Extracto
PBX1 es un factor de transcripción implicado CUENTO homeodominio en la organogénesis y la tumorigénesis. Aunque se ha demostrado que las células de cáncer de ovario, de mama y melanoma dependen de PBX1 para el crecimiento celular y la supervivencia, el mecanismo molecular de cómo PBX1 promueve la tumorigénesis sigue siendo poco clara. A continuación, se aplicó un enfoque integrado mediante la superposición de objetivos PBX1 chip-chip con el transcriptoma PBX1 reguladas en las células de cáncer de ovario para identificar los genes cuya transcripción fue regulada directamente por PBX1. Se determinó aún más si los genes diana PBX1 identificados en las células de cáncer de ovario fueron co-sobreexpresa con PBX1 en tejidos de carcinoma. Mediante el análisis de genes TCGA expresión de microarrays de datos de los carcinomas serosos de ovario, encontramos co-regulación al alza de PBX1 y un número significativo de sus genes diana directos. Entre los genes diana PBX1, se seleccionó una MEOX1 proteína homeodominio cuyo ADN vinculante motivo fue enriquecida en secuencias de ADN PBX1-immunoprecipicated para el análisis funcional. Hemos demostrado que la proteína interactúa con la proteína MEOX1 PBX1 y la inhibición de MEOX1 produce un fenotipo inhibidor del crecimiento similar a la supresión de PBX1. Además, MEOX1 ectópica expresó rescató funcionalmente el efecto PBX1-retirado, lo que sugiere MEOX1 media la señal de crecimiento celular de PBX1. Estos resultados demuestran que MEOX1 es un gen diana crítica y cofactor de PBX1 en los cánceres de ovario
Visto:. Thiaville MM, Stoeck A, Chen L, Wu R-C, Magnani L, Oidtman J, et al. (2012) Identificación de Genes PBX1 diana en las células cancerosas mediante cartografía mundial de PBX1 sitios de unión. PLoS ONE 7 (5): e36054. doi: 10.1371 /journal.pone.0036054
Editor: Jindan Yu, de la Northwestern University, Estados Unidos de América
Recibido: 9 de diciembre de 2011; Aceptado: March 26, 2012; Publicado: May 2, 2012
Derechos de Autor © 2012 Thiaville et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por conceder Sociedad Americana del cáncer RSG-08-174-01-GMC y subvenciones del NIH /NCI: R01CA148826, R01CA103937, R01CA129080, y U24CA160036. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
leucemia de células B Pre homeobox-1 gratis (
PBX1
) pertenece al cuento (extensión de lazo de tres aminoácidos) de la familia de proteínas del homeodominio atípicos, cuya miembros se caracterizan por una inserción de tres residuos en la primera hélice del homeodominio [1]. proteína PBX1 interactúa con otras proteínas nucleares que contiene homeodominio tales como HOX y MEIS para formar complejos de transcripción heterodiméricos. Los estudios bioquímicos han demostrado que PBX1 y HOX interactúan a través de los contactos entre el homeodominio PBX1 y una secuencia de hexapéptido conservado en la proteína HOX [2]. De rayos X estudios cristalográficos han demostrado además que la dimerización PBX1-Hoxb1 está mediada por la unión del hexapéptido HOX a un bolsillo en PBX1 situado entre la inserción de tres residuo y la tercera hélice del homeodominio PBX1 [3]. La heterodimerización de PBX1 y HOX regula cooperativamente afinidad y especificidad de su unión a secuencias de ADN diana [4], [5].
Dado su papel fundamental en la regulación de la transcripción, que no es ninguna sorpresa que PBX1 está implicada en una variedad de procesos biológicos de la determinación del destino celular durante la organogénesis para el desarrollo de los cánceres humanos [6], [7], [8]. Expresión de PBX1 es temporal y espacialmente regulado para controlar el desarrollo de órganos de bazo, páncreas, riñón, glándula suprarrenal, y el esqueleto [9], [10], [11], [12], y está implicado en el desarrollo de conducto Mülleriana que después, se desarrolla en el tracto genital de la mujer [13]
.
