Extracto
Fondo
heparanasa humana juega un papel importante en el desarrollo del cáncer y los polimorfismos de nucleótido único (SNPs) en el gen de la heparanasa (HPSE) han sido demostrado que se correlaciona con el cáncer gástrico. El presente estudio examinó la asociación entre los SNPs o haplotipos en HPSE y la susceptibilidad, parámetros clínico y el pronóstico del cáncer gástrico en una amplia muestra de la población Han en el norte de China.
Metodología /Principales conclusiones
ADN genómico fue extraído de muestras de tejido, fijadas en formalina embebidos en parafina normales gástrico de 404 pacientes, y de sangre de 404 controles sanos. Seis SNPs se genotipo por láser de desorción /ionización de espectrometría de masas de tiempo de vuelo asistida por matriz. Una prueba (χ2) y la regresión logística incondicional chi-cuadrado se utilizó para analizar el riesgo de cáncer gástrico; una prueba de log-rank y Cox de riesgos proporcionales fueron usados para producir el análisis de supervivencia y un método de Kaplan-Meier se utilizó para trazar las curvas de supervivencia. Las tasas de éxito de genotipado medias fueron más de 99% en ambos grupos. Haplotipo CA en el bloque compuesto por rs11099592 y rs4693608 tenía una mayor distribución en el grupo de tipos de BORRMANN 3 y 4 (p = 0,037), el grupo de un mayor número de metástasis en los ganglios linfáticos (N3 vs grupo N0, P = 0,046), y por otra parte se correlacionó con la supervivencia pobre (CG vs CA: HR CI = 0,645, 95%: 0,421 a 0,989, P = 0,044). Además, los genotipos AA y rs4693608 rs4364254 TT se asocia a peor supervivencia (p = 0,030, HR = 1,527; IC del 95%: 1,042-2,238 para rs4693608 AA; P = 0,013, HR = 1,546; IC del 95%: 1,096-2,181 de rs4364254 TT). No se encontraron correlaciones entre los SNP o haplotipos individuales y el riesgo de cáncer gástrico.
Conclusiones /Importancia
Se encontró un haplotipo funcional en HPSE, que incluía los SNP rs4693608 importantes. SNPs en HPSE juegan un papel importante en la progresión del cáncer gástrico y la supervivencia, y tal vez puede ser un marcador molecular para los valores de pronóstico y tratamiento
Visto:. Li AL, Song YX, Wang ZN, Gao P, Miao Y, Zhu JL, et al. (2012) Polimorfismos y un haplotipo en heparanasa Asociaciones de genes con la progresión y pronóstico del cáncer gástrico en una población del norte de China. PLoS ONE 7 (1): e30277. doi: 10.1371 /journal.pone.0030277
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón
Recibido: 13 Octubre, 2011; Aceptado: December 12, 2011; Publicado: 20 de enero 2012
Derechos de Autor © 2012 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias de China (Nº 30972879 y Nº 81172370), un Fondo de Investigación Especializada para el Programa de Doctorado de Educación Superior (Nº 200801590006) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Liaoning (Nº 20092129). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es el cuarto cáncer más común en todo el mundo y la segunda causa de mortalidad por cáncer [1]. A pesar de los avances en el diagnóstico y el tratamiento, el pronóstico para los pacientes con cáncer gástrico avanzado sigue siendo pésimo [2]. Por otra parte, el cáncer gástrico es una enfermedad de las interacciones entre genes y medio ambiente y los factores genéticos juegan un papel importante en la tumorigénesis y la progresión [3]. Por lo tanto, el descubrimiento y aplicación de biomarcadores incorporados con diagnóstico tradicional del cáncer, la estadificación y el pronóstico podrían ser considerados la mejor opción para el control de esta enfermedad que amenaza la vida [4].
