Extracto
Muchos fármacos contra el cáncer están destinadas a eliminar las células cancerosas mediante la inducción de la apoptosis. Sin embargo, los ensayos de potencia utilizados para medir la bioactividad de estos productos son generalmente ensayos de viabilidad celular que no distinguen entre la muerte celular y la inhibición del crecimiento. Aquí se describe un biosensor de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia basado en células (FRET) diseñado para medir la bioactividad de la apoptosis induciendo medicamentos contra el cáncer. El biosensor contiene proteína fluorescente cian (CFP) unido a través de la caspasa 3 y caspasa 8 secuencias de reconocimiento de escisión específica a la proteína fluorescente amarilla (YFP). Tras la activación de la caspasa, como en el caso de la inducción de la apoptosis, el ligador se escinde la supresión de la señal de FRET celular. Este ensayo refleja fielmente el mecanismo de acción de fármacos contra el cáncer, en matar las células cancerosas y por lo tanto puede funcionar como una prueba de potencia para diferentes medicamentos contra el cáncer. Rigurosamente demostrar esto a través de la caracterización de una clase de proteínas dirigidas a los receptores de muerte. El ensayo de una etapa parece ser superior a otros ensayos basados en la apoptosis debido a su simplicidad, comodidad y solidez
Visto:. Bozza WP, Di X, K Takeda, Rivera Rosado LA, Pariser S, Zhang B (2014) el uso de una forma estable Expresado FRET biosensor para determinar la potencia de medicamentos contra el cáncer. PLoS ONE 9 (9): e107010. doi: 10.1371 /journal.pone.0107010
Editor: Xu Wei, de la Universidad de Wisconsin - Madison, Estados Unidos de América
Recibido: 28 de abril de 2014; Aceptado: August 10, 2014; Publicado: 4 Septiembre, 2014
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Disponibilidad de datos:. Los autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos se incluyen dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Administración de Alimentos y Medicamentos, Centro para la Evaluación e Investigación de Medicamentos, Critical Path Initiative Fund; y la Administración de Alimentos y Medicamentos, Centro para la Evaluación e Investigación de Medicamentos, el fondo de la Iniciativa de contramedidas médicas. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la potencia es una medida de la actividad de un fármaco en términos de concentración o cantidad requerida para producir un efecto biológico definido [1]. Por lo tanto, un ensayo de potencia debe ser diseñado para reflejar tanto como sea posible los mecanismos de acción de un fármaco. Para los medicamentos oncogénicos, que están destinados a eliminar las células cancerosas, un ensayo de potencia sería una medida de la citotoxicidad del fármaco en las células cancerosas. Históricamente, muchos agentes quimioterapéuticos se identificaron mediante cribado de alto rendimiento de bibliotecas de compuestos utilizando ensayos de viabilidad celular con MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) u otros tintes relacionados [2], [3]. Este formato de ensayo ha sido ampliamente adoptado como una prueba de potencia en el desarrollo de fármacos contra el cáncer. Sin embargo, los ensayos de viabilidad celular no pueden distinguir entre la muerte celular y efectos detención del crecimiento, dejando una advertencia en la evaluación de la verdadera bioactividad de un medicamento contra el cáncer. Como el objetivo de la terapia del cáncer es destruir las células cancerosas, es fundamental para evaluar la capacidad de un fármaco para inducir la muerte de células de cáncer. La forma de muerte celular más comúnmente asociado con el tratamiento del cáncer, tanto
in vivo
y
in vitro
es la apoptosis, o muerte celular programada.
