Extracto
El VPH es un agente causal en muchos cánceres epiteliales, sin embargo, nuestra comprensión de la genética la susceptibilidad a la infección por VPH y el riesgo de cáncer resultante es limitada. Epidermodisplasia Verruciforme es una rara condición de extrema susceptibilidad a la infección por el VPH cutáneos principalmente atribuible a mutaciones en
TMC6
y
TMC8
. La variación genética en el
TMC6 /TMC8
región se ha relacionado con la infección por el VPH tipo beta y carcinoma de células escamosas de la piel, el cáncer de cuello uterino, la persistencia del VPH y la progresión a cáncer de cuello uterino. Aquí, hemos probado la hipótesis de que los
TMC8
rs7208422 SNP comunes están asociados con la infección por VPH de alto riesgo y el riesgo de carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC). La seropositividad a la proteína L1 del VPH (HPV 16, 18, 11, 31, 33, 35, 45, 52, 58) se midió en 514 casos y 452 controles basados en la población. El genotipo se asoció significativamente con la seropositividad para HPV18 L1 (O
TT vs AA = 0,48; IC del 95% = 0,22-0,99) y el límite asociado significativamente con HPV16 L1 (O
TT vs AA = 0,58; IC del 95% = 0,22-1,17). Hubo una asociación inversa entre la constante
TMC8
genotipo y la infección por otros tipos de VPH, incluidas las asociaciones estadísticamente significativas para HPV31 y HPV52. De acuerdo con estos resultados, el genotipo variante T se asoció con un riesgo reducido de CECC (O
AT: 0,63; IC del 95% 0,45 hasta 0,89, O
TT: 0.54, IC 95% 0,36 a 0,81), aunque entre los sujetos seronegativos para todos los tipos de VPH (O
AT: 0,71, IC 95% 0,45 a 1,11, O
TT: 0.54, IC 95% 0,31 a 0,93). Nuestros datos indican que la variación genética común en
TMC8
está asociada con la infección por VPH de alto riesgo y la etiología CECC
Visto:. Liang C, Kelsey KT, McClean MD, Christensen aC, Marsit CJ, Karagas MR, et al. (2015) Una de codificación de variantes en
TMC8 gratis (EVER2) está asociada con alto riesgo infección por VPH y el cáncer de cabeza y cuello de riesgo. PLoS ONE 10 (4): e0123716. doi: 10.1371 /journal.pone.0123716
Editor Académico: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos |
Recibido: 13 de diciembre de 2013; Aceptado: March 6, 2015; Publicado: 8 Abril 2015
Derechos de Autor © 2015 Liang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación: Este estudio fue apoyado por las siguientes subvenciones: NIH R01CA118443, R01CA078609. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
mutaciones nulas en
TMC6
y
TMC8
confieren susceptibilidad a la infección con extrema cutánea (tipo beta) del VPH. Estos genes codifican EVER1 y EVER2 que forman un heterodímero que interactúa con la molécula transportador de zinc ZnT-1 para controlar los niveles de zinc dentro de la célula [1]. El raro síndrome Epidermodisplasia Verrucciformis (EV) se asocia con mutación en cualquiera de estos genes y se caracteriza por un gran número de lesiones planas como infectados con beta-HPV, principalmente virus HPV5 y HPV8. Anteriormente, se observó que la variación genética en
TMC8
se asoció con la seropositividad al VPH cutáneos (beta) y mayor riesgo de cáncer de piel de células escamosas (SCC) [2]. Las observaciones de los pacientes de cáncer de piel EV y sugieren que el
TMC6
y
TMC8
genes podrían ser factores importantes para la protección del huésped del virus del papiloma. Mientras que el complejo de Ever proteínas se sabe que regulan la homeostasis del zinc en los queratinocitos, recientemente se ha demostrado que los
TMC6 /8
genes se expresan también en altos niveles en los linfocitos T [3,4]. Por lo tanto, la variación genética en el
TMC6 /8
genes pueden afectar la infección por VPH y el riesgo de cáncer, ya sea directamente mediante la modulación de la infección por VPH en las células epiteliales, o indirectamente a través de la vigilancia inmune.