Se han pensado polimorfismos de nucleótido único (SNP) de ser biomarcadores atractivos de evaluación del riesgo de cáncer, la detección, estadificación o clasificación [5]. Además, el genoma humano está compuesto de una serie de "bloques de haplotipos ', que son asociaciones no aleatoria de alelos debido a un desequilibrio de ligamiento (LD) y es posible explotar una vasta cantidad de información teniendo en cuenta estos bloques de haplotipos [6], [7 ]. A pesar de que la aplicación del análisis de los SNP se ha limitado hasta ahora, estudio de asociación basada en haplotipo se ha propuesto como un enfoque potente y completa para identificar la variación genética causal subyacente a enfermedades complejas [8], [9].
heparanasa es la enzima de mamíferos sólo se conoce que degrada proteoglicanos de sulfato de heparán (HS) en las membranas basales y la matriz extracelular [10]. Esto conduce a desensamblaje de las barreras extracelulares, liberación de factores bioactivos con destino-HS y la generación de fragmentos de HS que promueve la unión del factor de crecimiento-receptor y señalización [11], [12]. Heparanasa está fuertemente asociada con la progresión del cáncer y metástasis, incluyendo la supervivencia celular, la invasión, la proliferación, la neovascularización, y la creación de un microambiente crecimiento permisivo [13], [14] y tiene aplicaciones tanto pronósticas y terapéuticas [15]. El gen heparanasa (HPSE), primero clonado en 1999, está situado en el cromosoma 4q21.3 [16]. Se han realizado pocos estudios sobre los SNPs en el gen HPSE. Los estudios epidemiológicos moleculares han demostrado diferencias en la distribución de SNPs en HPSE en varias poblaciones judías israelíes [17]. Asociaciones a la susceptibilidad del tumor también se han demostrado, incluyendo malignidades hematológicas y cáncer gástrico, pero los resultados no han sido Accordant [18] - [20]. Además, Shirley Ralphand [21] ha mostrado un haplotipo HPSE se correlacionó con las etapas en el carcinoma de ovario y Yue et al. [20] han mostrado SNPs se correlacionaron con los parámetros clínico-patológicos y la tasa de supervivencia. En concreto, el estudio indicó que los SNPs en HPSE se asociaron con los niveles de expresión de heparanasa y proporcionan la base para nuevos estudios sobre las asociaciones entre SNPs y la enfermedad [22]. Sin embargo, estos estudios de asociación se limitan a pequeñas muestras.
Recientemente, Hennig G [23] y el Cuerno H [24] se observan altas tasas de detección de genotipos (93,5% y 94-97%) y una tasa de concordancia perfecta de 100% con el ADN extraído de, tejidos embebidos en parafina fijados con formalina normales (FFPETs) en comparación con el ADN germinal usando láser de desorción /ionización de espectrometría de masas de tiempo de vuelo asistida por matriz (MALDI-TOF MS). Además, otros informes también mostraron tasas de detección de genotipos de alto y una tasa de concordancia perfecta con ADN derivado de FFPET incluidos los tacos de décadas de antigüedad en comparación con la sangre del mismo individuo usando otros métodos, incluso en el genoma de toda la genotipificación [25] - [28]. Se ha comprobado que el ADN derivado de FFPET era suficiente para el análisis de polimorfismo genético. En el presente estudio, se utilizó una gran colección de muestras de ADN derivados de FFPET de los pacientes y el ADN derivado de la sangre de los controles en un método MALDI-TOF MS para el genotipo y estudiar las posibles asociaciones entre los seis SNPs (rs4693602, rs6856901, rs4364254, rs11099592 , rs4693608 y rs4328905) o haplotipos en HPSE y el tumor de la susceptibilidad, parámetros clínico, y la supervivencia del cáncer gástrico con una amplia muestra de la población Han en el norte de china. Como resultado, se encontró que los SNPs y un haplotipo para mostrar las asociaciones con la progresión y pronóstico del cáncer gástrico.
Resultados
Características de los sujetos
La edad media fue de 56,67 ± 11.923 y, y el porcentaje de varones fue 70,54% en el grupo de casos. La edad media del grupo de control fue de 56,91 ± 11,477 y, y el porcentaje de varones fue 70,54%. No hubo diferencias en la distribución de sexo y edad entre los pacientes y los controles (P = 1,00 para ambos sexo y edad). De los 404 pacientes, los casos de cáncer de estómago en estadio I representaron el 21,0% (85/404), en estadio II casos de cáncer gástrico representaron el 26,5% (107/404) y la fase III de los casos de cáncer gástrico representaron el 52,5% (212/404) ( Tabla 1).