resultados emergentes han indicado un papel de PBX1 en el cáncer humano. Se encontró que el complejo heterodímero PBX1-HOX a contribuir a la actividad oncogénica en cáncer de mama y melanoma. Se encontró una proteína PBX1 dominante negativo o HOX motivo hexapéptido que interrumpe la interacción entre PBX1 y HOX para reducir significativamente la proliferación de estas células de cáncer [14], [15], [16], [17]. Por otra parte, PBX1 actúa como un factor pionero en el cáncer de mama, la remodelación de la cromatina para favorecer la contratación de los receptores de estrógenos alfa (ERA) [18]. PBX1 se ha demostrado también ser un efector aguas abajo de la vía de señalización de Notch, que se activa con frecuencia en ovario, cervical, y ciertos tipos de carcinomas de mama [8], [19], [20]. A la luz de la posible función de PBX1 en varios tipos de cáncer, la identificación de los genes diana PBX1 la transcripción en células de cáncer es fundamental para dilucidar sus mecanismos oncogénicos. En este estudio, hemos realizado un análisis integrado para identificar los genes cuyos promotores fueron ocupadas por la proteína PBX1 y cuyos niveles de expresión estaban regulados por PBX1. Nos hemos centrado en una PBX1 gen diana directa,
MEOX1
, y ha demostrado su participación en el crecimiento de células tumorales mediada por PBX1, así como su interacción directa con PBX1.
Resultados
mapeo global de PBX1 sitios en células de cáncer de ovario
Desde PBX1 es un factor de transcripción nuclear que se une a promotores específicos, hemos tratado de identificar los sitios de unión PBX1 en el genoma del cáncer humano utilizando chip-chip análisis de unión. Una línea celular de cáncer de ovario, OVCAR3, se seleccionó porque esta línea celular se había informado anteriormente para sobreexpresar PBX1, y era dependiente de la expresión PBX1 para la supervivencia celular [8]. Los fragmentos de ADN PBX1 unida enriquecidas por chip se hibridan con una matriz que contiene el promotor humano 18,028 promotores de genes, lo que representa un total de 24,659 transcripciones. IgG se utilizó como control negativo en un inmunoprecipitación paralelo. Cualquier picos positivos superpuestos los de la IgG de control fueron excluidos de la lista pico PBX1. El uso de un ≤0.2 relación falso descubrimiento (FDR), se identificaron 2.299 promotores únicos que mostraron señales de unión PBX1 significativas (Tabla S1). Los datos de chip-chip se utilizaron para calcular la distribución de unión pico PBX1 en toda las regiones promotoras, y se encontró que los sitios de unión PBX1 produjeron a lo largo de las regiones promotoras (Fig. 1). También se realizó el chip-chip para determinar la distribución de la ARN polimerasa II, H3K4me3, y H3K27me3 en regiones promotoras (Fig. 1), y probamos su promotor co-ocurrencia con objetivos PBX1. Los resultados indicaron que el promotor PBX1 unión co-producido con los tres marcadores de la prueba, con PBX1-RNA polimerasa II siendo la más significativa par co-ocurrencia (Tabla S2). No hubo significativa co-ocurrencia entre H3K4me3 y H3K27me3, lo que indica que estas dos marcas de histona ligados a los promotores de un conjunto distinto de los genes.
Los histogramas muestran la distribución de la frecuencia de unión a pico con respecto a su posición en promotores (eje x). frecuencia Encuadernación como se muestra en el eje y se determinó por el número de eventos de unión de los picos en lugares específicos de promotor. SST:. La transcripción de inicio del sitio
cofactores potenciales que colaboran con PBX1
Mediante el análisis de secuencias de ADN enriquecidos por PBX1 chip, cis-regulador cofactores de PBX1 pudieron ser identificados mediante el análisis de motivos de unión a ADN de los factores de transcripción previamente caracterizadas. La aplicación basada en web Cistrome fue empleado para este análisis (http://cistrome.dfci.harvard.edu/ap/). Se encontró que la unión canónica PBX1 motivo para estar entre los enriquecidos significativamente motivos de secuencia (Figura 2 & Amp;. Tabla S3). Una gráfica de las distancias entre la unión PBX1 y su motivo predicha reveló una distribución (forma de campana) normal (Fig. S1). Además del motivo PBX1, GATA1, FOSL1, y JunB motivos factor de transcripción fueron significativamente enriquecido, lo que sugiere su implicación potencial con PBX1 en la regulación de la transcripción. Además, el motivo de MEIS1 que es un cofactor bien conocido de PBX1 y el motivo "TAATTA" tanto para MEOX1 y HOX también se enriquece en el PBX1 chiped secuencias
.