A pesar de la variación genética común en
TMC8
se ha asociado con la infección por VPH beta, también es posible que
TMC8
variación genética contribuye a la infección por VPH de alto riesgo y el riesgo de cáncer de operadora (cervical, otra anogenital, y la cabeza y cuello tumores malignos). De hecho, el trabajo de Wang et al [5] utilizando la metodología de determinación del genotipo identificado una densa rara SNP en el
TMC6
/
TMC8
región del gen que está relacionado con la persistencia de HPV16. Un estudio más reciente de Castro et al [6], demostró que dos SNPs comunes en el gen TMC6 /TMC8 se asocian con el cáncer cervical (en ausencia de otras medidas de VPH). Si la variación común en esta región del gen confiere susceptibilidad a la infección por VPH de alto riesgo se conoce por completo. Además, el papel de este gen en otros cánceres relacionados con el VPH, como el cáncer orofaríngeo (rev en [7]), no ha sido probado. Aquí, hemos tratado de determinar si los SNP rs7208422 comunes en
TMC8
se asocia con la seropositividad a los tipos de VPH de alto riesgo y el riesgo de CECC.
Materiales y Métodos
Ética declaración
los protocolos de estudio y materiales para el reclutamiento de casos y controles fueron aprobados por las juntas de revisión institucional en los nueve centros médicos y la Universidad de Brown. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los sujetos de estudio.
Los sujetos del estudio
Este estudio de casos y controles de base poblacional se llevó a cabo en Boston, MA entre diciembre de 1999 y diciembre de 2003 y ha sido descrito previamente [8]. Los casos fueron pacientes HNSCC identificados a partir de las clínicas y departamentos de otorrinolaringología u oncología de radiación en nueve centros médicos de la zona de estudio de cabeza y cuello durante el período de estudio. casos elegibles fueron residentes en el área de estudio a partir de 18 años o más y con un diagnóstico confirmado patológicamente de CECC no más de 6 meses antes del tiempo de contacto con el paciente. Se excluyeron los pacientes con carcinoma de
In situ
, los labios, las glándulas salivales o cáncer nasooropharyngeal o CECC recurrente. El registro de cáncer se preguntó para asegurar que se identificaron todos los casos elegibles en el área. HNSCC casos incluyen códigos de diagnóstico 141-146, 148, 149, y 161 de acuerdo con la Clasificación Internacional de Enfermedades, Novena Revisión (CIE-9). Los casos fueron clasificados por sitio en orales (códigos CIE-9 143-145), orofaríngea (CIE-9 códigos 146, 148, 149), y la laringe (código ICD-9 161) enfermedad. Los controles fueron emparejados por la frecuencia de los casos de la edad (± 3 años), sexo y lugar de residencia identificados a partir de los libros de Massachusetts de la ciudad a través de la selección aleatoria sistemática. El libro ciudad incluye todos los residentes de más de 17 años de edad que aparece por la dirección de la calle y recintos. Un control potencial del mismo sexo y edad en su caso se solicitó de esta lista, alternando la dirección de búsqueda a través del libro a partir de la dirección caso.
La detección de anticuerpos a través de la serología múltiplex
venosa las muestras de sangre se obtuvieron de casos y controles. Se separó el suero dentro de 12-24 horas de la extracción de sangre y las muestras fueron almacenadas a -80 ° C. Para detectar anticuerpos contra el VPH, se utilizó ligado a enzimas de captura de una glutatión S-transferasa (GST) ensayo inmunoenzimático (ELISA), en combinación con tecnología de perlas fluorescentes, como se describe en detalle anteriormente [9,10,11,12]. Brevemente, las proteínas virales de longitud completa fusionada con un dominio GST N-terminal se expresaron en
E
.