las tasas de éxito de genotipado
Se utilizó el software MassArray Typer analizador de espectros 4.0.4.20 para el procesamiento automatizado y la identificación de genotipos. perfiles representativos MALDI-TOF-MS de cada genotipo de los seis SNPs en HPSE se muestran en la Figura S1. Todos los SNPs fueron polimórficos con menor frecuencia & gt alelo; 10% y genotipo distribuciones eran todos de acuerdo con Hardy-Weinberg (datos no mostrados). las tasas de éxito elevadas, que oscilan entre 96,29% y el 100% (media: 99,09%) en el grupo FFPETs y entre 99,50% y el 100% (media: 99,79%) en el grupo de control, se muestran (Tabla S1)
las asociaciones entre SNPs y los parámetros clínico-patológicos y supervivencia
las frecuencias alélicas y frecuencias genotípicas en los seis SNPs no fueron significativamente diferentes entre los pacientes y los controles (P & gt; 0,05 y p & gt; 0,05 después de una prueba de permutación de las frecuencias alélicas; P & gt ; 0,05 y P & gt; 0,05 después de haber sido ajustado por sexo y edad para las frecuencias genotípicas;. Cuadros S2 y S3)
SNPs fueron evaluados para las asociaciones con los parámetros clínico. genotipos rs4364254 se asociaron con grados histológicos (P = 0,002; Tabla S4), el genotipo TT fue correlacionada con la diferenciación celular bien en comparación con el genotipo CT /CC (OR = 0,482; IC del 95%: 0,300-0,774). Otros SNPs tuvo correlaciones significativas en los parámetros clínico-patológicos
.
En el análisis univariado, los pacientes portadores del genotipo rs4693608 AA tuvieron una supervivencia específica del cáncer gástrico pobre en comparación con los pacientes con el genotipo GG AG + (P = 0,049, HR = 1,387 , 95% CI: 1,001 a 1,923, Tabla 2, Figura 1 y la Figura S2). En el análisis multivariado, el genotipo AA rs4693608 y el genotipo TT rs4364254 ambos tenían una pobre supervivencia específica del cáncer gástrico (p = 0,030, HR = 1,527; IC del 95%: 1,042-2,238 para rs4693608, p = 0,013, HR = 1,546, 95% CI: 1,096 a 2,181 para rs4364254; Tabla 2). Además, el tipo Borrmann (P & lt; 0,001), la categoría pT (P & lt; 0,001), la categoría pN (P & lt; 0,001), y la invasión linfovascular (P & lt; 0,001) se correlacionaron significativamente con la supervivencia en el análisis univariado. Tipo Borrmann (P = 0,021), la categoría pT (P & lt; 0,001), y la categoría pN (P & lt; 0,001) permanecieron significativamente correlacionado con la supervivencia en el análisis multivariante (tabla 2): perfil
Los resultados muestran que la tasa de supervivencia acumulativa de. 381 casos con cáncer gástrico se asociaron con los diferentes genotipos rs4693608 en el gen HPSE.
Presencia de un haplotipo relacionado con características clínico y la supervivencia
Había dos en dos marcador bloques de haplotipos construidos entre los seis SNPs en nuestros resultados (Figura 2). El bloque 1 se compone de rs4693602 y rs6856901 y contenía tres haplotipos comunes (rango de frecuencia: 0,025-0,850), lo que representa aproximadamente el 99,9% de los sujetos; el bloque 2 se compone de rs11099592 y rs4693608 y también contenía tres haplotipos comunes (rango de frecuencia: 0.091-0.798), que representaron aproximadamente el 99,9% de los sujetos. Todos los seis haplotipos comunes no tenían correlación con el riesgo de cáncer gástrico (P & gt; 0,05 y P & gt; 0,05 después de una prueba de permutación; cuadro S5)
A:. HPSE estructura de los genes. cajas llenas representan los 13 exones (5 '→ 3'). Las flechas muestran las ubicaciones de los SNP. B: Cartografía de la estructura de bloque de los seis SNPs generados por Haploview. El valor dentro de cada cuadrado en la trama triángulo representa la correlación de pares entre los SNPs (medido como D ') definido por los lados de la parte superior derecha de las plazas superior e izquierdo. Los cuadrados sin un número corresponden a D '= 1. El sombreado representa la magnitud e importancia de LD por parejas, con un degradado de rojo a blanco que refleja mayor a menor LD valores. La frecuencia de cada haplotipo común dentro de un bloque es para el lado del haplotipo.