Ejemplos seleccionados de factor de transcripción motivos que son de unión estadísticamente enriquecido en las secuencias de ADN inmunoprecipitado PBX1
PBX1 directamente regulado transcriptoma
los factores de transcripción pueden funcionar directamente, así como por los de largo alcance o mecanismos indirectos.; por lo tanto, para identificar los genes cuya transcripción fue regulada directamente por PBX1, que solapan el transcriptoma PBX1 reguladas con los PBX1 chip-chip de genes diana. El transcriptoma PBX1 se identificó mediante la comparación de los datos de microarrays de expresión entre las células OVCAR3 siRNA tratados con siRNA tratada con PBX1 y control. La eficiencia desmontables de siRNA PBX1 fue validado por Western blot (Fig. S2). Se identificaron 2.094 genes únicos cuyos niveles de expresión fueron significativamente reguladas por PBX1 (FDR & lt; 0,01). Las vías de señalización canónica enriquecidas en el transcriptoma PBX1 incluyen la señalización de Wnt, la señalización del receptor de insulina, y la señalización mediada por endocitosis caveolar (Tabla S4).
La superposición de PBX1 chip-chip de genes diana y el transcriptoma PBX1 identificado 195 genes que estaban PBX1 posibles genes diana directos (Fig. 3A y el cuadro S5). Además, se analizó la distribución de PBX1 chip genes diana con respecto a las alteraciones en el transcriptoma en células OVCAR3 tratados con PBX1 siRNA. Hemos sido capaces de mostrar un enriquecimiento significativo de los objetivos de chip PBX1 sólo entre los genes regulados después del tratamiento PBX1 siRNA (Fig. 3B). Por el contrario, los objetivos PBX1 chip no fueron enriquecidos en genes regulados o en los genes cuya expresión se mantuvo sin cambios (FDR & gt; 0,01). Para determinar el potencial de transcripción co-regulación de los genes diana PBX1, los 195 genes identificados se cubrieron con los conjuntos de datos chip que contiene marcas de histona modificados (véase más arriba). Los resultados demostraron que la mayoría (~ 70%) de los promotores de genes diana PBX1 también contenía H3K4me3 pero sólo ~ 2% de los promotores de genes diana PBX1 contenían H3K27me3 (Fig. S3 y Columna Q en la Tabla S5). Las pruebas estadísticas demostraron que los 195 genes diana PBX1 presuntivos significativamente co-produjeron con H3K4me3 y ARN polimerasa II, pero no con H3K7me3 (Tabla S2). Tomados en conjunto, estos resultados indican que se requiere PBX1 para la expresión activa de los genes diana y los promotores de sus genes diana menudo estaban ocupados con H3K4me3, una marca asociada a la histona genes transcritos activamente
A:. Diagrama de Venn de PBX1 chip-chip de genes diana y transcriptoma PBX1 revelan un conjunto de genes que son objetivo directo los genes de PBX1 superpuestas. La lista completa de la superposición de genes se muestra en la Tabla S5. Los experimentos se realizaron en células OVCAR3. Se realizó un análisis conjunto de genes de enriquecimiento para determinar si los objetivos PBX1 chip se enriquecen en el transcriptoma PBX1: B. Genes regulados por PBX1 siRNA se enriquecen de manera significativa en el conjunto de destino PBX1 chip.
Siete candidatos representativos, sobre la base de sus funciones conocidas en la biología del cáncer, fueron seleccionados de los objetivos de 195 candidatos para la validación usando PBX1 qPCR. Los resultados confirmaron la unión específica de PBX1 a los promotores analizados (Fig. 4A), y se confirmó la transcripción baja regulación en respuesta a la caída PBX1 para cada uno de estos genes analizados (Fig. 4B).