Una característica distintiva de la apoptosis es la activación de las proteasas caspasas, lo que resulta en la escisión de proteínas estructurales y la formación de cuerpos apoptóticos [4]. Hay dos vías distintas, a saber intrínsecas y extrínsecas, que conducen a la activación de la caspasa en respuesta a un tratamiento con fármacos. quimioterapias clásicas tales como etopósido, compactina, fluorouracilo (5-FU), taxol, y camptotecina inducir la activación de la caspasa 3 de una manera dependiente de p53 [5] - [7], que a menudo implica alteraciones mitocondriales. Por el contrario, una nueva clase de proteínas dirigidas a los receptores de muerte expresadas en la superficie celular están en desarrollo [8] - [11]. Estas proteínas incluyen el factor de necrosis tumoral humano recombinante (TNF) variantes, ligando relacionado con TNF inductor de apoptosis (TRAIL) y de los receptores de muerte anticuerpos agonistas. TRAIL se une al receptor de muerte 4 y /o 5 (DR4 /5) y posteriormente induce el montaje de una proteína asociada a Fas proteína adaptadora que contiene induce a la muerte complejo de señalización (DISC) con dominio de muerte (FADD) y pro-caspasa 8. Dentro el disco, pro-caspasa 8 se activa por la auto-escisión y se libera en el citosol, en el que se activa la caspasa 3. En algunos tipos de células, la señalización de apoptosis se amplifica aún más
vía
la mitocondria como resultado de la translocación de la caspasa 8 escisión mediada de Oferta (BH3-proteína de dominio interactuar). Por lo tanto, la potencia de un fármaco contra el cáncer se puede evaluar mediante la medición de la magnitud de la actividad de la caspasa en las células tratadas. Un enfoque en la medición de la actividad de caspasa ha sido el uso de sondas fluorescentes que contienen sustratos de caspasa, se presentan los cambios en la intensidad de la fluorescencia tras la activación de la caspasa [12] - [16]. Alternativamente, las caspasas activas pueden ser detectados por análisis de inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos de la forma escindida de la enzima individuo [14], [17] - [19]. Sin embargo, estos ensayos pueden estar asociados con una gran variabilidad debido a los procedimientos de operación complejos. En este estudio, hemos desarrollado un ensayo de FRET a base de células para probar la potencia de los productos de cáncer. La sonda FRET contiene secuencias de reconocimiento para los dos caspasa 3 y caspasa 8 y se encontró que era sensible a fármacos contra el cáncer que actúan a través de vías intrínsecos o extrínsecos. Cabe destacar que con la sonda FRET expresada de forma estable, la respuesta inducida por el fármaco se controla directamente en las células tratadas y sin pasos de procesamiento adicionales. Por otra parte, el ensayo FRET detecta las células sometidas a la apoptosis con marcada sensibilidad y simplicidad experimental, por lo que es un ensayo de potencia prometedora para la evaluación de medicamentos contra el cáncer.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y reactivos
línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231 se adquirió en la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Un plásmido pCMV6-AC para la expresión de una proteína de fusión (552 aminoácidos) que contiene proteína de longitud completa cian fluorescente (CFP) y proteína amarilla fluorescente (YFP) unido a través de una secuencia de reconocimiento de caspasa se adquirió de OriGene (Rockville, MD). El enlazador entre CFP y YFP contiene dieciséis aminoácidos, GSGDEVDGGIETDGSG, que pueden ser escindidos por caspasa activado 3 en G ↓ DEVD o la caspasa 8 en G ↓ IETD, donde ↓ indica el sitio de corte de proteasa. La secuencia de ADNc de codificación (1656 pares de bases) para la proteína de fusión CFP-enlazador-YFP se clonó en el vector pCMV6-AC en Sgf I y Mlu I sitios de restricción, y el constructo correcto fue verificado por secuenciación de nucleótidos. El plásmido se transfectó en células MB231 utilizando Lipofectamine reactivo 2000 por las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se seleccionaron las células transfectadas contra la neomicina (G418) a 1 mg /ml (Corning Cellgro, Manassas, VA). clones resistentes a G418 fueron recogidos usando cilindros de clonación (Millipore, Temecula, CA) y se ensayaron para los niveles de intensidad de fluorescencia y de expresión de proteínas. El clon estable con los más altos niveles de expresión de la sonda CFP-enlazador-YFP, denominado como MB231_CFP-YFP, se utilizó en los siguientes ensayos. Las células se mantuvieron en DMEM /F-12 50/50 medio suplementado con 5% de FBS, 4 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, y 0,4 mg /ml de sulfato de G418. células MB231 parental se cultivaron en el mismo medio sin la adición de sulfato de G418. Tanto TRAIL humano recombinante (rhTRAIL, Cat#375-TEC) y un agonista monoclonal anticuerpo (Cat#MAB631) específico para el receptor de muerte 5 se adquirieron de amp I +; D Systems (Minneapolis, MN). El rhTRAIL existe como un homotrímero, donde cada monómero consiste en los aminoácidos 114-281 del dominio extracelular nativa de TRAIL humano. La estaurosporina se adquirió de ApexBio (Boston, MA). La camptotecina y etopósido se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO). 5-FU se adquirió de Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY). La compactina se adquirió de Santa Cruz (Dallas, Texas). Taxol se adquirió de Calbiochem (La Jolla, CA).