Las asociaciones entre haplotipos en HPSE y características clínico de cáncer gástrico en el momento del diagnóstico fueron evaluados. Haplotipo CA en el bloque 2 tenía mayor distribución en el grupo de tipos de BORRMANN 3 y 4 en comparación con los haplotipos TG + CG (p = 0,037; Tabla 3). No se observaron diferencias en la distribución de haplotipos en la categoría pN (P = 0,045; Tabla 3), CA tenía una mayor distribución en el grupo N3 que el grupo N0 en comparación con CG (OR = CI 1.837,95%: 1,010 a 3,341, P = 0,046 ), pero no hubo diferencias significativas entre la distribución N2 y grupos N0 y N1 y entre los grupos N0 (P = 0,671 y P = 0,496, respectivamente).
los haplotipos del bloque 2 indicaron una diferencia significativa en la supervivencia relacionada con el tumor. Los pacientes portadores del haplotipo CA tuvieron una supervivencia específica del cáncer gástrico pobres (CG vs CA: HR = 0,645; IC del 95%: 0,421-0,989; p = 0,044; Tabla 4).
Discusión
Como hemos conocido, ADN derivado de FFPET tiene menor eficacia de extracción y la calidad (ADN fragmentado) debido al ácido nucleico reticulación y degradación parcial de ADN derivado de la sangre. Pero FFPETs archivados proporcionan una valiosa fuente para estudios de genética molecular con varias ventajas, tales como (i) el único tipo de muestras disponibles para las personas que no pueden de otra manera proporcionar una muestra de ADN, (ii) un recurso excelente para los estudios de biomarcadores retrospectiva a gran escala, ( iii) un gran número de muestras en conjunción con los datos de seguimiento clínico a largo plazo, (iv) un recurso valioso en el diagnóstico y la identificación histológica, (v) un recurso disponible de los archivos de patología. Recientemente, el ADN extraído-FFPET se ha informado que ser adecuada para el genotipado, y se ha permitido para biomarcador y estudios de genómica funcional [23] - [29].
MALDI-TOF MS de método, que ofrece aproximadamente 100% de precisión para el genotipado de SNP, que se considera actualmente como un estándar de oro [29], [30]. El genotipado de ADN derivado de FFPET por MALDI-TOF MS se ha demostrado ser fiable y reproducible. Anteriormente informes mostraron que no había diferencias de frecuencia alélica entre el ADN derivado de FFPET y el ADN derivado de la sangre del mismo individuo a través de varios métodos, incluyendo MALDI-TOF MS [24] - [26], [28]. Nuestros esfuerzos mostraron altas tasas de éxito oscilan entre 96,29% y el 100% (media: 99,09%), que estaban de acuerdo con los datos reportados anteriores [23], [24], [29]
SNPs son heredados de forma estable. , muy abundante y mostrar la diversidad dentro y entre poblaciones, los cuales se cree que son biomarcadores atractivos. Sin embargo, la aplicación de los SNP individuales se ha limitado debido a que son de baja penetrancia y sus efectos son relativamente difíciles de identificar [5], [31]. Por lo tanto, la importancia de la información de haplotipos ha ido en aumento para vincular la variación de secuencias de ADN con la enfermedad [32]. Los artículos han informado de que SNPs funcionales en HPSE estaban asociados con diferencias en la expresión de heparanasa y heparanasa se ha demostrado que estar estrechamente implicado en el proceso patológico, la progresión y el resultado de la enfermedad [10], [22]. Cómo incorporar SNPs, sin embargo, en los estudios sobre la predisposición al cáncer gástrico y el pronóstico y cómo determinar las asociaciones verdaderos son todavía difíciles tareas.
No hubo SNPs individuales correlacionados con el riesgo de cáncer gástrico en nuestros resultados. Las asociaciones entre los cuatro SNPs (rs4328905, rs4693608, rs11099592 y rs6856901) y el riesgo de cáncer gástrico con 155 pacientes y 204 controles reportados por Yue et al. [20] estaban de acuerdo con nuestros resultados. Además, los seis haplotipos comunes tenían diferencias significativas en el riesgo de cáncer gástrico. Esta consistencia mostró SNPs en HPSE no tenían correlación con la incidencia de cáncer gástrico en el norte de etnia han china, no sólo desde el punto de vista de los SNP individuales, sino también desde la perspectiva de los haplotipos.
