Extracto
Los GLI (GLI1 /GLI2) factores de transcripción han estado implicados en el desarrollo y progresión del cáncer de próstata, aunque nuestra comprensión de la forma en que realmente contribuyen a la biología de estos tumores comunes es limitada. Hemos observado que la actividad de reportero GLI fue mayor en las células independientes de andrógenos normal (PNT-2) y tumorigénico (PC-3 y DU145) en comparación con las células de cáncer de próstata LNCaP dependientes de andrógenos y, en consecuencia, los niveles de ARNm de GLI también fueron elevadas. La expresión ectópica de GLI1 o el mutante ΔNGLI2 constitutivamente activa indujo una morfología de adoquines-como distinta en células LNCaP que, con respecto a la primera, correlacionado con el aumento GLI2 así como la expresión de los basales /tallo-como marcadores CD44, β1-integrina, ΔNp63 y IMC1, y la disminución de la expresión del marcador de luminal AR (receptor de andrógenos). células LNCaP-Gli1 eran viables en presencia de la bicalutamida inhibidor de AR y la expresión de genes de perfiles revelaron que el transcriptoma de células LNCaP-Gli1 fue significativamente más cerca de DU145 y células PC-3 que con las células control LNCaP-PBP (vector vacío), como así como la identificación LCN2 /NGAL como una transcripción altamente inducida que se asocia con independencia de la hormona en el cáncer de mama y de próstata. Funcionalmente, las células LNCaP-GLI1 muestran un mayor crecimiento clonal y eran más invasivas que las células de control, pero que no forman colonias en agar blando o prostaspheres en suspensión lo que sugiere que no poseen propiedades inherentes de células madre. Por otra parte, la supresión de GLI1 o GLI2 con siRNA dirigidos no invertir el fenotipo transformado de las células LNCaP-Gli1 ni tampoco dobles caídas GLI1 /GLI2 activan AR expresión en DU145 o células PC-3. Como tal, a principios de la orientación de las oncoproteínas GLI puede dificultar la progresión a un estado independiente de hormonas pero una comprensión más detallada de los mecanismos que mantienen se requiere este fenotipo para determinar si su inhibición mejorará la eficacia de la terapia anti-hormonal a través de la inducción de una fenotipo luminal y una mayor dependencia de la función AR
Visto:. Nadendla SK, Hazan A, Ward, M, Harper LJ, Moutasim K, Bianchi LS, et al. (2011) GLI1 confiere cambios fenotípicos profundo en las células LNCaP cáncer de próstata que se incluye la obtención de un estado independiente de la hormona. PLoS ONE 6 (5): e20271. doi: 10.1371 /journal.pone.0020271
Editor: James McCubrey, Universidad de Carolina del Este, Estados Unidos de América
Recibido: 8 Febrero 2011; Aceptado: 18 de abril de 2011; Publicado: 25 de mayo de 2011
Derechos de Autor © 2011 Nadendla et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue principalmente (y generosamente) apoyado por el Régimen de la Universidad de Middlesex Matched Financiación (SKN), Acción de próstata http://www.prostateaction.org.uk/(SKN y AH: Grant códigos G2007 /55, G2008 /G2009 y 07/30 ) y Barts y The London Caridad http://www.bartsandthelondoncharity.org.uk/(BSG). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es el cáncer más común en los hombres y, aunque inicialmente los tumores responden bien al tratamiento anti-hormonal, el hecho de que muchos tumores adquieren resistencia a esta forma de terapia proporciona un obstáculo importante en el tratamiento de las formas avanzadas de la enfermedad. Aunque los factores exactos que inician CaP siguen sin estar claros, numerosos estudios han descrito lesiones genéticas y los mecanismos de señalización aberrantes que pueden contribuir a la formación y progresión del tumor, y los que ayudan a conferir independencia de andrógenos son de particular interés, ya que pueden representar nuevos objetivos para la intervención terapéutica ( revisado en [1]).