viabilidad de las células de ensayo
La viabilidad celular se determinó utilizando un (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5 3- -diphenyltetrazolium bromuro (MTT) ensayo colorimétrico como se describe anteriormente [20]. En pocas palabras, 1,0-2,0 × 10
4 células se sembraron en cada pocillo de microplacas de 96 pocillos. Las células se trataron luego con el agente citotóxico. Después del tratamiento de drogas, los medios de cultivo celular se aspiró y MTT (2 mg /ml en tampón PBS) se añadió entonces a cada pocillo y se incubó durante 2 horas a 37 ° C. a continuación, el sobrenadante se aspiró y el producto formazan insoluble se disolvió en DMSO. Absorbancia para la tinción de formazán se midió a 562 nm usando un SpectraMax Plus 384 lector de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Relativa DO
562 para cada pozo se representó frente al valor del logaritmo de la concentración del agente citotóxico en el molar. CE
50 valores fueron determinados mediante el ajuste de la curva dosis-respuesta a la ecuación 1, Y = Inferior + (Superior-Inferior) /(1 + 10∧ ((LogEc
50-X) * ladera)), utilizando el software GraphPad Prism. X es el logaritmo de la concentración del agente citotóxico en molar e Y es el valor de absorbancia medido. Cada punto de datos se repitió por triplicado.
La citometría de flujo
3.0 × 10
5 células fueron cultivadas en cada pocillo de placas de 6 pocillos. Las células se trataron con TRAIL o anticuerpo anti-DR5. Las células se recogieron a continuación, se tiñeron con anexina-V-APC (eBioscience, San Diego, CA) y yoduro de propidio (PI, St Louis, MO), y se analizaron usando un flujo BD Accuri C6 citómetro (BD, Franklin Lakes, NJ) [ ,,,0],21].
se realizó un análisis por inmunotransferencia
Western blot como se describe anteriormente [19]. Brevemente, las células se lisaron usando tampón RIPA [0,5 M Tris-HCl (pH 7,4), 1,5 M NaCl, ácido 2,5% desoxicólico, 10% NP-40, EDTA 10 mM, y cóctel inhibidor de proteasa] (EMD Millipore, Darmstadt, Alemania ). Los restos celulares se eliminaron por centrifugación y la cantidad total de proteína se determinó por ensayo BCA (Pierce, Rockford, IL). la misma cantidad de proteínas (30 g) se resolvió por SDS-PAGE utilizando NuPAGE 4-12% de gradiente Bis-Tris geles (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transfirieron a membranas de PVDF. Los anticuerpos específicos para PPC y YFP eran de Covance (Gaithersburg, MD), los anticuerpos específicos para la caspasa 8 y caspasa 3 eran de Señalización Celular (Danvers, MA), y los anticuerpos específicos para actina eran de Santa Cruz (Dallas, TX). anti-ratón conjugado con peroxidasa, anti-conejo, o IgG anti-cabra se utilizaron como anticuerpos secundarios. detección inmunoblot se visualizó mediante quimioluminiscencia Western Immobilon HRP Sustrato (Millipore, Billerica, MA) y un sistema de cámara CCD LAS-4000 (Fujifilm, Edison, NJ).
Cell basado en FRET ensayo de citotoxicidad
1.8-5.4 × 10
4 células MB231_CFP-YFP se cultivaron en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos negro. Después las células fueron cultivadas durante la noche, medios de cultivo celular se aspiró y se añadió tampón PBS que contenía agente citotóxico (TRAIL, anticuerpo anti-DR5, o estaurosporina) a células adheridas para los puntos de tiempo indicados. Debido a la exigencia de un período de incubación más largo para el tratamiento de la camptotecina, se trataron las células con medio DMEM que contiene el fármaco citotóxico durante 48 h antes de la sustitución del medio con tampón PBS y permitiendo que la incubación de proceder durante 24 horas adicionales. Este procedimiento también se realizó para etopósido, compactina, 5-FU, y taxol. Después del tratamiento fármaco se determinó la señal de FRET de cada muestra usando un lector de placas de fluorescencia FluoDia T70 (PTI, Edison, NJ). Las células tratadas estaban emocionados utilizando un filtro de excitación de 425 ± 10 nm. Para la determinación de FRET, después de la sustracción del fondo, se calcularon las tasas de emisión de YFP (530 ± 5 nm filtro) y PPC (486 ± 5 nm filtro). Los valores de FRET se normalizaron y se representó frente al valor del logaritmo de la concentración del agente citotóxico en molar utilizando software GraphPad Prism. CE
50 valores se determinaron a través de ajuste de curva no lineal a la ecuación 2, Y = 100 /(1 + 10∧ ((LogEc
50-X) * Pendiente colina)). X es el logaritmo de la concentración del agente citotóxico en molar e Y es el valor FRET normalizado. Cada punto de datos se repitió por triplicado para un solo experimento y cada experimento se repitió de forma independiente al menos dos veces.