A. Siete genes fueron seleccionados de la lista de genes diana PBX1 chip, y la ocupación de cada promotor por PBX1 fue validado por análisis chip-qPCR. ChIP se realizó utilizando ya sea IgG o el anticuerpo anti-PBX1, y el ADN inmunoprecipitado se sometió a análisis qPCR utilizando cebadores que flanquean el pico de la región unida PBX1. la regulación transcripcional de B. estos genes diana por PBX1 o MEOX1 se evaluó mediante siRNA y análisis de RT-qPCR. La expresión de los siete genes diana son significativamente las reguladas por PBX1 siRNA en comparación con el control de siRNA (de Student
t-test
,
p Hotel & lt; 0,01). A excepción de ZHX2, MEOX1 siRNA significativamente downregulated expresión de los genes de la prueba (de Student
t-test
,
p Hotel & lt; 0,01). C. validación chip-qPCR de GATA1 y MEOX1 unión cerca de las secuencias PBX1 de ruedas. Chip se realizó utilizando IgG, anti-GATA1, o anticuerpo anti-MEOX1 y el ADN inmunoprecipitado se sometió a qPCR utilizando mismos cebadores que en A. Excepto por la unión de MEOX1 a la
ZHX2
promotor, o unión de GATA1 MEOX1 a los promotores de genes es significativamente mayor que la unión de IgG a los mismos promotores (de Student
t-test
,
p Hotel & lt; 0,01).
para determinar si los posibles cofactores PBX1 identificadas a partir del análisis motivo descrito anteriormente co-ocurren con PBX1 unión en regiones promotoras, se realizó un chip-qPCR para GATA1 y MEOX1 usando cebadores de PCR que flanquean las secuencias de unión PBX1 pico. El análisis de transferencia Western demostró que los dos factores de transcripción se expresaron en células OVCAR3 (Fig. S4A). Chip-qPCR demostró que GATA1 obligado a todos los promotores de la prueba y MEOX1 estaba presente en 6 de las 7 promotores de la prueba (
t de Student
- prueba,
p Hotel & lt; 0,01; figura 4C.).
Correlación de expresión y PBX1 gen diana en tejidos de cáncer de ovario
para extrapolar el significado biológico de los genes diana PBX1 identificados en la línea celular OVCAR3 con respecto al cáncer de los tejidos humanos, se realizó
in silico
análisis mediante un acceso público de microarrays de expresión de datos [21] para determinar si la expresión PBX1 se correlacionó con sus genes diana en 9 diferentes tipos de tejidos de carcinoma. Un total de 86 candidatos genes diana PBX1 fueron identificados en el conjunto de datos de microarrays [21], y estos genes se les preguntó en Oncomine. Los resultados demostraron que el carcinoma de ovario tiene un alto nivel de expresión PBX1 en comparación con los otros 8 tipos de cánceres (Fig. 5). Por otra parte, 28 de los 86 genes consultados fueron significativamente hasta reguladas en los cánceres de ovario en comparación con otros carcinomas (
p Hotel & lt; 0,05).
metanálisis Oncomine se realizó en un anterioridad publicada gen conjunto de datos de microarrays de expresión que contiene nueve tipos de tumores diferentes. Los genes se clasifican de acuerdo a su sobre-expresión en el cáncer de ovario y los mejores 18 genes se representaron.
El TCGA de ovario seroso conjunto de datos de cáncer recientemente disponibles nos permitió realizar el análisis estadístico para determinar la co-regulación al alza de PBX1 y sus genes diana en carcinomas de ovario. De los 195 posibles genes diana PBX1, un análisis más detallado se realizó en un total de 137 para los cuales los datos de expresión de genes estaban presentes en los tres diferentes plataformas de microarrays disponibles desde el Portal CBio Genómica del Cáncer (http://www.cbioportal.org/public-portal /). Entre estos genes diana 137 PBX1, 53 genes mostraron una tendencia a la co-regulación al alza con PBX1 (odds ratio & gt; 1,5), de los cuales 18 (13.1%) fueron significativas (
p Hotel & lt; 0,05). Esto es más alto de lo que cabría esperar por azar (
p = 0,013
, prueba de Chi-cuadrado), debido a la aplicación del mismo análisis a todo el conjunto de 11,201 genes disponibles para el análisis reveló que sólo 873 (7,8%) los genes mostraron tanto una odds ratio mayor de 1,5 y
p Hotel & lt; 0,05. La razón de probabilidad e importancia (
p-valor
) de co-regulación al alza de PBX1 y sus genes diana se muestran en la Tabla S5 columnas H e I, respectivamente.
