Extracto
Antecedentes
Los diferentes mecanismos implicados en p120- catenina (p120ctn) 1/3 regulación de la progresión del ciclo celular isoformas 'todavía no se aclaran hasta la fecha.
métodos y las conclusiones
se encontró que tanto la ciclina D1 y ciclina e se podría restaurar eficazmente restitución de p120ctn-1A o p120ctn-3A en p120ctn agota las células de cáncer de pulmón. Cuando la expresión de la ciclina D1 fue bloqueado por co-transfección con siRNA-ciclina D1 en las células p120ctn empobrecido restauración p120ctn-1A o 3A, la expresión de la ciclina E ligeramente disminuyó, no aumentado, lo que implica que las isoformas p120ctn 1 y 3 no puede UP- regular la ciclina E directamente, pero pueden hacerlo a través de la regulación de la ciclina D1. Curiosamente, la sobreexpresión de p120ctn-1A aumentó β-catenina y la expresión de ciclina D1, mientras que la co-transfección con siRNA dirigidos β-catenina suprime el efecto de p120ctn-1A en la regulación de la ciclina D1, lo que sugiere un papel de β-catenina en la mediación p120ctn-1A función reguladora en la expresión de ciclina D1. Por otra parte, la sobreexpresión de la isoforma p120ctn 3A reduce localización Kaiso nuclear, disminuyendo de este modo la unión de Kaiso a KBS sobre el promotor de ciclina D1 y mejorando de este modo la expresión de gen de la ciclina D1 por aliviar el efecto represor de Kaiso. Debido a que la sobreexpresión de NLS-p120ctn-3A (p120ctn-3A plásmidos de localización nuclear de destino) o la inhibición de la exportación nuclear de p120ctn-3 por Leptomycin B (LMB) causó la translocación de Kaiso al núcleo, es plausible que la exportación nuclear de Kaiso es p120ctn- 3-dependiente.
Conclusiones
Nuestros resultados sugieren que las isoformas p120ctn 1 y 3 hasta de regular la ciclina D1, y por lo tanto la ciclina e, que resulta en la promoción de la proliferación celular y la progresión del ciclo celular en el pulmón las células cancerosas, probablemente a través de diferentes mediadores de proteínas, es decir, β-catenina para la isoforma 1 y Kaiso, un factor transcripcional negativo de la ciclina D1, la isoforma 3.
Visto: Jiang G, Wang y, Dai S, Liu y , Stoecker M, Wang E, et al. (2012) P120-catenina isoformas 1 y 3 de regular el ciclo celular y la proliferación de células de cáncer de pulmón a través de β-catenina y Kaiso respectivamente. PLoS ONE 7 (1): e30303. doi: 10.1371 /journal.pone.0030303
Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Octubre, 2011; Aceptado: 13 de diciembre de 2011; Publicado: 20 de enero 2012
Derechos de Autor © 2012 Jiang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81071905 otorga a Enhua Wang, Wang Yan a 30.901.475, 81.071.717 de Shundong Dai, y 30.900.562 a Yang Liu). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
en las células cancerosas, β-catenina, un factor clave de la vía canónica de señalización Wnt, se acumula en el citoplasma y se transloca al núcleo para formar un complejo con el factor de transcripción LEF /TCF (Lef, potenciador linfoide factor de; TCF, la proteína del factor de células T), que posteriormente activa los genes Wnt-sensibles, incluyendo la ciclina D1 [1]. Anteriormente, hemos informado de que una de las isoformas p120ctn, p120ctn-1, podría hasta de regular la expresión de β-catenina, mientras que otra isoforma p120ctn, p120ctn-3, no podía [2] - [3]. Curiosamente, tanto p120ctn isoformas 1 y 3 podría afectar a la proliferación celular y la progresión del ciclo celular, que se sabe que están mediadas por ciclina D1 [2] - [4]. Por tanto, es razonable especular que p120ctn-1 regula la proliferación celular y el ciclo celular a través de β-catenina inducida sobre regulación de la ciclina D1. Sin embargo, el mecanismo molecular subyacente por el cual p120ctn-3 regula la proliferación celular y la progresión del ciclo celular todavía no está claro en la actualidad
.