Caracterización bioquímica de la sonda FRET
Para caracterizar la expresión de PPC-enlazador-YFP sonda , la proteína expresada se aisló utilizando anticuerpo anti-CFP /YFP. En pocas palabras, 1,2 × 10
se cosecharon 6 células MB231_CFP-YFP y se lisaron en 1 ml de tampón de lisis inmunoprecipitación Pierce. 25 l de anticuerpo anti-PPC /YFP conjugados con Sepharose (Abcam, Cambridge, MA) se hizo girar con el lisado celular libre de escombros durante 3 horas a 4 ° C. Después de lavar con tampón de lisis, sonda enlazador-YFP FRET PPC-unida se eluyó con tampón Tris 50 mM (pH 8,5) que contiene 1 M de NaCl. Inmediatamente después de la elución de la proteína se diluyó con tampón de Tris para dar una concentración final de NaCl de 300 mM. la pureza de proteína se visualizó mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie y por análisis de inmunoblot utilizando anticuerpos específicos para PPC y YFP (descrito anteriormente).
En
in vitro
los ensayos de FRET, inmuno-purificado PPC sonda enlazador-YFP FRET se incubó con caspasa activa 3, caspasa 8, o caspasa 2 (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN) durante 3 horas a 25 ° C en tampón de PBS que contenía DTT 1 mM utilizando negro de microplacas de 96 pocillos. Como control también se añadió Z-VAD para algunas reacciones. FRET se midió como se ha descrito anteriormente.
La microscopía confocal
1,5 × 10
4 células MB231_CFP-YFP se cultivaron en 4 sistemas de recubrimientos de vidrio de borosilicato y con cámaras (Nunc, Rochester, NY) durante una días antes del experimento. Las células se trataron con diversas concentraciones de TRAIL (0-25 ng /ml) durante 2,5 h antes de formación de imágenes. Las células se obtuvieron imágenes con una lente objetivo de 63x y un Observador de la célula Zeiss Spinning sistema de disco microscopio confocal (Thornwood, NY) con una cámara ambiental PECON. FRET eficiencia se determinó mediante la detección de la emisión sensibilizada [22], [23]. líneas de láser de excitación con una longitud de onda de 458, 514 y 458 nm se utiliza para el donante PPC, aceptador de YFP, y FRET canales, respectivamente. El filtro de emisión para el PPC fue 485/30, mientras que el filtro de emisión de YFP FRET y fue 535/30. divisor de haz dicroico para la cabeza Yokogawa confocal de barrido fue RIFT 457/514/647 nm. Después de obtener los factores de corrección para PPC expresan en forma sencilla y YFP, imágenes de células fueron adquiridas para las células MB231_CFP-YFP a través de PPC, YFP, y FRET canales de una manera idéntica. Los conjuntos de datos de 9 imágenes se almacenan en formato zvi para el análisis cuantitativo futuro. software Zeiss Axiovision (Ver. 4.8.2) se utilizó para la emisión sensibilizada medición FRET. La eficiencia de FRET se calculó basándose en un sistema de tres filtro, que se normalizó contra donante y aceptor de intensidades, lo que permite el cálculo de la diafonía y la verificación de la verdadera señal de FRET [24], [25]. El valor de la eficiencia de FRET se calculó según la fórmula de Xia [24]. Tres imágenes seleccionadas al azar se obtuvieron para cada experimento. A partir de estas imágenes se calculó la eficiencia de FRET. De dos a tres regiones de interés (ROI) se colocaron para una célula respectiva y de diez a quince ROIs se sometieron a análisis FRET.
