tales como "Caminos en el cáncer", "adhesión focal" y "metabolismo de las purinas".
Comparación de los genes putativos miARN con genes expresados diferencialmente en la metastásico y líneas de xenoinjertos no metastásicos
Aunque se cree que los miRNAs para alterar los niveles de proteína, que en algunos casos han demostrado afectar también los niveles de ARNm [3]. En vista de esto, las dos líneas de xenoinjertos se examinaron para la expresión diferencial de mRNA. Como se muestra en la Tabla S4, 622 ARNm se redujeron regulado y 348 mRNAs fueron reguladas en la línea metastásica. Algunos de los genes identificados por la expresión diferencial de mRNA fueron potencialmente utilizado por ambos miRNAs arriba y hacia abajo regulados. En vista de esto, su posterior análisis se restringió a los genes que son potencialmente utilizado por cualquiera de los miRNAs hasta reguladas o hacia abajo regulados. El grupo que mostró hasta reguladas ARNm asociados con miRNAs única reguladas por constaba de 85 ARNm; el grupo que mostró mRNAs reguladas por los asociados con miRNAs regulados hasta de sólo constaba de 58 ARNm. Entre los ARNm hasta reguladas en la línea metastásico, algunos se han notificado a tener un papel en la invasión de tejidos y /o metástasis de una variedad de células cancerosas, incluyendo ARNm expresadas por
FSCN1
[42],
VEGFA
[43]
FGFR1
[44],
ADAMTS1
[45],
CCL2
[46] y
VIM
[47 ] genes. Del mismo modo, los ARNm regulados hacia abajo en la línea metastásico, incluyendo ARNm expresados por el
CTGF
[48] y
SERPINB5
[49] genes, se han encontrado para ser las reguladas en diversos metastásico cánceres, lo que demuestra la fiabilidad de nuestros análisis (cuadro S5).
aumento de los niveles de madurez de miR-486 en células transfectadas
a las 24 horas después de la transfección de las células 22Rv1 con pcDNA6.2-GW /EmGFP-mir486 o secuencia-GW pcDNA6.2 /control EmGFP, se encontraron más de 90% de las células a ser positivas para GFP. El precursor de miR-486 había sido procesada correctamente a la forma madura de miR-486, como se indica por qPCR. En relación con el control, los niveles de expresión de miR-tanto 486-5p y los brazos -3P eran 11,6 veces mayor, lo que indica que la mayoría de las células expresaron niveles elevados de miR-486.
invasividad de miR-486- transfectadas 22Rv1 células
la tasa de proliferación de miR-486 transfectadas y de control de las células transfectadas con la secuencia fue similar como se indica mediante el ensayo de MTT (Fig. 1A). Sin embargo, las células transfectadas con miR-486 mostraron un aumento de aproximadamente 85% en la invasividad del tejido en relación con las células de control (Fig. 1B). A pesar de este resultado tiene significación marginal (
p
= 0,08), que indica que el aumento de expresión de miR-486 mejora la capacidad de invasión de tejidos.