Nuestro estudio anterior demostró que Kaiso, una nuclear CEL /POZ-ZF (BTB, Broad compleja, Tramtrack, baratijas; POZ, virus de la viruela y el dedo de zinc; ZF, con dedos de zinc) factor de transcripción, podría unirse a p120ctn en el tejido de cáncer de pulmón y las células de cáncer de pulmón [5]. Aunque se sabe que es un componente del complejo /p120ctn Kaiso, cada isoforma p120ctn individuo podría poseer una afinidad diferente, mientras que la unión a Kaiso [6]. De interés, la región del promotor de la ciclina D1 contiene KBS (Kaiso sitios de unión), una secuencia de ADN consenso que pudiera ser reconocido por Kaiso [7] - [8]. Por lo tanto, la ciclina D1 puede ser también un potencial gen diana aguas abajo de Kaiso [9] - [10]
Dado que el dominio de unión de Kaiso con p120ctn está completamente solapado con la secuencia de ADN específica de elemento KBS en la ciclina. promotor D1 [9] - [11], que postula que p120ctn-3 podría competir con KBS en gen ciclina D1 que se unen a Kaiso y suprimirá la represión mediada por Kaiso de la ciclina D1, mejorando así la expresión de ciclina D1, así como la ciclina e , lo que en última instancia, la promoción de la progresión del ciclo celular. Para probar nuestra hipótesis en el presente estudio, se reconstituyó p120ctn-1A y 3A, respectivamente, en las células p120ctn agotado y sobreexpresa o noqueado Kaiso o β-catenina para probar los efectos sobre la expresión de la ciclina D1 y ciclina E. El objetivo fue investigar la potenciales diferentes mecanismos moleculares por los cuales p120ctn-1 y 3 regular la proliferación celular y el ciclo celular en células de cáncer de pulmón. Dos mutantes de deleción de p120ctn isoforma 1, que varían en sus estructuras N-terminal, se construyeron para estudiar las diferentes funciones del p120ctn-1 y 3.
Resultados
Tanto 1A y 3A p120ctn podía hasta de regular la expresión de ciclina D1 y ciclina e, que afecta a la proliferación celular y la progresión del ciclo celular en células de cáncer de pulmón
Ya sea p120ctn actúa como un supresor de tumores o metástasis de un promotor depende en gran medida si la expresión de e-cadherina se ha reducido -regulated, perdido por completo desde la unión célula-célula intacta o [12]. Por lo tanto, es crucial para determinar si la E-cadherina se localiza en la membrana de las células cancerosas de pulmón humano. En este estudio, hemos confirmado que ninguna localización membranosa visible de cualquiera de las proteínas p120ctn-1/3 o E-cadherina en las líneas A549 o SPC celulares (Figura S1). En su lugar, mostraron distribución predominantemente citoplasmática. Después de p120ctn fue derribado en las células A549, las expresiones de la ciclina D1 y ciclina E se redujeron significativamente en los niveles tanto de la proteína (Figura 1A) y la transcripción (Figura S2A). De conformidad, la proliferación celular se suprimió eficazmente (
p
& lt; 0,01, Figura 1B), indicado por más G
1 células en fase y menos células en fase S detectado (
p = 0,001
, la Figura 1C). Además, la ciclina D1 y ciclina E se podrían efectivamente restaurados por restitución de p120ctn-1A o p120ctn-3A en células A549 p120ctn empobrecido (Figura 2A y la Figura S2B), y la proliferación celular y ciclo celular también podría ser restaurado, presumiblemente correspondientes a la repleción de ciclina D1 y ciclina e (
p
& lt; 0,05, Figura 2B y C). Resultados similares se obtuvieron en las células SPC-K2 en el que p120ctn expresión constitucionalmente se agota (Figura S3).
(A) Los resultados del análisis de transferencia Western mostró que las proteínas ciclina D1 (*,
p
= 0,001) y ciclina e (*,
p
= 0,004) se redujo significativamente después de p120ctn fue derribado en células A549. (B y C) Los resultados de MTT y citometría de flujo mostró la capacidad proliferativa celular suprimida, el aumento de G
1 en las células de fase (*,
p = 0,001
) y células en fase S reducidas (*,
p = 0,001
) se detectaron en las células A549 con p120ctn derribado. Todas las comparaciones se realizaron a los grupos de células A549 o las células transfectadas con el vector solo.