MEOX1 interactúa directamente con PBX1 y rescata los PBX1-retirado efecto
se seleccionaron
MEOX1
, uno de los objetivos directos de PBX1, para estudios funcionales adicionales. Al igual que PBX1, MEOX1 es una proteína homeodominio y potencialmente puede interactuar con PBX1 para formar complejos de transcripción heterodiméricos. Por lo tanto, nos preguntamos si MEOX1 y PBX1 interactuaron físicamente en las células. Un experimento de co-inmunoprecipitación se realizó en células HEK293 transfectadas con PBX1-V5 y vectores de expresión de ADNc MEOX1-FLAG. Los resultados demostraron que PBX1 desplegable utilizando una proteína MEOX1 enriquecido significativamente anticuerpo V5 detectada por Western blot con un anticuerpo FLAG (Fig. 6A). Recíproco co-inmunoprecipitación confirmó que MEOX1 co-inmunoprecipitó con PBX1 (Fig. 6A).
A. células HEK293 se transfectaron con PBX1-V5 y /o vectores de expresión MEOX1-FLAG. Inmunoprecipitación y Western blot se realizaron utilizando anticuerpos específicos de epítopo-tag. B. Panel izquierdo: OVCAR3 células fueron transfectadas con el vector de expresión MEOX1 o vector de control. Western blot se realizó para probar la expresión MEOX1 (arriba). Las mismas células fueron transfectadas con siRNA PBX1 o control siRNA y Western blot se realizó para probar la baja regulación de la proteína PBX1 (en el centro). La detección de proteína GAPDH se utilizó como control de carga (parte inferior). Panel derecho: el número de células relativas se midieron en células OVCAR3 transfectadas con cDNA MEOX1, PBX1 siRNA, el plásmido de control (pLPC), y el control de siRNA (siLUC). Estudiante de
t-test
se utilizó para determinar la significación entre el grupo MEOX1 sobreexpresado y el grupo control.
También probamos un panel de genes regulados PBX1 para determinar si MEOX1 estaba involucrado en la regulación de su transcripción. Usando MEOX1 siRNA, hemos encontrado que la expresión de seis de los siete genes PBX1 reguladas también era dependiente de MEOX1. Además, se encontró que los
PBX1
transcripción dependía de MEOX1, como MEOX1 siRNA redujo la
PBX1
nivel de ARNm. Recíprocamente, el
MEOX1
nivel de ARNm se redujo reguladas por la caída PBX1. Estudios anteriores han demostrado que PBX1 era esencial para el crecimiento celular en células de cáncer de ovario incluyendo OVCAR3; aquí, se realizó siRNA desmontables para determinar si MEOX1 caída produjo un fenotipo similar a la caída PBX1. Los resultados demostraron que MEOX1 desmontables redujo significativamente el crecimiento celular en células OVCAR3, un fenotipo que se asemeja el efecto PBX1-retirada (Fig. S5).
Para probar si MEOX1 mediada la función de crecimiento de células de PBX1, que expresa constitutivamente MEOX1 (dirigido por un promotor CMV) y suprimió la expresión PBX1 usando siRNA. Se encontró que el constitutivos de expresión MEOX1 células parcialmente protegidos de la supresión del crecimiento inducida por la retirada PBX1, como se observaron significativamente el número de células mayor en las células MEOX1 transfectadas en comparación con las células control plásmido transfectadas (Fig. 6B). Estos hallazgos sugieren que MEOX1 es un mediador esencial de la señal de crecimiento relacionado PBX1-, aunque la expresión de MEOX1 sí mismo no es suficiente para estimular la proliferación celular (Fig. S6).
Discusión
El homeobox familia de genes, que es fundamental en la regulación transcripcional, codifica las proteínas nucleares que contienen de unión al ADN homeodomains altamente conservadas [22]. proteínas homeobox están involucrados en actividades críticas durante el desarrollo y la tumorigénesis. En este informe, nos centramos en uno de los genes homeobox, PBX1, que fue encontrado a desempeñar un papel crítico en el cáncer de ovario, con la intención de identificar y caracterizar su red transcripcional en las células cancerosas. El análisis de la integración de los promotores de genes vinculados por PBX1 y el transcriptoma PBX1 nos ha permitido identificar los genes regulados directamente por PBX1.