En nuestro estudio, el genotipo rs4364254 TT fue correlacionada con la diferenciación celular también. Además, Ostrovsky et al. [22] encontraron individuos con el genotipo TT poseían niveles de mRNA relativamente altos (P = 0,0029). Sin embargo, ha habido resultados contradictorios reportados como a las asociaciones entre la expresión de heparanasa y la diferenciación histológica. Endo K et al. [33] encontró que la diferenciación histológica fue peor en los tejidos de ARNm de heparanasa-positivo de cáncer gástrico (p & lt; 0,01). Chen JQ et al. [34] encontró que la diferenciación histológica no estaba relacionada con la expresión de ARNm de heparanasa en el cáncer gástrico (P = 1,000). Takaomi Ohkawa et al. [35] demostraron que la expresión de heparanasa se detectó como más fuerte en las células bien diferenciadas (P = 0.0277), que es un hallazgo que consistents con nuestros resultados. Por lo tanto, la heparanasa podría estar implicado en la diferenciación celular, pero los mecanismos no están claros en la actualidad
En el análisis univariado, los pacientes portadores del genotipo rs4693608 AA tuvieron una supervivencia pobre (P = 0,049).; En el análisis multivariante, rs4693608 AA y TT rs4364254 tanto se correlacionaron significativamente con una mala supervivencia (p = 0,030 para rs4693608 AA y P = 0,013 para el TT rs4364254). Posiblemente, la falta de consenso en el análisis univariante y multivariante se debió al efecto débil del SNP individual, pero cuando el SNP se considera conjuntamente con los demás SNP, el tipo Borrmann, categoría pT, y la categoría pN en el análisis multivariante, se generado una influencia en el pronóstico. Existe una amplia evidencia para sugerir que los factores genéticos contribuyen al proceso de la enfermedad en las enfermedades comunes rasgo complejo, pero el efecto de una sola variante es probablemente pequeña [36]. Además, Ostrovsky et al. [37] proporciona un primera evidencia de correlación entre rs4693608 SNP funcionales y rs4364254 y el riesgo de enfermedad aguda de injerto contra huésped desarrollo (GVHD), y la rs4693608 fue el más importante. Sus resultados fueron conforme a la nuestra. Además, Ostrovsky et al. [22] informó tanto rs4364254 genotipo TT y también el genotipo AA rs4693608 se correlacionaron con un nivel de ARNm relativamente alta (P = 0,0029 y 0,004, respectivamente), lo que podría explicar en parte un peor pronóstico en pacientes con AA rs4693608 o TT rs4364254 en el presente estudio . Estas observaciones eran biológicamente plausible porque la sobreexpresión de HPSE estaba estrechamente asociado con una mayor invasividad del cáncer gástrico [38] - [40]. Los presentes resultados demuestran nuestra presunción de que los SNP estaban involucrados en la regulación de la expresión de heparanasa, lo que afecta la capacidad de invasión y supervivencia en cáncer gástrico.
Aunque ni el genotipo rs11099592 CC AA ni rs4693608 mostró una diferencia estadísticamente significativa en el tipo Borrmann, haplotipo CA integrado con ellos mostró una diferencia significativa. CA haplotipo tenía una mayor distribución en el grupo de tipos de BORRMANN 3 y 4 (P = 0,037). Tal vez los pacientes con haplotipo CA eran más propensos a desarrollar un tipo general más pobre. Además, el haplotipo CA tenía una mayor distribución en el grupo N3 (P = 0,046, comparado con el grupo N0). Sin embargo, no hubo diferencias significativas entre la distribución de N2 y grupos N0 y entre los grupos N1 y N0. Tal vez hubo una asociación entre el haplotipo CA y un mayor número de metástasis en los ganglios linfáticos, pero se necesitan más estudios. Por otra parte, los pacientes portadores del haplotipo CA también mostraron una baja supervivencia específica del cáncer gástrico, que era consistente con las diferencias en el tipo Borrmann y el número de metástasis en los ganglios linfáticos. Además, Ostrovsky et al. [22] informó de que el genotipo CC rs11099592 y rs4693608 genotipo AA se correlacionaron con la expresión de ARNm alta (P = 0,0167 y P = 0,004, respectivamente), que estaban de acuerdo con nuestros resultados sobre haplotipo CA. Tal vez el riesgo absoluto asociado con cada uno de SNPs fue baja, pero el análisis de haplotipo combinado puede ser más útil en la identificación de individuos con alto riesgo de progresión de la enfermedad. Tal vez fue haplotipos específicos que juegan un papel importante en la invasión y la metástasis del cáncer gástrico, afectar aún más el pronóstico.