A) Como se indica mediante el ensayo de MTT, no hubo una diferencia significativa entre el crecimiento de las células transfectadas con el miR-486 y las células de control durante un período de 72 horas. B) de invasión de tejidos, tal como se mide por la invasión de Matrigel, de miR-486 células transfectadas y las células de control. Los datos se expresan como porcentaje de invasión ± S.D. y demuestran más capacidad de invasión de las células transfectadas con el miR-486 (85%;
p = 0,08
) guía empresas
Discusión
Los microARN se han implicado en la regulación de. la expresión génica a nivel post-transcripcional en casi todos los eventos biológicos, y hay un creciente cuerpo de evidencia de que las expresiones alteradas de miRNAs específicos están implicados en el desarrollo y progresión del cáncer [4], [5]. El uso de la secuenciación de próxima generación para los pequeños ARN de identificación, el presente estudio tuvo como objetivo identificar miRNAs expresados diferencialmente conocidos y novedosos en metastásico versus no metastásicos xenoinjertos de cáncer de próstata que podrían desempeñar un papel en la progresión del cáncer de próstata metastásico a la forma. Las líneas de cáncer de trasplantables que se utilizaron parecen ser muy adecuado para el propósito ya que habían sido derivadas de cáncer de un paciente y por tanto, dotados de un fondo genético común. Por otra parte, se habían desarrollado a través de la cápsula sub-renal injerto de cáncer de
tejidos en ratones NOD /SCID, una metodología que tiende a preservar las propiedades importantes de los cánceres originales (por ejemplo, la heterogeneidad del tumor, los perfiles genéticos) [9] - [11], [50]. Además, el mantenimiento de las líneas tumorales en el mismo tipo de sitio del injerto (bajo la cápsula renal) se aseguró de que su crecimiento no fue marcadamente influenciada por diferencias micro-ambientales que pueden tener un impacto importante en el desarrollo del cáncer [51]. Del mismo modo, el mismo tipo de sitio del injerto sería minimizar las diferencias en la producción de miARN de células huésped presentes en los xenoinjertos. Aunque se ha demostrado que los xenoinjertos puede alterar la expresión de miRNAs [52], nuestro estudio se centró principalmente en las diferencias de miRNAs entre diferentes muestras y estas diferencias son, por lo tanto probable que sea real. Tomados en conjunto, los datos obtenidos en este estudio deben ser útiles para la delineación de miRNAs con propiedades oncogénicas que están involucrados en el desarrollo de la metástasis del cáncer de próstata
.
El mayor lee en las dos bibliotecas de ARN se observaron para miR 148a. La expresión de este miRNA es andrógeno-inducible en células LNCaP [53]. Esto sugiere que la relativamente alta expresión de miR-148a que se encuentra en las dos bibliotecas es el resultado de la administración de suplementos de testosterona de los animales
.
De los 104 miRNAs que resultaron ser hacia abajo o hasta reguladas en el xenoinjertos de cáncer de próstata metastásico, con relación a sus homólogos no metastásicos, 39 habían sido previamente informado a participar en el cáncer de próstata (Tabla 5,6,7). Estos informes se basan principalmente en la comparación de las expresiones de los genes miARN en tejidos de cáncer de próstata en comparación con los tejidos normales de la próstata sin definir la capacidad metastásica de las muestras malignas. Es de interés que 21 de los 39 miRNAs mostraron abajo o hacia arriba-regulaciones en los xenoinjertos metastásicos que han concordado con los reportados para los tejidos de cáncer de próstata (en relación con los tejidos benignos), lo que sugiere que estos tejidos con cáncer de próstata pueden haber tenido la capacidad metastásica. De los miRNAs encontrado que son las reguladas en los xenoinjertos metastásicos, miR-16, que muestra a & gt; disminución de 17 veces en la expresión, se ha informado de que las reguladas en el cáncer de próstata [23], [24] y tener una función de supresión de la metástasis. Por otra parte, el crecimiento del tumor de próstata metastásico
in vivo
puede ser inhibida por la administración sistémica de los genes miARN-16 sintético [25]. La reducción de expresión de miR-34a en la línea de xenoinjerto metastásico es consistente con su inhibición de metástasis de cáncer de próstata [33]. La menor expresión de miR-126 * está de acuerdo con informes de que este miARN es el regulado en la metástasis del cáncer de próstata [34] y que la expresión ectópica de miR-126 * inhibe la migración y la invasión de células de cáncer de próstata [34]. El último es un ejemplo de un miARN * jugando un papel como un supresor tumoral. Curiosamente, el miR-126, un miARN reporta como las reguladas en el cáncer de próstata en relación con el tejido normal de la próstata [54], fue hasta reguladas en la línea de xenoinjerto metastásico. Lee et al.