(A) p120ctn-1A o 3A plásmidos se transfectaron en células A549 empobrecido de p120ctn (SI-p120 + 1A o si-p120 3A +), que muestra las recuperado de manera significativa los niveles de proteína de ciclina D1 (*,
p Hotel & lt; 0,001, **,
p Hotel & lt; 0,001) y ciclina e (* ,
p Hotel & lt; 0,001, **,
p Hotel & lt; 0,01). (B y C) Los resultados de MTT y citometría de flujo mostró que la proliferación celular se restableció de hecho (
p Hotel & lt; 0,01), G células
1 fase se redujo significativamente (*,
p
= 0,001, **,
p = 0,004
) y células en fase S se incrementaron significativamente (*,
p = 0,004
, **,
p = 0,028
) después de las células A549 p120ctn empobrecido fueron transfectadas con p120ctn-1A o 3A. Todas las comparaciones se hacen a los grupos de células A549 y las células transfectadas con el vector solo.
A continuación, encontramos que el agotamiento de ciclina D1 de siRNA en células A549 también dio lugar a la reducción de la expresión de ciclina E ( La figura 3A y la figura S4A), la supresión de la proliferación celular (
p Hotel & lt; 0,01, Figura 3B), elevación de G
1 células en fase y la disminución de células en fase S (
p
= 0,009, Figura 3C), que eran comparables a la interferencia de p120ctn. En contraste, no se observó cambio en la expresión de ciclina D1 cuando la ciclina E se agotó por siRNA (Figura 3A y la Figura S4A), lo que sugiere una relación reguladora unidireccional entre la ciclina D1 y ciclina E. Curiosamente, cuando siRNA-ciclina D1 fue co-transfectadas con isoforma p120ctn 1 o 3 en las células agotadas de p120ctn, la expresión de la ciclina e no se incrementó pero se redujo ligeramente (Figura 3D y Figura S4B), y se observó un fenómeno similar cuando la ciclina D1 fue bloqueada por incubación del anticuerpo monoclonal (100 ng /ml, 48 h) en las células p120ctn reconstituido (Figura S5). Este hallazgo implica que p120ctn isoformas 1 y 3 no podían hasta de regular la ciclina E directamente, pero podría hacerlo a través de la regulación de la ciclina D1. Todos estos resultados sugieren que p120ctn promueve la progresión del ciclo celular por hasta la regulación de ciclina D1, que posteriormente aumenta la expresión de la ciclina E.
(A) Ciclina D1 agotamiento por siRNA en células A549 condujo a expresión reducida de ciclina E, pero por el contrario, la expresión de ciclina D1 no se ha modificado significativamente (
p = 0,944
) en las células con derribado ciclina e de siRNA, lo que sugiere una relación reguladora unidireccional entre la ciclina D1 y ciclina E. (B y C) agotamiento suprimido la proliferación celular ciclina D1 (
p
& lt; 0,01), células elevados de G
1 de fase (
p
= 0,016) y una disminución de células en fase S (
p
= 0,009). (D) Después de la co-transfección de ARNsi-ciclina D1 con p120ctn isoforma 1 o 3 en las células agotadas de p120ctn durante 48 horas, la expresión de la ciclina E no se incrementó pero se redujo ligeramente. Todos estos resultados sugieren que p120ctn promueve la progresión del ciclo celular por hasta la regulación de ciclina D1, que posteriormente aumenta la expresión de la ciclina E. La comparación se hace con el grupo control de células transfectadas con siRNA no dirigido o el vector solo.
p120ctn isoforma 1-hasta podría regular la expresión de ciclina D1 a través de β-catenina
Dado que hemos confirmado que tanto p120ctn-1A y 3A-p120ctn podrían hasta de regular la ciclina D1, se planteó la cuestión de si el mecanismos moleculares subyacentes eran los mismos entre las dos isoformas. Para responder a esta pregunta, p120ctn-1A y 3A-p120ctn se transfectaron respectivamente en p120ctn derribado células SPC, que fueron designados como SPC-K2. La sobreexpresión de p120ctn-1A podría aumentar la expresión β-catenina (* p = 0,001, Figura 4A), pero la sobreexpresión de p120ctn-3A tenía esencialmente ningún efecto sobre la proteína β-catenina (** p = 0,769, Figura 4A). De interés, ni p120ctn-1 ni 3 parecía tener efecto sobre la transcripción de β-catenina (* p = 0,463, p = 0,401 **, Figura 4B).
P>
p
= 0,001) en las células transfectadas con p120ctn-1A de ADNc, pero no mostró ningún cambio significativo (**,
p
= 0,769) en p120ctn-3A sobreexpresan SPC-K2. Ni p120ctn-1 ni 3 podrían afectar a la transcripción de
β-catenina gratis (*
p = 0,463
, **
p = 0,401
) o la expresión de Kaiso. Todas las comparaciones se realizan en el grupo de células transfectadas con el vector solo.