La solidez de nuestro ensayo chip-chip de todo el genoma se evidencia por la observación de que el motivo canónico es PBX1 altamente enriquecida en las secuencias de PBX1 chiped. Hemos demostrado que los objetivos de chip 195 PBX1 se superponen significativamente con el promotor de ocupación de la ARN polimerasa II y H3K4me3, una marca de histona asociado con la transcripción activa, pero no con H3K27me3, una marca de histona asociada con la represión de la transcripción. Además, se encontró que los objetivos de ChIP fueron significativamente enriquecido sólo entre genes cuya transcripción está soportado por PBX1 (downregulated por PBX1 siRNA), pero no entre los genes cuya transcripción se suprime o no afectado por PBX1. Estos datos tomados en conjunto apoyan la opinión de que PBX1 sirve principalmente como un activador transcripcional en lugar de un represor en células de cáncer de ovario
.
El actual estudio también reveló potenciales cis-regulador cofactores de PBX1, que incluyen GATA1, FOSL1, MEIS1 , JUNB, y un motivo "TAATTA" para MEOX1 [23] y HOX [24]. Los motivos de estos cofactores de transcripción fueron significativamente enriquecido en secuencias PBX1 de ruedas, lo que sugiere que estas proteínas pueden trabajar en conjunto con PBX1 para facilitar la regulación transcripcional. Curiosamente, varios de estos cofactores PBX1 potenciales, incluyendo BCL6 y MEOX1, se identificó también está directamente regulada por PBX1, lo que sugiere un control transcripcional de auto-regulación de estos genes. El actual estudio se centró en MEOX1 para evaluar su actividad co-co-regulador vinculante y con PBX1. Otros experimentos deben llevarse a cabo para determinar si otros cofactores sirven como co-factores regulatorios con PBX1 en las células cancerosas.
Otro hallazgo interesante en este estudio es la identificación de un nuevo papel en la patogénesis de MEOX1 cáncer. Aunque MEOX1 está bien establecido como uno de los reguladores transcripcionales clave durante el desarrollo embrionario, nuestros resultados demuestran que MEOX1 también está involucrado en el desarrollo del cáncer a través de participar en la red PBX1 transcripcional. El hecho de que MEOX1 es co-upregulated con PBX1 en un subconjunto de carcinomas de ovario (Fig. 5) sugiere que un eje molecular PBX1-MEOX1 está implicado en la regulación transcripcional de estos carcinomas. Basado en este razonamiento, se realizó un ensayo de "rescate" expresando ectópica MEOX1 en las células cancerosas con caída PBX1. Nuestro resultado muestra que la expresión MEOX1 invirtió el efecto inhibidor del crecimiento de caída PBX1 sugiere que MEOX1 media la función de soporte del crecimiento de PBX1 en células de cáncer de ovario. Tanto PBX1 y MEOX1 pertenecen a la familia del homeodominio, cuyos miembros suelen interactuar con otras proteínas homeodominio para generar complejos de proteínas heterodiméricas que son los mediadores funcionales de la regulación transcripcional. De hecho, nuestro experimento co-inmunoprecipitación demostró interacción de las proteínas PBX1 y MEOX1, lo que sugiere que MEOX1 puede ser un cofactor homeodominio crítica de PBX1. Por lo tanto, PBX1 parece actuar no sólo como un regulador de aguas arriba, sino también como un cofactor de unión de MEOX1. Este hallazgo es una reminiscencia de un estudio anterior que demuestra que PBX1 y Hoxb1 cooperan en la regulación de la expresión de la actividad Hoxb1 en tejidos de ratón [25]. Se puede prever que este bucle de auto-regulación positiva opera para asegurar la actividad transcripcional sostenida de otros genes regulados PBX1
.
Los resultados aquí presentados como un primer paso hacia la comprensión de la red de regulación compleja de PBX1 en carcinomas. A medida que se perfila el papel de PBX1 en tumores sólidos humanos, los genes diana controladas directamente por PBX1 informado en este documento servirán como pasos para descifrar cómo PBX1 contribuye al desarrollo de tumores. Este estudio también plantea varias cuestiones importantes aún no se ha abordado. Por ejemplo, sería interesante para probar si los genes regulados PBX1 identificados en el carcinoma de ovario se comparten con el funcionamiento de la maquinaria durante el desarrollo de órganos. Desde la sobreexpresión de PBX1 y MEOX1 es relativamente específico para el cáncer de ovario en comparación con otros tumores sólidos (Fig. 5), la importancia biológica de PBX1 y MEOX1 co-expresión y su cooperación en la regulación transcripcional es probable que sean contexto y tejido dependiente . Desde esta perspectiva, sería importante determinar si MEOX1 modula la afinidad y selectividad secuencia diana unión del complejo de transcripción PBX1 en el cáncer de ovario, y en última instancia, sería interesante determinar cómo PBX1 /MEOX1 la formación del complejo promueve la oncogénesis.