coli
bacterias. El glutatión reticulado a la caseína se acopló a perlas marcadas por fluorescencia de poliestireno (SeroMAP microesferas, Luminex Corp., Austin, TX) y las proteínas de fusión GST fueron
in situ
purificado por afinidad en las perlas directamente en un uno procedimiento paso. Cada proteína de fusión se une a un conjunto de microesferas espectralmente distinta. La proteína de fusión cargado conjuntos de microesferas se mezclaron y se incubaron con sueros humanos. Los anticuerpos unidos a las perlas a través de los antígenos virales se detectaron con biotina IgG de cabra anti-humano (H + L) de anticuerpo secundario y estreptavidina-R-ficoeritrina. Se utilizó un analizador Luminex 100 (Luminex Corp., Austin, TX) para identificar el color interno de las perlas individuales y para cuantificar su fluorescencia reportero (expresado como la intensidad media de fluorescencia (MFI) de al menos 100 cuentas por conjunto por suero).
valores de MFI se dicotomizaron como anticuerpo positivo o negativo. Se definió un corte normalizado para HPV16, 18, 31, 33, 35, 45, 52 y 58 anticuerpos L1 anterior [13] y se aplica aquí. Seropositividad cortes de los primeros HPV16 proteínas se determinaron utilizando un algoritmo similar para las muestras de suero de 117 mujeres, de ADN del VPH negativos vírgenes, la percepción subjetiva de un estudio transversal entre los estudiantes de Corea [13]. La media más 5 desviaciones estándar se calculó, y el solo punto de corte resultante se duplicaron para separar rigurosamente reacciones positivas y negativas (VPH 16 E6, 484 IMF; VPH 16 E7 de 1096 IMF) [14]
la detección del genotipo TMC8
Se recogieron datos en una (a & gt; T) de codificación de SNP en el exón 8, codón 306 de la
TMC8
gen (rs7208422), lo que resulta en un cambio de asparagina a isoleucina. Se extrajo ADN de la capa leucocitaria usando Qiagen kits de extracción de ADN genómico. Genotipado de la
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polimorfismo se realizó utilizando la técnica de discriminación alélica TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA), según lo publicado anteriormente [2]. controles de genotipo conocido se incluyeron para cada genotipo ensayo. Para la evaluación de la calidad, cada décima de la muestra fue un duplicado incrustado, y había 100% de concordancia entre los genotipos de control de calidad.
El análisis estadístico
El análisis de datos se limitó a sujetos de raza caucásica con ambos
genotipo y serología del VPH datos. proporciones para estimar la asociación de
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genotipo y CECC, se calcularon las odds (OR) y los intervalos de confianza del 95% (IC) a partir de modelos de regresión logística incondicional. Los modelos incluyen el estudio de búsqueda de factores de género y edad, sin embargo, el tercer parámetro de coincidencia, ciudad de residencia, no se incluyó en estos modelos de regresión incondicionales dado el número de ciudades representadas. Los modelos de riesgo también se ajustaron para fumar (paquetes-año) y beber (bebidas promedio por semana). Estamos, además, realizó el análisis estratificado por sitio del tumor, así como por el estado de la serología HPV16. Para examinar la relación entre el
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marcadores serológicos y genotipo de VPH, se utilizó regresión logística con serología positiva como la variable respuesta y
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genotipo como una variable independiente. Todos los análisis estadísticos se realizaron con SAS9.1, y todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras.