al igual que con muchas formas de tumores, el papel de las células madre de cáncer (CSC) ha recibido una considerable atención en el CaP biología, particularmente con respecto a la iniciación del tumor, sino también la progresión y diseminación metastásica (revisado en 2]). Como los tumores de próstata muestran un fenotipo incluyendo la expresión AR predominantemente luminal, se cree que derivan de células secretoras luminales. Sin embargo, en base a perfiles de CD y la expresión de citoqueratina, características basales similares se han identificado en los tumores primarios y podrán aumentar en metastásico y tumores hormono-refractario [3], [4]. Además, las células basales /madre-como aislados de ambos tumores primarios y líneas celulares de cáncer muestran una mayor tumorigenicidad en los experimentos de xenoinjerto de ratón [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Por el contrario, Vander Griend et al [11] propuso que la célula de cáncer iniciadoras puede ser una célula AR-expresando intermedio que "adquiere actividad tallo-like" y la heterogeneidad de CaP se pone de relieve adicionalmente por estudios de modelos de ratón: Wang et al [12] describe una población de células madre luminal rara (que expresa Nkx3-1) que puede dar lugar a tumores, mientras que Lawson et al [13] encontró que las células madre epiteliales basales se transformaron de manera más eficiente.
Hedgehog (HH) señalización representa una vía de desarrollo importante que está implicada en la formación y progresión de numerosos tipos de tumores incluyendo las de la piel, de mama, páncreas, cerebro y pulmón. la señalización de HH, mediado predominantemente por el GLI aguas abajo (en referencia a los dos GLI1 y GLI2) factores de transcripción, está vinculado a la génesis tumoral a través de la regulación de diversos mecanismos tales como la proliferación, la diferenciación, la apoptosis, la migración /invasión y el mantenimiento de poblaciones CSC (revisado en [14], [15], [16]).
los estudios recientes han descrito la activación de la señalización de HH en el CaP aunque los resultados han sido a menudo contradictorios y el mecanismo (s) por el cual GLI contribuir a la neoplasia no son bien entendido (revisado en [17], [18]). Por ejemplo, varios estudios han defendido que el aumento de expresión GLI1 epitelial promueve la formación de tumores [19], [20], [21]. Por el contrario, Fan et al [22] observó ninguna diferencia significativa en los niveles de ARNm de SHH o GLI1 entre tumor y la zona emparejado tejido benigno y, más significativamente, que GLI1 se expresó en el estroma, pero no epitelial, componente de BPH y PCa. En cuanto el estado de enfermedad más avanzada, altos niveles de proteína SHH y mRNA GLI1 se han descrito en las muestras metastásicos y DHH, GLI1 y GLI2 se han relacionado con la transformación a un estado refractario a hormonas [21], [23], [24], [25]. Por otra parte, estudios recientes han establecido una relación entre la señalización de HH /GLI y AR en el dependiente de andrógenos (AD), la línea epitelial luminal de células de cáncer de próstata LNCaP y demostrado que GLI1 mantiene la viabilidad celular en ausencia de la actividad de AR [25], [26 ], [27], [28].
Aquí nos muestran que se observa una alta actividad de GLI en independiente de los andrógenos (AI) DU145 y líneas celulares de cáncer de próstata PC-3 epitelial y que GLI1 ectópico promueve la independencia de andrógenos en células LNCaP que se correlaciona con su transformación a un fenotipo más característico de DU145 y células PC-3. Sin embargo, la supresión GLI no promueve un fenotipo AD en DU145 o las células PC-3. Como tal, a principios de la orientación de las oncoproteínas GLI puede impedir la progresión a un estado independiente de la hormona, pero este enfoque puede no mejorar la eficacia de la terapia anti-hormonal en las células tumorales que han perdido la expresión del RA y que no dependen de su señalización para su viabilidad .