Un haplotipo bloque funcional compuesta de rs11099592 y rs4693608 fue encontrado en nuestros resultados, que se asoció con el tipo Borrmann, PN categoría y pronóstico del cáncer gástrico. Por un lado, SNP rs11099592 es una sustitución de SNP A-G nonsynonymous situado en el exón 8 y esta alteración resulta en una sustitución de arginina a lisina en la posición 307, tal vez conduce a una diferencia funcional en la proteína. Por otro lado, rs4693608 SNP está localizado en el intrón 3 y mostraron una correlación con la supervivencia. Cantidades crecientes de evidencia indica que las variantes genómicas en las secuencias no codificantes pueden alterar la expresión de productos de genes cambiando la regulación de genes, empalme de exón, la estabilidad del mRNA, la activación de los sitios de empalme críptico y así sucesivamente, que puede, por tanto, causa fenotipos de la enfermedad. Además, los haplotipos pueden proporcionar información más relevante que los SNPs [7], [41]. Por otra parte, si la transcripción de genes, el mantenimiento de la diferenciación celular y la inducción de un fenotipo metastásico invasivo se deben a la interacción directa con el ADN de la heparanasa aún no se ha demostrado.
Ostrovsky et al. [22] demostraron importante asociación entre los genotipos combinados para rs4693608 y rs4364254 SNP y el nivel de expresión del ARNm de la heparanasa. Además, se repartieron todos los genotipos combinados en tres subgrupos (LR-bajos de expresión, MR-intermedio de expresión, HR-alta expresión) de acuerdo con la heparanasa nivel de expresión de ARNm de cada genotipo, y confirmaron diferencias significativas entre los tres subgrupos de portadores de genotipos combinados y ARNm los niveles. Además, Ostrovsky et al. [37] encontró por primera vez las correlaciones entre los genotipos combinados para rs4693608 y rs4364254 SNP y el riesgo de desarrollo de EICH aguda en su siguiente estudio con este método de análisis de subgrupos. Es un método importante y valiosa. Por otra parte, este método es útil para la predicción del riesgo asociado con el enfoque de haplotipos en los siguientes práctica clínica. Nuestro estudio en el futuro, que conecta el nivel de expresión de ARNm de genotipos o haplotipos en HPSE de la población Han en el norte de China, podría utilizar este método.
Debido a que el tamaño de la muestra de tipo salvaje homocigotos fue relativamente muy pequeño para el análisis estratificado en cada genotipo de los seis SNPs investigados en nuestro estudio, no es posible mostrar los resultados de análisis de SNP en cada genotipo, pero se realizó un análisis heterocigoto combinado con el tipo salvaje homocigotos. Fue una limitación de este estudio.
En conclusión, este estudio se evaluaron los polimorfismos del gen HPSE en el cáncer gástrico con un método MALDI-TOF MS y FFPETs archivados en una gran cohorte de casos y controles del norte de China. Encontramos un haplotipo bloque funcional compuesta de rs11099592 y rs4693608, que se asoció con el tipo Borrmann, categoría pN y pronóstico; y rs4693608 SNP, que fue incluida en el bloque, mostraron una correlación con la supervivencia. Estos resultados son compatibles con las asociaciones entre SNPs en HPSE y los niveles de expresión de ARNm reportados previamente por Ostrovsky et al. [22]. Además, seis SNPs y haplotipos individuales no se correlacionaron con el riesgo de cáncer gástrico. Estos resultados fueron consistentes con nuestra hipótesis inicial de que la heparanasa participó en la invasión y la metástasis del cáncer y afectó el pronóstico, en última instancia, pero no estuvo involucrado en la incidencia de cáncer.