Como se muestra en la Figura 5, la baja regulación de β-catenina de siRNA (si-β-cat) resultó en una reducción de la ciclina D1 expresión en el A549, y p120ctn golpeando hacia abajo (si-p120) resultaron en una reducción de β-catenina activa y ciclina D1. Por otra parte, β-catenina y niveles de ciclina D1 activos podrían ser restaurados mediante la transfección de p120ctn-1A (si-p120 + 1A). Sin embargo, la expresión de ciclina D1 no fue restaurada por co-transfección de p120ctn-1A y siRNA -β-catenina (si-p120 + 1A + si-β-cat), lo que sugiere que p120ctn-1A hasta reguladas ciclina D1 a través de β-catenina. La transfección de p120ctn-3A en las células agotadas de p120ctn (si-p120 + 3A) no podía hasta de regular los niveles de β-catenina activos, pero aún podía restaurar significativamente la expresión de ciclina D1, lo que implica que p120ctn-3 hasta regula la expresión de la ciclina D1 independiente de β-catenina. Además, cuando p120ctn-3A fue co-transfectaron en células A549 agotados de tanto p120ctn y β-catenina (si-p120 + 3A + si-β-cat), la expresión de ciclina D1 fue significativamente mayor en comparación con el grupo de agotamiento de p120ctn y β-catenina y sin restituir p120ctn-3A (si-p120 + SI-β-gato); mientras que se observó ningún cambio en el nivel de β-catenina activa en p120ctn y β-catenina agotadas las células duales, a pesar de su aparente restitución de p120ctn-3A (si-P120 3A + + si-β-gato). Se obtuvieron resultados similares en experimentos llevados a cabo en las células SPC (Figura 5). Dos hallazgos interesantes se observaron en nuestro estudio. 1). El efecto de p120ctn-1A en la expresión de ciclina D1 parece ser más prominente que la de p120ctn-3A, ya que la expresión de la ciclina D1 inducida por la restitución de p120ctn-3A fue siempre inferior a la inducida por la restitución de p120ctn-1A o incluso menor de las células no tratadas; 2). La restauración de la ciclina D1 inducida por la restitución de p120ctn-3A en las células agotadas de tanto p120ctn y β-catenina (si-p120ctn + 3A + si-β-cat) parecía ser incompleta en comparación con las células agotadas de p120ctn solo ( si-p120 + 3A). La diferencia entre estos dos grupos se podría explicar por la β-catenina endógena en el segundo, que fue suprimida sinérgicamente por siRNA-β-catenina en el primero.
La expresión de activo β-catenina y la ciclina D1 se redujo significativamente en células A549 (β-catenina, +
p Hotel & lt; 0,001, ++
p Hotel & lt; 0,001, ciclina D1, +
p = 0,003
, + +
p
= 0,004) cuando fue interferido β-catenina o p120ctn (si-β-gato o si-p120). La expresión de β-catenina activa (*
p
= 0,001) y ciclina D1 (*
p Hotel & lt; 0,001) se recuperó cuando la expresión-1A p120ctn se reconstituyó por p120ctn-1A cDNA transfección ( si-p120 + 1A). Co-transfección de p120ctn-1A y el siRNA dirigidos a β-catenina (si-p120 + 1A + SI-β-gato) no mostró ningún cambio de la ciclina D1 (
Δ
p = 0,248
) expresión, lo que sugiere que p120ctn-1A hasta regula ciclina D1 a través de β-catenina. Restauración de p120ctn-3A (si-P120 3A +) no aumentó la expresión de β-catenina activa (**
p = 0,891
), pero aún podría restaurar la expresión de ciclina D1 (**
p
= 0,001), lo que implica que p120ctn-3 hasta regula la expresión de la ciclina D1 independiente de β-catenina. Co-transfección de p120ctn-3A y los siRNAs dirigidos p120ctn /β-catenina (si-p120 + 3A + SI-β-cat) podrían aumentar significativamente la expresión de ciclina D1 en la línea celular A549 en comparación con el grupo de p120ctn /β-catenina siRNA transfección sola (+ SI-β-gato si-p120,
ΔΔ
p Hotel & lt; 0,01), mientras que, co-transfección de p120ctn-3A parece tener ningún impacto en los niveles de β activa catenina. Resultados similares se obtuvieron en las células SPC. Tenga en cuenta, aunque la expresión de ciclina D1 se restaura mediante la restitución de cualquiera 1A p120ctn o p120ctn 3A, el efecto es más prominente de rescate por p120ctn 1A que por p120ctn 3A. La diferencia entre el grupo si-P120 3A + y el grupo si-P120 3A + + si-β-gato puede explicarse por un efecto residual de β-catenina endógena en el primero. Este efecto de la residual β-catenina endógena también se puede ver en la diferencia entre si-p120 y p120 + si-si-β-cat en ambas líneas celulares. Un efecto sinérgico que resulta en la disminución adicional en tanto β-catenina y la ciclina D1 se puede ver en el último grupo.