Resultados
Análisis de la expresión de GLI en células de cáncer de próstata
para investigar un posible papel de GLI en el cáncer de próstata, primero se determinó el nivel de actividad de reportero en varios GLI líneas celulares de próstata. actividad de reportero GLI fue mayor en el AI DU145 y líneas celulares de cáncer de próstata PC-3 en comparación con la línea celular de cáncer de próstata LNCaP y AD actividad de reportero fue también mayor en la línea epitelial normal de AI PNT-2 de células de próstata (Fig. 1A). En consecuencia, GLI1 y expresión GLI2 mRNA fue mayor en todas las líneas celulares de IA en comparación con las células LNCaP (Fig. 1B). Como tal, se analizó el efecto de la sobre-expresión de GLI1 y el mutante ΔNGLI2 activo sobre la biología de células LNCaP. El efecto más notable de GLI1 ectópico (eGLI1) y ΔNGLI2 relacionada con la morfología celular: en contraste con la morfología característica de tipo huso de células parentales o controlar LNCaP-PBP (vector vacío), a los pocos días las células después de la transducción /colonias con una morfología de adoquines similares fueron evidentes en las células LNCaP que sobreexpresan eGLI1 o ΔNGLI2 (Fig. 1C). Después de la selección de medicamentos, tanto en células LNCaP-ΔNGLI2 LNCaP-GLI1 y se habían transformado por completo la adopción de una morfología que recuerda a las células PNT-2 o DU145 (consulte la Fig. 5A para ver la morfología totalmente transformado). GLI1 ectópico y actividad de la proteína ΔNGLI2 se confirmó por la inducción de PTCH1 mRNA (Fig. 1D). Además, el ARNm endógeno GLI2 se indujo en las células LNCaP-Gli1 mientras que, inesperadamente, el ARNm endógeno GLI1 fue suprimida en las células LNCaP-ΔNGLI2 que revelan que el cambio morfológico puede ser mediada por GLI2 (Fig. 1E). Como DU145 y PC-3 células expresan altos niveles tanto de GLI1 y GLI2 comparación con las células LNCaP (Fig. 1B), se optó por investigar más a fondo la biología de las células LNCaP-GLI1.
(A) Análisis de GLI la actividad de luciferasa en diversas líneas de células independientes de andrógenos y en comparación con la línea celular LNCaP dependiente de andrógenos. (B) análisis de PCR cuantitativa de los niveles de Gli1 y ARNm GLI2 en las líneas de células independientes de andrógenos y en comparación con las células LNCaP (C) células Cobblestone-como /colonias emergen en las células LNCaP con GLI1 ectópico o expresión ΔNGLI2 (indicado por flechas). (D) qPCR análisis de la expresión de ARNm de PTCH1 en las células LNCaP y LNCaP-GLI1-ΔNGLI2. análisis (E) qPCR de la expresión de mRNA GLI2 en células LNCaP-Gli1 y expresión GLI1 mRNA en células LNCaP-ΔNGLI2. (F) La morfología de las células LNCaP que expresan EGFP no cambia cuando se co-cultivadas con células LNCaP-GLI1.