Resultados
Generación de un biosensor FRET basado en células
MB231 células humanas de cáncer de mama fueron transfectadas de forma estable con una proteína de fusión PPC-enlazador-YFP expresión plásmido que codifica (MB231_CFP-YFP), en el que las funciones de la PPC como un donante y YFP como un aceptor de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). El enlazador contiene ambas secuencias de caspasa 3 y caspasa 8 de reconocimiento, DEVD y IETD respectivamente, que se espera que sean sensibles a los fármacos funcionamiento
a través de cualquiera de las vías de apoptosis
intrínsecos o extrínsecos. Tras la activación de la caspasa después del tratamiento de drogas, el enlazador que conecta PPC y YFP se escindió y, posteriormente, hará que una pérdida de señal de FRET celular. Esta metodología permite una potente biosensor FRET que sirve como un marcador de la apoptosis (Figura 1A). La línea de células MB231 fue elegido como un sustrato de células porque se ha demostrado que es totalmente susceptible a una variedad de agentes citotóxicos, lo que implica la integridad funcional de la maquinaria de apoptosis [3], [18]. Se espera que una plataforma Tal celular para ser útil para el análisis de la potencia de diferentes medicamentos contra el cáncer.
(A) vista esquemática de ensayo FRET. La sonda FRET, CFP-enlazador-YFP, se expresa como una proteína de fusión que contiene PPC y YFP unido a través de una secuencia peptídica de 16 aminoácidos: GSGDEVDGGIETDGSG. La región de engarce contiene secuencias de reconocimiento para la caspasa 3 (DEVD) y la caspasa 8 (IETD), que puede escindirse selectivamente por sus respectivos enzimas a la inducción de vías de apoptosis intrínsecos y /o extrínsecos. (B) Análisis de inmunotransferencia de la sonda PPC-enlazador-YFP FRET expresada de forma estable en las células MB231. (C) Las células que expresan la sonda enlazador-YFP FRET PPC-produjeron una señal significativa y estable FRET, las células se incubaron en tampón PBS durante 0-24 h. (D) La sonda de enlazador-YFP FRET PPC-fue inmunopurificado a partir de lisado de células MB231_CFP-YFP y se visualizaron por SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie (arriba) o por análisis de inmunotransferencia (abajo). Los cambios (E) en FRET fueron monitorizados cuando 100 nM purificó PPC-proteína enlazador-YFP se incubó con 100 nM de caspasa activa recombinante 3 (C3), caspasa 8 (C8), o de la caspasa 2 (C2) durante 3 h. pvalues se determinaron mediante la prueba t de Student.
En primer lugar confirmó la expresión de la sonda enlazador-YFP FRET PPC-mediante análisis de inmunotransferencia, usando un anticuerpo primario que reconoce PPC y YFP. Se observó una fuerte banda específica a la proteína intacta CFP-enlazador-YFP (esperado de peso molecular 55 kDa) en el lisado de células MB231_CFP-YFP pero no células parentales (Figura 1B). A continuación se determinó si las células MB231_CFP-YFP podrían proporcionar una señal de FRET razonable. Con el fin de eliminar la inferencia a partir de componentes de medios, medios de cultivo celular se aspiró de las células MB231_CFP-YFP adheridas a microplacas de 96 pocillos. tampón de PBS se añadió a cada señal bien y la FRET se calculó tomando la relación entre la emisión de fluorescencia del aceptor (530 ± 5 nm) y la emisión de fluorescencia del donador (486 ± 5 nm) cuando las muestras eran excitado a 425 ± 10 nm usando una fluorescencia lector de placas. De hecho, en estas condiciones se detectó una señal de FRET significativa para las células MB231_CFP- YFP (Figura 1C). En particular, se encontró que la sonda FRET para ser estable en las células sumergidas en tampón PBS durante hasta 24 horas (Figura 1C). Como control, las células MB231 parentales no transfectadas se ensayaron en paralelo, que no produce ninguna señal de fluorescencia significativa por encima del ruido de fondo cuando se excita a 425 ± 10 nm.
La inmunoprecipitación de la sonda CFP-enlazador-YFP FRET se realizó para confirmar su selectividad para la caspasa 3 y caspasa 8 división. sonda enlazador-YFP FRET PPC-se purificó a partir del lisado celular utilizando el anticuerpo anti-CFP /YFP conjugado a perlas de sefarosa. sonda FRET unida se eluyó utilizando tampón Tris que contenía 1 M NaCl. sonda FRET aislado se caracterizó mediante SDS-PAGE con tinción de azul de Coomassie (Figura 1D, la parte superior) y análisis de inmunotransferencia (Figura 1D, la parte inferior). Para evaluar la especificidad de la caspasa, la sonda FRET purificado se incubó con formas recombinantes de la caspasa 3 activa, la caspasa 8 o caspasa 2. Los cambios en FRET fueron monitoreados (Figura 1 E). Como se esperaba la escisión de la sonda FRET era específico para la caspasa 3 y caspasa 8, y dio lugar a una disminución pronunciada en la señal de FRET. Consistentemente, la escisión de la sonda FRET fue completamente abolida cuando la mezcla de reacción se incubó con el inhibidor pan-caspasa (Z-VAD). Por el contrario, no se detectó prácticamente ninguna escisión de la sonda FRET cuando la sonda PPC-enlazador-YFP FRET se incubó con caspasa 2.