β-catenina se observó la distribución en las células A549 y SPC en ambos núcleo y el citoplasma bajo confocal microscopía láser. Su señal se convirtió en significativamente más débil en las zonas correspondientes subcelulares cuando se agota p120ctn. La sobreexpresión de p120ctn-1A resultó en una señal de β-catenina fuerte. Por el contrario, p120ctn-3A tiene ningún efecto apreciable sobre la expresión de β-catenina (Figura S6).
A fin de probar la función de estas dos isoformas, transfectadas dos mutantes de deleción de p120ctn-1, M1 y M2 , en la célula A549 p120ctn empobrecido (Figura 6). Los resultados mostraron que M1 podría hasta de regular β-catenina pero M2 no podía, lo que implica que los residuos N-56-101 amino ácidos de p120ctn-1 son esenciales para la regulación de β-hasta-catenina. Por lo tanto, puede ser debido a la eliminación de N-56-101 residuos de aminoácidos para p120ctn-3 a fallar para regular el nivel de la proteína β-catenina.
dos mutantes de deleción de p120ctn-1, M1 y M2 se transfectaron en células A549 p120ctn empobrecido. Los resultados mostraron que podría M1 hasta de regular β-catenina (***
p Hotel & lt; 0,001), mientras que M2 no podía (****
p = 0,175
). M1-hasta podría regular la expresión de ciclina D1 (***
p Hotel & lt; 0,001), pero no podía M2 (****
p = 0,906
). Por lo tanto, puede ser debido a la eliminación de N-56-101 residuos de aminoácidos para p120ctn-3 a fallar para regular β-catenina. Todas las comparaciones se realizan en el grupo de células co-transfectadas con el vector solo.
p120ctn isoforma 3-hasta podría regular la expresión de ciclina D1 mediante la regulación de la nuclear /citoplasmática de transporte de Kaiso
Para probar si Kaiso tiene un papel en la regulación de la expresión de la ciclina D1, transfectadas transitoriamente Kaiso en células A549, que expresan solamente una cantidad menor de Kaiso. Kaiso sobreexpresión llevado a reducir la expresión de ciclina D1 y ciclina E (Figura 7A y la Figura S7A). En consecuencia, cuando Kaiso fue derribado por siRNA, no se mejoró la expresión de ciclina D1 y ciclina E en células SPC, que expresan niveles relativamente altos de Kaiso (Figura 7B y la figura S7B).
análisis de Western blot (A) mostrar el aumento de expresión de Kaiso en células A549 transfectadas con Kaiso cDNA. Kaiso sobreexpresión notablemente reducido regulado la expresión de ciclina D1 (p = 0,000) y ciclina E (p = 0,003). (B) Western blot análisis muestran una expresión reducida de Kaiso en las células SPC transfectadas con siRNA Kaiso. Kaiso interferencia aumentó significativamente la expresión de ciclina D1 (p = 0,001) y ciclina E (p = 0,012). Conclusiones generales sugieren que Kaiso podría regular la expresión de la ciclina D1 y ciclina E. (C) Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) ensayo confirmó el anticuerpo monoclonal Kaiso podría precipitar el fragmento de promotor del gen de la ciclina D1 que contiene KBS. Kaiso podría unirse a KBS de promotor de la ciclina D1. Todas las comparaciones se realizan en el grupo de células transfectadas con el vector solo
El uso de BLAST para encontrar la secuencia del promotor de ciclina D1. (GenBank: AY439218.1), se identificó la secuencia de unión específica Kaiso (KBS , TCCTGCNA), que se encuentra en la región de -1059 pb a -1066 pb. El chip de ensayo fue entonces realizó y demostró que Kaiso se asoció con KBS en el promotor de la ciclina D1 en los dos A549 y SPC células (Figura 7C).