Inicialmente, se midió la actividad del indicador en las células LNCaP GLI-GLI1 y se demostró que en una nivel comparable con las células DU145 PC-3 y (fig. 1B, columnas cf. 2-4). Posteriormente, se ha discutido sobre si la capacidad de eGLI1 para inducir la morfología de adoquines-como en las células LNCaP fue a través de medios autónomos o si esto se requiere paracrina /señalización a través de moléculas secretadas por las células LNCaP-GLI1 yuxtacrina o no. La morfología de las células LNCaP que expresan EGFP no cambió cuando se co-cultivadas con células LNCaP-GLI1 revelando que la morfología de adoquines-como se induce de forma autónoma (Fig. 1F). Sin embargo, no podemos descartar la posibilidad de que la inducción de la morfología de adoquín-como está mediada a través de receptores que se expresan en las células LNCaP-Gli1 (inicialmente con una morfología normal) y que posteriormente se unen a moléculas secretadas por el mismo (u otro) LNCaP- GLI1 células que actúan a través de señalización paracrina /yuxtacrina
GLI1 confiere independencia androgénica a las células LNCaP
la expresión de marcadores epiteliales se investigó para determinar si el fenotipo luminal de las células LNCaP se vio alterada por eGLI1.: AR fue fuertemente reprimida en las células LNCaP-GLI1 mientras que el basal /tallo-como marcadores CD44, β1-integrina, ΔNp63, y todos fueron IMC1 aumentó (Fig. 2A); esto fue confirmado por análisis de transferencia de Western para la AR y CD44, con el aumento de expresión de la superficie celular de este último confirmado por FACS (Figs. 2B y C). Debido al cambio global uniforme en la expresión de CD44 se optó por emplear a la población heterogénea en estudio. En cuanto a la dependencia de andrógenos, mientras que la exposición a la bicalutamida inhibidor AR potentemente suprime la proliferación de células LNCaP-PBP, el aumento del potencial de proliferación de las células LNCaP-Gli1 no se vio afectada y esto se verificó mediante citometría de flujo (Figs. 2D, carriles 1-4 y E ). Por lo tanto, como se determina por la expresión de marcadores epiteliales y la insensibilidad a la bicalutamida, estos datos sugieren que eGLI1 induce la regresión (o des-diferenciación) de células LNCaP a una forma basal /tallo-como que es naturalmente independiente de la señalización de AR para la viabilidad.
(a) análisis de qPCR de la expresión de marcadores epiteliales en células LNCaP-Gli1 relativos a las células LNCaP-PBP (nb los datos se presentan como logaritmos naturales para la inducción relativa de CD44 es casi 7.000 veces). (B) Análisis de transferencia Western de la expresión de CD44 en AR y LNCaP-PBP, LNCaP-GLI1 y DU145 células (flechas denotan isoformas de CD44 comunes a las células LNCaP DU145-GLI1 y). (C) Análisis FACS de la expresión de CD44 en las células LNCaP-GLI1 LNCaP-PBP y. (D) Ensayo de proliferación de comparar y determinar el efecto de bicalutamida de la velocidad de proliferación de células LNCaP-Gli1 LNCaP-PBP y, así como el efecto de AG1478 (inhibidor de EGFR) y U0126 (inhibidor de MEK) sobre este último. (E) Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo en LNCaP-PBP y las células LNCaP-GLI1 expuesta a la bicalutamida.
Para investigar más a fondo, LNCaP-PBP, LNCaP-GLI1, DU145 y PC- 3 células se analizaron mediante microarrays de ADN: perfiles array global reveló que el transcriptoma de células LNCaP-Gli1 era más similar a DU145 y PC-3 células que a las células LNCaP-PBP revelando así la medida en que las células LNCaP-GLI1 han cambiado fenotipo ( Fig. 3A). En comparación directa de las células LNCaP-PBP, la expresión de 260 transcripciones difería más de 10 veces (144 y 116 hacia abajo) en las células LNCaP-Gli1 (Fig. 3B y las figuras S1 y S2). Clasificación funcional de estas transcripciones produjo 15 grupos ontológicas incluyendo aquellos asociados con la biología del tumor, tales como la adhesión célula-célula, la motilidad celular, EMT (transición epitelio-mesenquimal) y la independencia de la hormona (Figura S3); este último grupo que incluye LCN2 (lipocalina 2) y CAV2 (caveolina 2) que se identificaron previamente como parte de una firma común por la independencia de la hormona de mama y cáncer de próstata [29]. La mayoría de los 144 aumento de transcritos se expresaron en niveles similares en las células LNCaP-Gli1 en comparación con DU145 y /o las células PC-3 (& lt; 3 veces la diferencia), mientras que la expresión de 12 transcripciones (incluyendo LCN2) era & gt; 3 veces mayor en las células LNCaP-GLI cuando se compara con los dos tipos de células (Figura S1 y en la Tabla 1). Recíprocamente, de la disminución de 116 transcripciones único, MRPL23, se expresó & gt;. 3 veces menor en células LNCaP-Gli1 comparación tanto con DU145 y células PC-3 (Figura S2)
(A) Una estadística comparación de perfiles de expresión génica global para determinar el porcentaje de las transcripciones que se expresan a niveles significativamente diferentes en LNCaP-PBP, DU145 y células PC-3 en comparación con LNCaP-GLI1 (Pearson coeficiente de correlación ≥0.7, p & lt; 0,05) (B ) mapa de calor que denota transcripciones en las células LNCaP-GLI1 donde el cambio en la expresión es a la vez & gt; 10 veces y muy significativamente diferente en comparación con las células LNCaP-PBP (
t
-test, p & lt del estudiante; 0,01): listas del panel de la izquierda genes aumentaron, las listas del panel derecho se redujeron los genes y DU145 y células PC-3 se muestran para la comparación (* indica transcripción variantes del mismo gen). (C) Análisis de transferencia Western que compara la expresión de ciertas proteínas de señalización entre las células LNCaP-Gli1 con DU145 LNCaP-PBP y y PC-3 lisados incluye para comparación. (D) La fosforilación de la proteína del citoesqueleto MLC2 está mediada por ROCK en células LNCaP-GLI1 (nb el anticuerpo para el total MLC no funcionaba en nuestras manos).