Resultados
Entre los 775 sujetos, 361 casos fueron con CECC (148 cánceres de la cavidad oral, orofaringe 148 cánceres, 65 cánceres de laringe) y 414 eran los sujetos de control (Tabla 1). No hubo diferencias significativas en la distribución de edad y sexo entre los casos y los controles (Tabla 1). La mayoría de los sujetos eran varones (74%). En comparación con los controles, los casos HNSCC eran más propensos a fumar (P & lt; 0,001) y beber en exceso (P & lt; 0,001) y tenían una mayor prevalencia de seropositividad para HPV16 (P & lt; 0,0001), HPV18 (p & lt; 0,04), HPV11 (p & lt ; 0,003), HPV31 (P & lt; 0,01), HPV35 (p & lt; 0,001), HPV52 (p & lt; 0,0003) y HPV58 (p & lt;. 0.003) (Tabla 1)
Se evaluó la asociación entre genotipo y serología HPV (Tabla 2); dada la muy baja seroprevalencia entre los controles (Tabla 1), fue necesario determinar esta asociación utilizando datos de todos los sujetos.
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genotipo se asoció con la seropositividad HPV18 (O
AT: 0.65, IC 95% 0,38 a 1,11, O
TT: 0.48, IC 95% 0,24-0,99), con similares no significativa las tendencias observadas para HPV16 (O
AT: 0.91, IC 95% 0,54 a 1,55, O
TT: 0.58, IC 95% 0,22 a 1,17), HPV31 (O
AT: 0.60, IC 95%: 0,33 -1,09, O
TT: 0.48, IC 95% 0,22 a 1,04), y HPV52 (O
AT: 0,25, IC 95% 0,09 a 0,67, O
TT: 0,36; IC del 95%: 0,11- 1,13). Además, examinó la asociación entre el genotipo y la serología de los casos de cáncer de orofaringe; Se observaron similares o de, pero con imprecisión estadística (datos no mostrados).
TMC8
genotipo también se asoció con un riesgo reducido de todos los tipos de CECC (Tabla 3). En comparación con
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genotipo AA, AT y genotipos TT se asociaron inversamente con CECC (OR = 0,63; IC del 95%: 0,45-0,89 y OR = 0,4954; IC del 95%: 0,36-0,81, respectivamente). Estos resultados fueron consistentes entre los sitios anatómicos de CECC (Tabla 3). Para determinar si la asociación del genotipo era independiente de la serología del VPH, se realizó un análisis de subgrupos entre sujetos seronegativos para HPV16, así como los seronegativos para todos los tipos de VPH ensayados (Tabla 4). En consonancia con los análisis previos
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genotipo se asoció inversamente con CECC entre los seronegativos para HPV16 (O
AT = 0,67; IC del 95%: 0,45 a 1,03; O
TT = 0,58; 95% IC: 0,34 a 1,00); esta relación se mantuvo para los negativos para todos los tipos de VPH (O
AT = 0,713; IC del 95%: 0,45 a 1,11; O
TT = 0,54; IC del 95%: 0,31 a 0,93). El análisis de subgrupos restringido a los seropositivos no fue posible dada la baja prevalencia de la seropositividad entre los controles (Tabla 1).
Discusión
En nuestro estudio de casos y controles de la cabeza y los cánceres de cuello, encontramos evidencia de que la variación genética en
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se asoció inversamente con la seropositividad a los tipos de VPH de alto riesgo. Además,
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genotipo variante se asocia inversamente con el riesgo de CECC, independiente de la localización anatómica, e independiente de la condición de VPH.
Anteriormente, se informó de que esta misma variación genética en
TMC8
se asoció positivamente con la infección por VPH de tipo cutáneo [2]. A primera vista, estos resultados sorprendentemente diferentes entre los tipos de VPH son sorprendentes. Sin embargo, si tenemos en cuenta las diferencias estructurales en los genomas de VPH alfa y beta, emerge un modelo basado en la proteína E5 viral. Una diferencia importante entre los HPV cutáneos (beta) y los tipos de alto riesgo (alfa) es la presencia de la proteína E5. En VPH de alto riesgo, la proteína E5 se une directamente a la siempre /ZnT-1 complejo [15]. Como explica Larzarczyk, la siempre /ZnT-1 complejo es un punto de restricción para la infección por HPV por lo que es necesario alteración de este complejo (y su posterior desregulación de zinc) para que se produzca la infección [1]. Es plausible que el
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polimorfismo altera el potencial de unión de la proteína VPH E5 a la /compleja jamás ZnT-1, y esto disminuye la probabilidad de una infección productiva VPH. En contraste, los virus del papiloma humano tipo cutáneas no se basan en E5 para la infección productiva (como el genoma HPV cutáneo está desprovisto de E5). Gaud et al han demostrado que el
TMC8
polimorfismo altera la capacidad de EVER2 para interactuar con TRADD, alterando así el potencial de la apoptosis [16]. Nuestra hipótesis es que la variación genética común en
TMC8
influencias VPH susceptibilidad por dos mecanismos diferentes, dependiendo de la presencia o ausencia de la proteína E5.