Calificación de la biosensor FRET para su uso en pruebas de potencia para las terapias contra el cáncer dirigidas receptor de muerte
Con la sonda FRET transfectadas de forma estable, primero a prueba su idoneidad en la medición de la potencia de una clase de proteínas que inducen apoptosis por la orientación de los receptores de muerte (DRS). Estos incluyen apoptosis recombinante humana relacionada con el TNF-ligando inductor (TRAIL) y anticuerpos agonistas a DR5, que están bajo desarrollo en múltiples ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer. Estos productos funcionan a través de DR4 y /o DR5 expresado en la superficie de las células diana. Una vez activado, el dominio de muerte intracelular facilita el montaje de pro-caspasa 8/10 y una proteína adaptadora FADD en un complejo de señalización de muerte inducir (DISC), que conduce a una activación secuencial de la caspasa 8 y caspasa 3. Por lo tanto, estos agentes sirven como excelentes sondas para poner a prueba el biosensor FRET ingeniería. Como se indica anteriormente para las células MB231 parentales [18], las células MB231_CFP-YFP conservan una susceptibilidad similar a anticuerpo TRAIL y anti-DR5. Esto se demostró primero por ensayos de viabilidad celular basado en MTT cuando las células fueron tratadas con concentraciones crecientes de TRAIL o anticuerpo anti-DR5. Se obtuvo una curva de dosis-respuesta similar y CE
50 valor para ambas células parental_MB231 y células MB231_CFP-YFP cuando son tratados con TRAIL o anticuerpo anti-DR5 (Figura 2A y la Tabla 1). Cuando se analizaron para la inducción de apoptosis, ambas líneas celulares muestran un aumento dependiente de la dosis similar en las células apoptóticas después del tratamiento con TRAIL o anticuerpo anti-DR5 (Figura 2B). Estos datos indican que la transfección de FRET biosensor no tuvo efecto sobre la respuesta celular a las terapias dirigidas-DR. La línea celular MB231_CFP-YFP estable apareció para retener maquinaria apoptosis intacta, apoyando así su uso como sustrato de células para el ensayo de la citotoxicidad de fármacos contra el cáncer.
(A) Parental MB231 (relleno negro) y MB231_CFP-YFP ( abrir células claras) se trataron con TRAIL (0-100 ng /ml) durante 2,5 h o anticuerpo anti-DR5 (0-200 mg /ml) durante 20 h, a las concentraciones indicadas. La viabilidad celular se determinó por el ensayo MTT. (B) Las células se trataron como en A y se analizaron para la apoptosis por citometría de flujo después de tinción con anexina-V-APC y yoduro de propidio (PI). los valores de p se determinaron mediante la prueba t de Student. CE
50 valores se determinaron utilizando apropiado como se describe en la sección Materiales y Métodos curva no lineal. Para cada CE
50 valor, el 95% se informó intervalos de confianza que refleja la precisión estadística en la Tabla 1.
A continuación, se evaluó la escisión de la sonda FRET en respuesta al tratamiento con TRAIL o anticuerpo anti-DR5. Con este fin, las células MB231_CFP-YFP se trataron con TRAIL y anticuerpo anti-DR5. El análisis por inmunotransferencia reveló una correlación entre la activación de la caspasa y escisión de la sonda CFP-enlazador-YFP FRET en todos los niveles de dosis (figura 3A y 3B).
Las células se trataron con (A) 0 a 300 ng TRAIL /ml para 2,5 horas o (B) 0 a 50 g /ml de anticuerpo anti-DR5 para 20 h. Las células resultantes se analizaron por anticuerpos específicos de transferencia a través de Western de la caspasa 3 (C3), caspasa 8 (C8), y CFP /YFP.