Además de microarrays de ADN perfilado, en la medida de la mayor activación de la vía de señalización se evaluó mediante transferencia de Western en las células LNCaP-Gli1. la independencia de la hormona se asocia con la activación de la vía EGFR y aunque se ha establecido que la expresión de EGFR mRNA no se incrementa en gran medida en las líneas celulares de IA ([29] y nuestros datos de microarrays), un fuerte aumento en la expresión de la proteína EGFR se observó en las células LNCaP-GLI1 a un nivel comparable con DU145 y células PC-3 (Fig. 3C). ERK (cinasa regulada por señal extracelular) actividad también se incrementó en las células LNCaP-Gli1 (Fig. 3C) y la inhibición farmacológica de EGFR o ERK suprimen su alto potencial de proliferación (Fig. 2D, columnas cf. 1, 3, 5 y 6) . En cuanto a AKT, aunque el aumento de la actividad está asociada con la inactivación mutacional de PTEN en las células LNCaP [30], [31], [32], eGLI1 redujo a un nivel comparable con las células DU145 que sugiere que hay mecanismo (s) que podría ser aprovechada para obviar la pérdida de esta importante gen supresor de tumor (Fig. 3C). En cuanto a la citoesqueleto, las células LNCaP-Gli1 muestran un aumento de MLC2 (cadena ligera de miosina 2) fosforilación que era similar a ambos DU145 y células PC-3 (Fig. 3C y datos no presentados). MLC2 regula el citoesqueleto de actina (incluyendo la formación de fibras de estrés) y es a su vez regulada por MLCK (miosina de cadena ligera quinasa) y Rock (Rho-quinasa asociada); la exposición a la Y27632 inhibidor de rock, pero no a los inhibidores MLCK ML-7 reduce la fosforilación MLC2 aunque esto no invirtió la morfología de adoquines de vaina de células LNCaP-GLI1 (Fig. 3D y observaciones no publicadas). En resumen, estos datos demuestran además el grado en el cual las células LNCaP-GLI1 se asemejan a las células DU145 y PC-3.