in vitro
experimentos serán necesarios para responder definitivamente a estas preguntas
.
Mientras que la expresión EVER2 en los queratinocitos ha recibido una atención considerable, dado su papel en el síndrome hereditario Epidermodisplasia Verruciforme, el trabajo reciente demuestra que la expresión EVER2 en los linfocitos T supera la que se encuentra en los queratinocitos. En las células T este alta expresión de EVER2 es rápidamente reducido regulado a la estimulación de TCR, lo que lleva a un aumento en los niveles de Zn intracelulares. Nuestra hipótesis es que el
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polimorfismo modula la biología, lo que afecta las funciones de vigilancia de células T y el riesgo de cáncer. estudios epidemiológicos adicionales de cánceres mediados por no virales ayudarán a aclarar si los
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es un factor de susceptibilidad al cáncer generalizado.
Existen varias limitaciones a los datos de este estudio. El criterio de valoración serológica utilizado es muy específico para una infección de VPH de alto riesgo. Sin embargo, hay que señalar que la serología como criterio de valoración ha sensibilidad limitada, ya que no todas las personas montan una respuesta serológica a la infección por VPH. En el contexto de nuestra hipótesis sobre
TMC8
genotipo y la susceptibilidad a la infección, esta limitación potencial de la sensibilidad podría sesgar los resultados a la nula. Otra limitación de estos datos es que la respuesta serológica evaluamos no es necesariamente un reflejo de una infección en el sitio del tumor, pero en cambio podría reflejar una infección de alto riesgo en un sitio que no sea el tumor. Sin embargo, la baja seroprevalencia de VPH de alto riesgo entre los individuos sin la enfermedad (Tabla 1) indica esto probablemente no es un gran problema de los errores de clasificación. Por último, debido a esta baja seroprevalencia de los tipos de VPH de alto riesgo en nuestra población de control no podemos probar si
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genotipo se asocia con la infección en individuos no enfermos, y esto será importante para abordar en el trabajo futuro.
de interés, un estudio previo de cáncer de cuello uterino por Wang et al, utilizando un enfoque GWAS, identificado una rara SNP en el
TMC6 /8
región asociada con la persistencia del virus HPV16 (rs9893818, a frecuencia de los alelos 2,5%) [5], lo que indica que la variación genética más allá del SNP común que se presenta aquí puede ser importante para la comprensión de la infección por VPH. Un estudio reciente realizado por Castro et al [6], informó de dos SNPs comunes adicionales en el
TMC6 /TMC8
genes estaban asociados con el cáncer cervical, sin embargo, este estudio carecía de medidas sobre el VPH (aunque se le implicaba entre los casos) . Es evidente que una evaluación completa de la medida, el carácter y el fenotipo de la variación en el
TMC6
/
TMC8
región del gen servirá para delinear con más detalle nuestra comprensión de la susceptibilidad genética a la infección por VPH. Por último, teniendo en cuenta nuestras asociaciones muy fuertes entre los
TMC8
genotipo y CECC en los pacientes sin evidencia de infección por VPH será importante para establecer si el gen
TMC8
es un factor de susceptibilidad al cáncer generalizado.