Materiales y Métodos
líneas celulares
Las líneas celulares utilizadas en este estudio incluyó una línea celular de cáncer de ovario, OVCAR3, y una línea de células epiteliales de riñón embrionario, HEK293. Ambas líneas celulares se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia). Las líneas celulares se mantuvieron en RPMI1640 suplementado con suero bovino fetal al 5% y antibióticos. No hubo evidencia de contaminación por micoplasma basado en un ensayo de PCR.
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) Análisis
Para cada inmunoprecipitación, aproximadamente 12 × 10
Se han usado 6 OVCAR3 células. Las células se sembraron en placas de 150 mm y se cultivaron hasta 80% de confluencia. Las células se fijaron mediante la adición de formaldehído (1% de concentración final) a los medios de cultivo y de la incubación durante 10 min. La reacción se interrumpió con glicina 125 mM durante 5 min. Las células se lavaron en DPBS, núcleos hinchados en los núcleos de tampón de hinchamiento (tubos de 5 mM de pH 8,0, KCl 85 mM, 0,5% de NP 40), y se lisaron en tampón de lisis núcleos (1% de SDS, EDTA 10 mM, 50 mM Tris-HCl , pH 8,0). núcleos lisadas se sometieron a ultrasonidos en un baño de ultrasonidos Fisher modelo 100 para 5 ciclos de 40 seg pulso constante con 2 minutos de incubación en hielo entre los pulsos. Los lisados sonicados se diluyeron en tampón de dilución de chip (0,01% de SDS, 1,1% Triton X-100, EDTA 1,2 mM, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 167 mM) y se incubaron con Proteína G Sepharose (Invitrogen) durante 1 hr. Las bolas fueron retirados, y el talón borran lisados se incubaron con anticuerpos contra PBX1, GATA1, o MEOX1 (Santa Cruz sc-899, SC-265 ×, y Epitomics T2204, respectivamente) durante la noche con rotación a 4 ° C. Se añadió una suspensión de Proteína 01:01 bloqueado-BSA G Sepharose a lisados de anticuerpos se incubaron a rotación a 4 ° C durante 2-3 horas. complejos de anticuerpo-proteína unidos a perlas se lavaron una vez con tampón de baja sal (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM), una vez con tampón de LiCl (0,25 M LiCl, 1% de NP 40, 1% desoxicolato de sodio, EDTA 1 mM, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0), y dos veces con TE, pH 8,0. Los complejos se eluyen de las perlas por incubación en 1% de SDS, 0,1 M NaHCO
3 (calentó a 65 ° C) durante 30 min a 37 ° C con agitación. Las muestras se trataron con NaCl 200 mM y 1 mg de RNasa A a 65 ° C durante la noche. Después de 1 hr tratamiento con proteinasa K a 37 ° C, el ADN fue purificado utilizando el kit de purificación de Qiagen QIAquick PCR y se eluyó en 100 l de TE.
Para el análisis de qPCR, se utilizó 2,5 l de muestra por reacción. PCR se realizó utilizando SYBR colorante verde y un iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA). Los números de ciclo umbral (Ct) se obtuvieron usando el software de interfaz del sistema óptico iCycler. Los cebadores de PCR fueron diseñados utilizando el programa Primer 3 (secuencias de nucleótidos de los cebadores se muestran en la Tabla S6). Los datos se normalizaron utilizando una curva patrón, que se prepara a partir de ADN de entrada sonicado (total).
chip-chip de matriz Análisis
En el análisis conjunto chip-chip, chip se realizó como se ha descrito anteriormente, excepto para la etapa de purificación de ADN. ADN fue purificado utilizando el kit de purificación de Qiagen MinElute PCR y se eluyó con 10 H2O l. Toda la muestra de ADN inmunoprecipitado fue amplificado utilizando un kit WGA2 (Sigma) y se purificó usando el kit de purificación Qiagen QIAquick PCR con un volumen de elución de 40 l en H2O. Para el ADN de entrada, 200 ng de ADN purificado fueron utilizados para WGA2 PCR. Una alícuota de cada muestra amplificada se diluyó a 5 ng /l y se utiliza para qPCR. Si 4 g de ADN no fueron producidos a partir de la PCR WGA2, 10 ng de la reacción WGA2 se reamplificaron usando el kit WGA3 (Sigma), y se prueba con cebadores de control de nuevo. Las alícuotas de cada muestra (4 mg) fueron enviados a NimbleGen para el etiquetado y la gama de hibridación. El promotor NimbleGen 385K RefSeq se utilizó matriz 1-plex para la hibridación de la muestra.