células LNCaP-GLI1 no se muestran crecimiento independiente de anclaje
HH señalización /GLI regula normal y poblaciones de células madre de cáncer y estudios recientes han descrito cómo EMT es un rasgo inherente de tales células [15], [16], [33]. Curiosamente, a pesar de su morfología de adoquín similar, los resultados de los microarrays revelaron que eGLI1 induce EMT en las células LNCaP (Figura S3). De hecho, la disminución de E-cadherina y aumento de la expresión de vimentina se confirmó por transferencia de Western, aunque esto no era dependiente de EGFR o MEK-ERK señalización [34] (Fig. 4A). En consecuencia, las células LNCaP-GLI1 eran altamente invasiva a través de un sustrato Matrigel ™ (Fig. 4B) y también muestran un mayor crecimiento clonal, cuando se sembraron a baja densidad (Fig. 4C). Sin embargo, a pesar de la expresión de marcadores 'stemness' (incluyendo CD44, β1-integrina y BMI1), EMT y un mayor crecimiento clonal (Figs. 2A, 4A y 4C), a diferencia de las células de control células LNCaP-Gli1 no formó prostaspheres en suspensión o colonias en agar blando (Fig. 4D). Para hacer frente a la posibilidad de que las células LNCaP-GLI1 no proliferan en cultivo de 3-D, ya que no son capaces de diferenciarse hacia un fenotipo luminal (es decir, debido a la expresión constitutiva eGLI1), las células DU145 también se cultivaron en las mismas condiciones. No se observaron colonias en ninguno de los ensayos con células DU145 que sugieren que AR
- células son mal clonogénico en independiente de anclaje
in vitro
sistemas de cultivo (datos no mostrados); esto es apoyado por Thiyagarajan et al [35] quien observó que DU145 (y las células PC-3) fueron mucho menos proliferativa en agar blando en comparación con las células LNCaP aunque algunos crecimiento de la colonia era evidente en su estudio.
(A ) análisis de transferencia de Western comparación de la expresión de los marcadores de EMT e-cadherina y vimentina entre las células LNCaP-GLI1 y LNCaP-PBP (nb la disminución de la e-cadherina en células LNCaP-Gli1 se invierte parcialmente en presencia del inhibidor de EGFR AG1478 y para en menor medida, el inhibidor de MEK U0126). ensayo de invasión (B) Transwell comparar el potencial invasivo de las células LNCaP-Gli1 LNCaP-PBP y a través de un sustrato Matrigel. (C) clonogenicidad ensayo de evaluación de la capacidad de formación de colonias de células LNCaP-Gli1 LNCaP-PBP y cuando se sembraron a baja densidad. (D) el crecimiento independiente del anclaje se observa en las células LNCaP-PBP, pero no las células LNCaP-GLI1 (parte superior del panel - ensayo de colonias en agar blando; panel inferior - ensayo de prostasphere).
supresión GLI no promueve un fenotipo luminal similar en células de cáncer de próstata andrógeno-independiente
por último, hemos tratado de determinar si la supresión selectiva de GLI fue suficiente para revertir el fenotipo transformado de las células LNCaP-GLI1 o para inducir un fenotipo luminal-como en DU145 o células PC-3. La transfección de células LNCaP-GLI1 con GLI1 o GLI2 siRNA no influyó en la morfología de las células LNCaP-GLI1 ni hubo ningún cambio en la expresión de ARNm o ΔNp63 AR (Figuras 5A-C y la figura S4A.); esto indica que la conversión fenotípica inducida por eGLI1 en las células LNCaP es irreversible y que el mantenimiento del fenotipo AI no depende de GLI2. En cuanto a DU145 y células PC-3, la eficacia de dobles Gli1 caídas /GLI2 fue confirmado por una disminución de la actividad de reportero GLI pero no hubo ningún cambio en la morfología celular ni hubo ningún cambio en la expresión de ΔNp63 o AR ARNm (Figs. 5D -F, Figura S4B y observaciones no publicadas). también Empleamos al GANT61 inhibidor GLI (30 M) [36], pero este fue menos eficaz en la supresión de la actividad de reportero GLI de RNAi (datos no mostrados). Como tal, aunque las células de cáncer de próstata AI muestran la expresión de ARNm de alta actividad y GLI y eGLI1 es capaz de promover un fenotipo de AI en las células LNCaP, la supresión GLI no promueve un fenotipo luminal similar y AD en células de cáncer de próstata AI.