Co-inmunoprecipitación se llevó a cabo después de fraccionamiento de la célula. Los ensayos revelaron que el anticuerpo monoclonal p120ctn podría precipitar la proteína con eficacia tanto en Kaiso citoplasma y núcleo, mientras que el p120ctn-1, 2 anticuerpos monoclonales (6H11) no podían hacerlo (Figura 8A y B) específico. Cuando se repitió la co-inmunoprecipitación después de la sobreexpresión de isoformas p120ctn 1 y 3, respectivamente, se ha demostrado que la sobreexpresión de p120ctn-3A llevó a más proteína Kaiso precipitado por el anticuerpo monoclonal p120ctn, pero no hubo ningún cambio después de la sobreexpresión de p120ctn-1A en comparación con el control. Cuando se utiliza el 2 anticuerpos monoclonales específicos p120ctn-1, (6H11), Kaiso aún no podía ser precipitado después de p120ctn-1a se incrementó significativamente (Figura 8C). Puesto que hay principalmente isoforma p120ctn 1 y 3 en las dos líneas celulares de cáncer de pulmón, pensamos que Kaiso podría unirse a p120ctn isoforma 3, pero no a p120ctn isoforma 1 in vivo dado los resultados antes mencionados.
(A y los ensayos B) Co-inmunoprecipitación mostraron que el anticuerpo monoclonal p120ctn (el panel inferior de la columna izquierda en la figura 8A), pero no el anticuerpo específico p120ctn-1,2 monoclonal (6H11) (el panel inferior de la columna derecha en la Figura 8A), pueden precipitar eficazmente proteína Kaiso tanto en el núcleo como en el citoplasma (Figura 8B). Sin embargo, el anticuerpo monoclonal Kaiso no puede precipitar eficazmente p120ctn (el panel superior de columna del medio en la figura 8A). (C) Co-inmunoprecipitación con mAb suficiente p120ctn después de la sobreexpresión de p120ctn-1 o 3 isoforma mostró que la sobreexpresión de p120ctn-3 llevó a Kaiso más proteínas precipitadas en las células A549. Ningún cambio se detectó cuando isoforma p120ctn 1 se sobreexpresa, en comparación con el control. p120ctn-1 específica, 2 anticuerpos monoclonales (6H11) no podría precipitar Kaiso cuando p120ctn isoforma 1 se incrementó significativamente. Cabe destacar la presencia de p120ctn después de coprecipitación con 6H11 pero ausencia de kaiso en el precipitado, lo que sugiere que no hay interacción significativa entre p120 isoforma 1, 2 y kaiso. Puesto que hay isoformas principalmente p120ctn 1 y 3 en las dos líneas celulares de cáncer de pulmón, pensamos que podría obligar a Kaiso p120ctn isoforma 3, pero no p120ctn isoforma 1 in vivo.
Kaiso se localiza principalmente en el citoplasma de las células SPC, que expresan niveles relativamente altos de p120ctn. Por el contrario, casi todas las proteínas Kaiso están presentes con distribución nuclear en las células SPC-K2, que han p120ctn empobrecido. Diferentes efectos de dos isoformas p120ctn en Kaiso localización subcelular fueron examinados después de la restitución de dos isoformas, respectivamente, en las células SPC-K2. Restauración de la isoforma p120ctn 3 por transfección de p120ctn-3A inducida distribución citoplasmática de Kaiso, mientras que Kaiso se mantuvo esencialmente en los núcleos de las células SPC-K2 cuando isoforma p120ctn 1 fue restaurada por transfección de p120ctn-1A (Figura S8A). Del mismo modo, Kaiso se localizó predominantemente en los núcleos de las células A549, que expresan solamente una cantidad menor de p120ctn. La sobreexpresión de p120ctn-1A no alteró significativamente la distribución de Kaiso, mientras que la sobreexpresión de p120ctn-3A resultó en Kaiso exportación desde el núcleo (Figura S8B). Estos hallazgos sugieren que un alto nivel de p120ctn-3A puede ser capaz de promover la exportación nuclear de Kaiso, pero p120ctn-1A no parecen tener esta función.