Para la medición de FRET, las células MB231_CFP-YFP se cultivaron en 96 así placas durante la noche en medio DMEM. Medio de cultivo celular se eliminó y el tampón de PBS que contiene diversas concentraciones de TRAIL o anticuerpo anti-DR5 se añadió a células adheridas durante 2,5 h y 20 h, respectivamente. En los tiempos indicados, las señales FRET se midieron directamente en muestras individuales con un ajuste de excitación de 425 ± 10 ajustes nm y emisión de 530 ± 5 nm para YFP y 486 ± 5 nm para CFP usando un lector de placas de fluorescencia. Una disminución dependiente de la dosis en FRET se identificó con concentraciones crecientes de TRAIL y anti-DR5 anticuerpo (Figura 4A y 4B). FRET valores se normalizaron y se representó frente al valor logarítmico de TRAIL y anti-DR5 concentración de anticuerpos en molar utilizando software GraphPad Prism (Figura 4A y 4B), produciendo CE
50 valores después de curva de ajuste no lineal a la ecuación 2 (Tabla 1). En particular, el ensayo FRET produjo CE valores
50 que son consistentes con los de ensayos convencionales (MTT, citometría de flujo, y el análisis de inmunotransferencia). En conjunto, estos datos apoyan el uso del ensayo de FRET a base de células para analizar la bioactividad de terapias dirigidas-DR. La microscopía confocal también se utilizó para evaluar el cambio en FRET celular cuando las células MB231_CFP-YFP se trataron con TRAIL (Figura 4C). Un cambio pronunciado de YFP emisión del aceptor (amarillo) para la emisión del donador PPC (cian) puede ser observado para las células tratadas con el aumento de la concentración de TRAIL con un ajuste de excitación = 458 nm.
Células
MB231_CFP-YFP se trataron con ( a) 0-300 TRAIL ml /ng durante 2,5 h y (B) 0 a 100 mg de anticuerpo anti-DR5 /ml durante 20 h. FRET se calculó y se representa usando gráficos de barras en la parte izquierda del panel. CE
50 valores se determinaron por la curva no lineal de ajuste a los valores normalizados de FRET representa frente a los valores de registro de TRAIL y la concentración de anticuerpo anti-DR5 en molar (lado derecho del panel). imágenes (C) de microscopía confocal muestra los cambios en FRET en las células MB231_CFP-YFP tratados con TRAIL 0-25 ng /ml durante 2,5 h. Un cambio pronunciado de YFP emisión del aceptor (amarillo) para la emisión del donador PPC (cian) puede ser observado para las células tratadas con el aumento de la concentración de TRAIL, con una excitación configuración = 458 nm. El análisis estadístico se realizó como en la Fig. 1 y 2.
Aplicación del ensayo FRET basado en células para evaluar la bioactividad de las quimioterapias de cáncer
Nos preguntamos si la sonda FRET ingeniería podría ser adaptado para el análisis de fármacos de moléculas pequeñas que funcionar a través de la modulación de las vías de señalización de la apoptosis intrínsecas. Muchos medicamentos de quimioterapia clásicos caen dentro de esta categoría. Primero probamos estaurosporina y camptotecina, ya que ambos son conocidos por ser potentes inductores de la apoptosis en diferentes tipos de células [7], [26]. Con este fin, las células MB231_CFP-YFP se trataron con estaurosporina o camptotecina. Una disminución dependiente de la dosis en FRET se observó con concentraciones crecientes de cada agente individual (Figura 5A). curva de ajuste no lineal producida CE
50 valores que, en particular, son comparables con los obtenidos mediante el análisis MTT (Figura 5B, Tabla 1). Hemos ampliado el estudio para incluir varios otros fármacos quimioterapéuticos, incluyendo etopósido, compactina, 5-FU, y taxol. Estos fármacos funcionan a través de estrés genotóxico y citoesqueleto y conducen a la inhibición del crecimiento posterior y /o la muerte celular apoptótica, dependiendo de las condiciones experimentales y las células diana [5] - [7]. En consonancia, se identificaron cambios en la señal de FRET observable cuando las células MB231_CFP-YFP fueron tratados con cada agente de quimioterapia (Figura 5C). Sin embargo, su capacidad para inducir la apoptosis de la caspasa 3/8 dependiente parecía ser mucho más baja que la de TRAIL o anticuerpo anti-DR5, lo que requiere tanto una alta concentración (100 mg /ml) y períodos de incubación más largos (72 h) en comparación con la potencia de TRAIL (CE50 ~0.05-0.08 nM) y anti-DR5 (CE50 ~0.24-0.80 nM). Estos datos demuestran la capacidad de la sonda FRET celular en la cuantificación de la actividad inductora de apoptosis de ambos agentes biológicos y quimioterapéuticos. Por condiciones experimentales de ajuste, los ensayos FRET se pueden utilizar para comparar directamente la bioactividad in vitro de diferentes medicamentos contra el cáncer.