(A) La morfología transformada de células LNCaP-GLI1 no revierte tras la transfección con GLI1 o GLI2 siRNA. (B) Análisis de qPCR GLI1 y el ARNm en las células LNCaP GLI2-GLI1 transfectadas con siRNA GLI1 o GLI2. (C) Análisis de RT-PCR de ARNm ΔNp63 y AR en las células LNCaP-Gli1 transfectadas con GLI1 o GLI2 siRNA. (D) qPCR análisis de ARNm y GLI1 GLI2 en DU145 y células transfectadas con siRNA GLI1 y GLI2 PC-3. actividad de reportero (E) GLI se suprime en DU145 y PC-3 células transfectadas con GLI1 y GLI2 siRNA (actividad de reportero n.b. puede estar influenciada por la expresión GLI3 en células PC-3 [17]). (F) RT-PCR análisis de ΔNp63 y AR ARNm en células DU145 y PC-3 transfectadas con siRNA GLI1 y GLI2.
Discusión
El papel de la señalización de HH ha demostrado ser polémico en el CaP biología; esto incluye debate en cuanto a si o no la vía contribuye a la formación de tumor primario, así el modo real de señalización (autocrina o paracrina). Además, no ha habido datos contradictorios en cuanto a si o no GLI expresión es mediada a través de vías canónicas o no canónicas en líneas celulares de CaP (revisado en [18]). No hemos abordado la naturaleza de la regulación GLI pero hemos demostrado que las líneas celulares AI niveles más altos de GLI mRNA que la línea celular de cáncer de próstata AD LNCaP y PNT-2, DU145 y de visualización PC-3 esto se correlaciona con un aumento de la actividad del indicador GLI (Figs . 1A y B). El hecho de que la expresión GLI1 fue comparable entre 2 PNT-células normales y tumorigénico DU145 y células PC-3 era inesperado pero en contraste con Karhadkar et al [21], también se encontró que GLI1 ARNm se expresa fuertemente en las células epiteliales basales de próstata primario comerciales (PrECs), aunque una comparación fiel a las líneas celulares utilizadas en este estudio no fue posible debido a PrECs se cultivan en medio especialista que no contiene suero (SKN y BSG, no publicado). A pesar de estas observaciones, en el nivel de proteína GLI1 rara vez se detecta en la capa basal del tejido de la próstata humana normal mientras que la expresión es más frecuente en las células basales y carcinomas hiperplásicas [20]. Como tal, de una manera similar a la regulación GLI2 [37], aunque la expresión GLI1 mRNA es constante entre las células normales y tumorogénicos, la proteína puede ser estabilizado en la segunda (posiblemente a través de Fused [38]), y esto, junto con el GLI2, podría explicar el aumento de la actividad de reportero GLI.
Nuestros datos sugieren que GLI1 induce la independencia androgénica en células LNCaP a través de su capacidad para inducir un fenotipo basal, al igual que se asocia con poblaciones de células basales y que es independiente por naturaleza de la actividad de AR; esto es apoyado por AR expresión reducida combinada con un aumento de los marcadores de numerosos basales /madre-similares. Chen et al [26] también describe un papel para GLI1 en la promoción del crecimiento AI en las células LNCaP, pero esto no se asoció con la expresión AR reducida y puede reflejar el hecho de que la expresión eGLI1 fue menor en su sistema como se determina por un menor plegable aumento de reportero de la actividad GLI1. A pesar de que se realizaron los estudios sobre una población celular heterogénea, el fenotipo era uniforme y no hemos sido capaces de aislar líneas clonales LNCaP-GLI1 que mantienen la morfología LNCaP normal, lo que indica que retroviral eGLI1 promueve un "todo o nada" respuesta, pero a medida que el nivel GLI del reportero de la actividad fue comparable con DU145 y PC-3 células esto indica que nuestro sistema tiene relevancia biológica. Cómo eGLI1 media la transformación de las células LNCaP no se ha dilucidado, pero puede implicar múltiples mecanismos: inhibición eGLI1 de AR de señalización por sí solo es poco probable para iniciar el cambio fenotípico pero, combinado con su capacidad para mantener la viabilidad de las células en ausencia de señalización AR [27] , [28], esto puede agravar los efectos de su función principal como un activador transcripcional.
como se señaló anteriormente, eGLI1 aumento de la actividad total de GLI en las células LNCaP a un nivel comparable con DU145 y PC-3 células.