Además, cuando las células A549 transfectadas con p120ctn-3A se incubaron con LMB para bloquear la exportación nuclear de isoforma p120ctn 3, Kaiso se observó a ser confinado en el núcleo, junto con isoforma p120ctn 3. Correspondientemente, la sobreexpresión de p120ctn-3A mediante la transfección de NLS-p120ctn-3A, objetivo nuclear un p120ctn-3A plásmido de localización, en células SPC-K2 resultó en una distribución de Kaiso predominantemente en el núcleo (Figura S8B).
además, confirmó la distribución citoplasmática y nuclear de p120ctn y Kaiso por transferencia Western después del fraccionamiento celular (Figura 9A ). Los resultados fueron consistentes con los observados en los experimentos de inmunofluorescencia descritos anteriormente.
(A) Transfección de p120ctn-3A en células A549 aumentó significativamente Kaiso en el citoplasma (CYTO, *, p = 0,000) y redujo Kaiso en el núcleo (NE, *, p = 0,000). Sin embargo, no se encontró diferencia significativa de localización subcelular de Kaiso entre las células de sobreexpresión p120ctn-1A y células de control (CYTO, **, p = 0,135, NE, **, p = 0,774). Estos resultados sugieren que un alto nivel de p120ctn-3A puede ser capaz de promover la exportación nuclear de Kaiso, pero p120ctn-1A no parecen tener esta función. La incubación de células transfectadas con p120ctn-3A con LMB o transfección de NLS-p120ctn-3A en células A549 aumentó p120ctn-3A nuclear (*, p = 0,000, o +, p = 0,000) y Kaiso nuclear (NE, +, p = 0,000 o ++, p & lt; 0,001), pero redujo citoplásmica Kaiso (CYTO, +, p = 0,000 o ++, p = 0,002) en comparación con las células con solamente overexpressed p120ctn-3A, lo que implica que la exportación nuclear de Kaiso es probable que sea p120ctn-3-dependiente. (B) la sobreexpresión p120ctn-1A no cambió la unión de Kaiso de KBS en el promotor de ciclina D1, mientras que la sobreexpresión p120ctn-3A reduce significativamente la unión de Kaiso de KBS en el promotor de la ciclina D1.
unos resultados interesantes fueron observados en los ensayos de chip posteriores. La sobreexpresión de p120ctn-3A reduce significativamente la unión de Kaiso de KBS, mientras que la sobreexpresión de p120ctn-1A no cambió la unión (Figura 9B).
En resumen, los resultados anteriores sugieren que p120ctn-3A probable ascendente regular la ciclina D1, facilitando la exportación nuclear de kaiso, y por lo tanto, se suprime el efecto negativo de Kaiso de ciclina D1 expresión génica.
Discusión
Hemos demostrado que el agotamiento de p120ctn en células A549 y SPC, que no muestran la localización p120ctn membranosa, dio lugar a un aumento de células en la fase G1 y las células en la fase S, así como la proliferación celular reducida disminuido, lo que sugiere p120ctn puede afectar a la progresión del ciclo celular y la proliferación celular. Desde que se observó reducción de la expresión de la ciclina D1 y ciclina E en las células p120ctn empobrecido, se pensó que p120ctn podría regular la progresión del ciclo celular y la proliferación celular por alteración de la expresión de la ciclina D1 y ciclina E, los moduladores esenciales de la G0 /G1-S punto de control [13]. Nicolas T. et al. informó de que p120ctn isoforma 3 podría afectar ciclo celular y la proliferación celular mediante la estabilización de la ciclina E [4]. Por el contrario, nuestros datos sugieren un mecanismo diferente por el hecho de que el aumento de expresión de la ciclina E corresponde a la regulación de la ciclina D1 en las células agotadas de p120ctn pero repletos de cualquiera p120ctn-1A o 3A. Además, cuando derribado ciclina D1 por siRNA en las células agotadas de p120ctn, la expresión de la ciclina E se no aumentó, pero disminuyó ligeramente, aunque isoforma p120ctn 1 o 3 se aparentemente restaurados por co-transfección de cualquiera de isoforma de plásmido de ADN. Se observó un fenómeno similar cuando la ciclina D1 fue bloqueada por incubación del anticuerpo monoclonal (100 ng /ml, 48 h) en las células p120ctn reconstituido, lo que implica un papel fundamental de la ciclina D1 en la regulación de la expresión de ciclina E por cualquiera de isoforma p120ctn 1 o isoforma 3. Además , cuando la traducción de ciclina D1 mRNA en el A549 fue interrumpida por siRNA, tanto en los niveles de transcripción y proteínas de la ciclina e eran correspondientemente reguladas hacia abajo, lo que sugiere p120ctn no sólo podría estabilizar la proteína ciclina e como se informó anteriormente, sino también promover la transcripción de la ciclina e, presumiblemente a través de una mayor expresión de la ciclina D1.