Materiales y Métodos
Recogida de muestras
404 pacientes con cáncer gástrico histopatológico confirmó que habían recibido cirugía radical entre enero de 1998 y diciembre de 2004 fueron consecutivamente seleccionado. Los pacientes fueron desde el norte de China y se cree que son buenos representantes de esta región. 404 muestras de tejidos gástricos normales se obtuvieron de un segmento de los especímenes resecados más alejado del tumor (& gt; 10 cm) y FFPETs fueron archivados en el Departamento de Oncología Quirúrgica del Primer Hospital de la Universidad de Medicina China en el norte de China. Todas las muestras fueron fijadas y embebidas en condiciones histológicas clínicas estándar y se almacenaron a temperatura ambiente. Secciones de parafina de FFPETs se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E) para la inspección patológica para confirmar la ausencia de tejido tumoral. El grado histológico del tumor se evaluó de acuerdo con los criterios y los tumores de la Organización Mundial de la Salud se organizaron utilizando la 7ª edición de la clasificación TNM de la Unión Internacional Contra el Cáncer (UICC) Comité Conjunto sobre el Cáncer del sistema /(AJCC) (2010), basado en patológica postoperatoria examen de los especímenes. Se obtuvieron los datos patológicos completos, incluyendo edad, sexo, fecha de la cirugía, la localización del tumor primario, el grado histológico, la invasión venosa, invasión linfovascular, profundidad de la invasión, el número de LN recuperados, el número de los LN metastásicos, y el número de depósitos tumorales recuperados. Aquellos (i) con tumores malignos sincrónicos o metacrónicos, (ii) con metástasis a distancia se encuentra antes de la operación, (iii) que se sometieron a radioterapia o quimioterapia preoperatoria, o (iv) con entradas de datos patológicos incompletos fueron excluidos de este estudio. El seguimiento se completó para toda la población de estudio en enero de 2010. Dos pacientes fallecieron en el postoperatorio y 21 pacientes se perdieron durante el seguimiento, por lo tanto, 381 pacientes fueron incluidos en el análisis de supervivencia. los períodos de seguimiento mediana y la media era 90.0 meses y 93,3 ± 20,24 meses (rango: 61-136 meses), respectivamente. Se obtuvieron los siguientes datos de todos los pacientes: la fecha de la muerte (si es aplicable), causa de la muerte (en su caso), y la fecha de seguimiento. El criterio de valoración principal fue la duración de supervivencia por causa específica de la fecha de diagnóstico de cáncer gástrico a la fecha de la muerte. La tasa de supervivencia a 5 años de los 404 pacientes fue de 54,2%.
404 muestras de sangre fueron obtenidas de individuos libres de cáncer que fueron seleccionados al azar en base a exámenes físicos durante diciembre 2009 a agosto 2011, ya que el grupo de control, y este grupo se cree que es una buena representación de la población en la región del norte de china. Los criterios de selección incluyen ninguna historia individual de cáncer, frecuencia coincidente a los casos en el sexo y la edad y los individuos no estaban relacionados étnicos chinos Han. Las muestras (ácido etilendiaminotetraacético [EDTA] anticoagulan) fueron almacenadas a -20 ° C dentro de 30-40 minutos, y luego se trasladaron a un congelador a -80 ° C dentro de 2 o 3 días después de la recogida.
el estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación de la Universidad de Medicina china, china. consentimientos informados escritos fueron obtenidos de todos los pacientes antes de participar en el estudio.
extracción de ADN
El ADN genómico fue extraído de muestras FFPET en el grupo de casos. Las secciones con un grosor de 8 micras y un área superficial de hasta 250 mm
2 se prepararon con un microtomo y se aisló el ADN de 6 a 12 secciones, en función del tamaño del tejido y los recuentos de células. El microtomo se limpió y se cambiaron las cuchillas para evitar la contaminación intermuestreos. Extracción de ADN de FFPETs se realizó con ADN QIAamp® FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) [29], siguiendo los procedimientos descritos por el fabricante, incluyendo (i) disolver la parafina en xileno y quitar, (ii) muestra la lisis incompleta de desnaturalización condiciones con proteinasa K, (iii) invertir la formalina incubación de reticulación a 90 ° C, (iv) ADN se unen a la membrana y permitir que los contaminantes fluyan a través de, (v) lavar los contaminantes residuales, y (vi) eluir el ADN puro y concentrado de la membrana (con tampón tris-EDTA [TE]). Acerca de 2 a 10 g de ADN se recuperó en 50 l solución final y se almacenó a -80 ° C.
ADN genómico fue extraído de muestras de sangre del grupo de control con el ADN genómico universal Extraction Kit Ver.3.0 (TAKARA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aproximadamente 2-6 g de ADN se recuperó en TE y se almacenó a -80 ° C.
Selección de los SNP y genotipado
En el estudio participaron seis SNPs en HPSE, que fueron tomadas desde el base de datos NCBI SNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp) y la base de datos HapMap (la base de datos de Fase III) (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/index.html.zh ). Estos SNPs fueron asignadas en el gen HPSE (Figura 2). rs 11099592 era único, no sólo con una frecuencia menor alelo (MAF) & gt; 1%, sino también como polimórficos en la China Han Beijing (HCB) de la población entre todos los SNPs región de codificación (cSNPs) en HPSE, que fue registrada en las bases de datos. Además, otros cinco SNPs fueron localizados en regiones intrónicas y UTR en 3 '. Por otra parte, otros investigadores han demostrado que rs11099592, rs4693608, rs4364254 y se correlaciona con la expresión de ARNm heparanasa [22]. Además, las asociaciones entre los SNP o haplotipos individuales en la susceptibilidad y HPSE, parámetros clínico y el pronóstico de los tumores reportado en estos artículos era compleja, pero en su mayoría se concentraron en los seis SNPs que hemos seleccionado [17] - [22].