células (A) MB231_CFP-YFP se trataron con 0-100 g estaurosporina /ml para 20 h y 0 a 1,7 mg de camptotecina /ml durante 72 h. cambios dependientes de la dosis en las señales de FRET se determinaron como en la Fig. ensayo 4. (B) MTT se utilizó para evaluar la viabilidad celular en respuesta al tratamiento de parental_MB231 (relleno negro) y MB231_CFP-YFP (abrir claro) células con 0-25 g estaurosporina /ml durante 20 h y 0 a 7,7 g /ml camptotecina durante 72 h, respectivamente. las células (C) MB231_CFP-YFP se trataron con los agentes de quimioterapia (100 mg /ml) durante 72 h. medición y el análisis FRET se realizó como en la Fig. 4. El análisis estadístico se realizó como en la Fig. 1 y 2.
Discusión
Hemos desarrollado un biosensor FRET a base de células para medir la actividad de los fármacos que inducen la apoptosis. Nuestro ensayo FRET parece ser superior a otros ensayos de apoptosis utilizadas comúnmente, dado su simplicidad, la estabilidad, conveniencia, y robustez. Anticipamos que dadas estas ventajas, la expresó de forma estable sonda FRET puede ser adaptado para su uso en futuros estudios de descubrimiento y desarrollo de fármacos pertinentes.
El objetivo de la terapia del cáncer es matar las células cancerosas. Por lo tanto, un ensayo de potencia debe ser diseñado para reflejar mecanismo de la droga de la acción es decir, la inducción de apoptosis u otras formas de muerte celular. La apoptosis es una forma común de muerte celular asociada con el tratamiento del cáncer, tanto
in vitro
y
in vivo
. Hay varios métodos disponibles para la detección y la medición de la apoptosis, incluyendo citometría de flujo, microscopía, inmunotransferencia, y los ensayos basados en sustrato de caspasa [14], [27] - [29]. Estas metodologías son poderosas herramientas de investigación en el estudio de apoptosis, pero cada método se asocia con limitaciones inherentes, incluyendo pero no limitado a la incapacidad para optimizar de una manera de alto rendimiento, la variabilidad asociada con la permeabilidad celular de los materiales necesarios para una señal de lectura, un requisito de la célula lisis, y el ruido de fondo de alta [17]. Debido a estas limitaciones existe todavía la necesidad de un ensayo de apoptosis estándar y robusto. Aunque varios grupos han informado de la expresión celular de una proteína de fusión basada en GFP que puede actuar como un sustrato de caspasa y detectar cambios en FRET celular tras la inducción de la apoptosis, los métodos de detección en estos casos se basó principalmente en la microscopía confocal y citometría de flujo [15], [ ,,,0],30] - [33]. Mientras que proporciona una valiosa información este procedimiento operativo no es ideal para un ensayo de potencia rendimiento robusto y alto. Cabe destacar que hay ejemplos dispersos reportado que utilizan un formato de placa de rendimiento [34], [35]. Nuestro ensayo FRET basado en células permite una detección sin precedentes tanto de la actividad de caspasa 3 y caspasa 8 en un formato de microplacas usando una línea celular de cáncer de mama humano. Esta combinación permite la caspasa para la caracterización de cualquier agente que puede inducir la apoptosis a través de la vía intrínseca o extrínseca o ambos. También nuestra metodología se ha adaptado de forma única para eliminar el fondo de auto-fluorescencia asociada con medios de cultivo celular; esto ayuda a lograr una mejor relación señal-ruido y evita sustracciones altos de antecedentes que pueden complicar los cálculos FRET. Además de nuestro trabajo se ha centrado rigurosamente sobre la idoneidad del ensayo descrito en el que funciona como una prueba de potencia para los fármacos de proteínas complejas que se dirigen a los receptores de muerte, mientras que otros trabajos se han centrado principalmente en el descubrimiento de fármacos de moléculas pequeñas.
Una limitación de nuestro ensayo está relacionada con la disponibilidad de diana molecular (s) en las células MDA-MB-231 de una molécula de fármaco específico. Por ejemplo, se sabe que las células MDA-MB-231 para ser deficientes en la expresión del receptor Her2 con lo que el ensayo inutilizable para la evaluación de los anticuerpos monoclonales anti-HER2 que están aprobados para su uso en el tratamiento de cáncer de mama.