los datos del presente estudio demostró tanto p120ctn isoforma 1 y 3 podrían hasta de regular la expresión de ciclina D1, aunque no se ha aclarado del todo cómo las diferentes isoformas p120ctn, especialmente isoforma 3 , lograr esta función. Nuestro estudio demostró que la isoforma p120ctn 1 podría hasta de regular la expresión de β-catenina, especialmente el aumento de la forma activa de la β-catenina, mientras que la isoforma 3 podría interactuar con Kaiso. Aunque isoforma p120ctn 1 se sobreexpresa en las células A549 transfectadas con p120ctn-1A, el complejo p120ctn-1 /Kaiso no se detectó, lo que implica un bajo nivel de p120ctn isoforma 1 en el A549 no es la causa de este complejo de proteínas indetectable. De esta manera, se plantean cuestiones de por qué isoforma 1 no podía interactuar con Kaiso y por qué isoforma 3 no podía regular hasta-β-catenina. La hipótesis de que la diferencia funcional podría ser debido a las variaciones estructurales de estas dos isoformas en el extremo N-terminal. El gen CTNND1 humano comprende 21 exones y codifica potencialmente hasta 48 isoformas de la proteína debido a múltiples eventos alternativos inter e intra-exonic empalme [14]. isoformas humanas, designados 1 a 4, se diferencian entre sí en el codón de inicio utilizado. Varios dominios han sido identificados en p120ctn, incluyendo el dominio de bobina en espiral se encuentra sólo en la isoforma 1. De hecho, p120ctn isoforma 1 es más larga que la isoforma p120ctn 3 por 101 residuos de aminoácidos en el N-terminal [14] - [15]. Con el fin de responder a las dos preguntas dadas anteriormente, se construyeron dos mutantes de p120ctn isoforma 1 con secuencias de péptidos truncados en el extremo N-terminal (M1, M2).
Nuestros datos sugieren que, en primer lugar, la supresión de la N-terminal 56 a 101 (N-56-101) residuos de aminoácidos de la isoforma p120ctn 3 podría explicar la falta de efecto regulador sobre la β-catenina, mientras que la isoforma p120ctn 1, que tiene un dominio intacto N-terminal, mostró una positiva efecto regulador (Figura 6); en segundo lugar, la existencia de N-1-55 residuos de aminoácidos, que forman un dominio de bobina en espiral, en isoforma p120ctn 1 puede impedir que predominantemente de la unión a Kaiso (Figura S9), aunque los residuos de N-56-101 aminoácidos pueden jugar un papel menor en su interacción.
en el presente estudio, se demostró un aumento de la forma activa de la β-catenina y sin cambios en el nivel de transcripción en las células con sobreexpresión de la isoforma p120ctn 1A. El hallazgo es consistente con lo que se ha descrito previamente en la literatura. Se ha informado de que, en condiciones in vivo, p120ctn isoforma 1 directa o indirectamente interacciona con algunas de las proteínas de llave conocidas para regular la estabilidad β-catenina como Axin y GSK-3, además, que comparte con los mismos mecanismos de regulación ß-catenina de estabilidad metabólica [16]. La sobreexpresión de la isoforma 1 p120ctn puede ocupar más sitios de unión sobre la destrucción complejos que contienen Axin y GSK-3β y, como consecuencia, causar reducción de la degradación de β-catenina mediante su sustitución por la destrucción complejos. Los sitios de unión de p120ctn con GSK-3β y CK1α se encuentran en el dominio N-terminal de p120ctn, y, por lo tanto, la proteína p120ctn isoforma 1, que tiene el dominio N-terminal completa, sería sometida a la regulación de la destrucción- complejo [16]. Los resultados de este estudio sugieren que el dominio más específica, precisamente los residuos de aminoácidos N-56-101, puede estar implicada en la degradación de la isoforma p120ctn 1. Además, p120ctn-1 M1 construido en este estudio es estructuralmente el mismo que p120ctn isoforma 2 y también mostró sobre regulación de β-catenina (Figura 6), lo que sugiere que p120ctn isoforma 2 también puede contribuir, junto con GSK-3β y CK1α y ser regulados por la destrucción del complejo.
el dominio espiral de la bobina