En el análisis conjunto, se utilizó el programa NimbleGen Mapa de señales para obtener picos de señal para cada muestra y su correspondencia con las cimas de sus regiones genómicas correspondientes. El uso de los GenomicRanges paquete Bioconductor (disponibles en bioconductor.org), que exhibió las regiones de pico de destino chip-chip con FDR≤0.2 superposición con picos de chip-chip de IgG no específica y descartamos aquellos picos con al menos un solapamiento pb. Los picos restantes de Target Chip-chip se consideraron positivos para la unión a proteínas.
análisis motivo de búsqueda se realizaron utilizando la herramienta de descubrimiento seqpos motivo (Cistrome, http://cistrome.org/ap/root) y la TRANSFAC motivo base de datos con los siguientes parámetros: anchura del pico a escanear = 600 pb;
p
. & Lt; 0,05 se estableció como punto de corte para la significación
Análisis de Expresión Génica matriz
Se aisló ARN de las células OVCAR3 que fueron tratadas previamente con cada PBX1 siRNA o control siRNA dirigidos gen de la luciferasa. ARN etiquetado, la hibridación a la matriz de HT-12 Expresión Illumina humana, la normalización y el análisis se realizaron mediante la instalación de Lowe Familia Genómica, la Universidad Johns Hopkins Bayview Medical Center. El factor de cambio del nivel de expresión de cada gen se calculó como la relación de tratamiento PBX1 siRNA de controlar. Como sólo había una orden de batalla en cada punto de tiempo, se utilizó el logaritmo del factor de cambio como la estadística de prueba, y se realizaron análisis de la importancia de calcular el
p-valor
, que se define como la probabilidad de obtener una prueba estadística al menos tan extremo como el observado en realidad bajo la hipótesis nula. Para la distribución nula asumimos la estadística de prueba seguía una distribución normal donde la media y la desviación estándar se calcularon a partir de las muestras de control. También implementamos Benjamini y Hochberg procedimiento [26] para múltiples pruebas de hipótesis, y se calculó la tasa de falso descubrimiento (FDR) de los genes expresados de manera significativa. Significativamente hasta regulados y genes regulados finalmente fueron determinados por un corte predefinido FDR. & Lt; 0,01
test estadístico de la superposición de genes entre los conjuntos de datos de matriz
Para evaluar la importancia de solapamiento entre los conjuntos de datos (es decir, entre el chip-chips y entre 195 genes diana y chip-chip), a fin de determinar la probabilidad de obtener el mismo número o más genes superpuestos mediante un muestreo al azar de todo el conjunto de genes. El número de genes en el conjunto completo era 18.511 para el chip-chip y 30.500 para la gama de expresión. El
p-valor
se calculó determinando las probabilidades superiores de la cola de la distribución hipergeométrica correspondiente utilizando la función phyper () en R versión 2.14.1.
Prueba estadística para la co-expresión entre PBX1 y sus genes diana
las puntuaciones Z de los datos de expresión de ARNm del estudio de cáncer de ovario TCGA fueron recuperados de la Genómica del cáncer de datos del servidor (CGDS) organizado por el Centro de cáncer Memorial Sloan-Kettering (http: //www. cbioportal.org/) utilizando el paquete 1.1.19 CGDS-R (http://cran.r-project.org/web/packages/cgdsr/index.html). Las puntuaciones Z se calcularon utilizando los tumores diploides (diploides para cada gen) como la población de referencia, y sólo los genes representados por las tres plataformas de expresión utilizados en el estudio se incluyeron TCGA [27]. Un total de 11.202 genes de 316 muestras de tumores con puntuaciones Z fueron recuperados para su análisis
El exceso de expresión de cada gen se definió por una puntuación Z & gt;. 1.65 (lo que representa el 5% de los mejores en la expresión del ARNm). La tendencia de los co-sobreexpresión de PBX1 y sus genes diana en la misma muestra se evaluó en el conjunto de muestras 316 tumoral, y se calcularon los odds ratios (OR).