SNPs se genotipo utilizando el sistema MALDI-TOF MS (MassARRAY; Sequenom, San Diego, CA, EE.UU.) con cebadores y sondas (Tabla S6), como se describe anteriormente [29], [42]. Para garantizar la calidad de mecanografía, muestras positivas 1% (cepa de células Yanhuang) se incorporaron en cada placa de genotipificación para validar la fiabilidad de los cebadores y 1% de las muestras negativas (agua sin ADN) para controlar la contaminación. 5% de las muestras al azar fueron probados por duplicado por diferentes personas y la reproducibilidad fue del 100%. El personal del laboratorio fueron cegados a la disposición de muestras durante el proceso. Había seis etapas que incluyen la amplificación por PCR, el tratamiento con fosfatasa alcalina de gamba, extensión de la base, eliminación de sales con resina, SpectroCHIP de dispensación (Sequenom, San Diego, CA, EE.UU.), y datos de adquisiciones con MALDI-TOF MS según Justenhoven et al. [43]. Por último, el análisis de datos se realizó utilizando el software MassArray Typer Analizador 4.0.4.20 (Sequenom, San Diego, CA) [44].
determinación LD bloque y la construcción de haplotipos
software Haploview 4.2 se utilizó para evaluar LD y construir haplotipos [31]. LD entre los seis SNPs utilizados en el análisis de haplotipos se midió mediante una estadística por parejas D '. La estructura del bloque de LD se examinó utilizando el método de Gabriel et al. [45], utilizando los límites de confianza del 80% de D 'para definir los sitios de recombinación histórica entre SNPs. Haplotipos se construyeron a partir de datos de genotipo en el panel de control de casos de tamaño completo dentro de los bloques mediante el uso de un método de expectativa de maximización algoritmo acelerado [46]. En pocas palabras, este método crea estimaciones de frecuencia población altamente precisas de los haplotipos en fase en base a la probabilidad máxima como se determina a partir de la entrada unphased [47].
El análisis estadístico
El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando los Statistics software de 18.0 (SPSS, Inc., Somers, NY, EE.UU.). Se utilizó una prueba bilateral de chi-cuadrado (χ2) para estimar las características de distribución de población, comparar las diferencias en frecuencias alélicas y genotípicas entre los casos y los controles y evaluar las asociaciones entre SNPs y los parámetros clínico-patológicos. Se utilizó un procedimiento de permutación (1.000 pruebas) para corregir el valor de p de resultados de la asociación de copia única. La odds ratio (OR) y los intervalos de confianza (IC del 95%) se calcularon mediante regresión logística no condicional para analizar la asociación entre el genotipo frecuencias y el riesgo de cáncer gástrico, y se ajustaron por sexo y edad. análisis de supervivencia univariante y multivariante se realizó con la prueba de log-rank y Cox de riesgos proporcionales con los parámetros clínico-patológicos y SNPs. Esto dio lugar a la identificación de covariables que se correlacionaron con la supervivencia de los pacientes. análisis de supervivencia multivariante se llevó a cabo mediante la adición por separado las variables de SNP a todos los parámetros clínico. Un método de Kaplan-Meier se utilizó para trazar las curvas de supervivencia. El paquete de software 4.2 Haploview se utilizó para: estimación de pares de desequilibrio de ligamiento (LD), detectar la salida de equilibrio de Hardy-Weinberg, la construcción de haplotipos y calcular las frecuencias de haplotipos y las asociaciones entre los haplotipos de estimación y el riesgo de cáncer gástrico. El software Haplo.states se utilizó para evaluar las asociaciones entre haplotipos y características clínico [31]. Se utilizó el software de Thesias basado en riesgos proporcionales de Cox de regresión supervivencia en el análisis de asociación basado en el haplotipo usando el algoritmo estocástico-EM para producir el análisis de supervivencia de los haplotipos [48]. Agradecemos también al Colegio de Universidad Médica de China para la asistencia técnica en los experimentos.