Extracto
El irinotecan, un análogo de la camptotecina, se utiliza con frecuencia como un agente único o en combinación con otros medicamentos contra el cáncer para el tratamiento del cáncer colorrectal. Sin embargo, la resistencia a los medicamentos de los tumores es un obstáculo importante para un tratamiento exitoso. En este estudio, hemos establecido que las células adquieren resistencia crónica a irinotecán. Estamos perfiladas su expresión diferencial de genes utilizando microarrays. Después de la ontología de genes (GO) y KEGG vía de análisis de los datos de microarrays, se investigó específicamente si Sestrin3 podría disminuir la resistencia irinotecán. Nuestros resultados revelaron que Sestrin3 aumentó el efecto anticancerígeno de irinotecán
in vitro en células LoVo
que habían adquirido resistencia a irinotecán. células LoVo irinotecán mostraron resistentes a las especies reactivas de oxígeno menor producción (ROS) que sus células parentales irinotecán-sensibles. la producción de ROS se incrementó en Sestrin3 caída en células LoVo irinotecán-resistente. Nuestros resultados indican que Sestrin3 podría ser una buena diana para desarrollar terapias que pueden ayudar a superar la resistencia al irinotecan
Visto: Identificación de Sestrin3 Choi SH, Hong HK, Cho YB, WY Lee, Yoo HY (2015). Interviene en la
in vitro
resistencia de las células del cáncer colorrectal al irinotecán. PLoS ONE 10 (5): e0126830. doi: 10.1371 /journal.pone.0126830
Editor Académico: Javier S. Castresana, Universidad de Navarra, ESPAÑA
Recibido: 4 de noviembre de 2014; Aceptado: 8 Abril 2015; Publicado: 14 de mayo de 2015
Derechos de Autor © 2015 Choi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos de microarrays archivos están disponibles en la base de datos GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) a través del número de acceso GSE59501
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la tecnología de Corea Salud R & amp; D Proyecto a través del Instituto para el Desarrollo de la Industria de la Salud de Corea (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud & amp; El bienestar, la República de Corea (HI14C3418), la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF-2013R1A1A2060410) y la concesión de Samsung Medical Center. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La incidencia del cáncer colorrectal es más de un millón por año en el mundo, con una tasa de mortalidad de hasta un 33% en los países desarrollados [1]. El cáncer colorrectal es el quinto cáncer más común. La quimioterapia ha sido reconocido como eficaz en el tratamiento de cáncer colorrectal metastatizado. Típicamente, fluorouracilo (5-FU) se ha utilizado como una sola terapia. Sin embargo, en las últimas dos décadas, la práctica clínica ha estado utilizando fármacos citotóxicos tales como fluoropirimidinas, irinotecán y oxaliplatino. regímenes de quimioterapia de combinación estándar son FOLFIRI (ácido folínico, fluorouracilo e irinotecán), CAPIRI (capecitabina e irinotecán), FOLFOX (ácido folínico, fluorouracilo y oxaliplatino), o CAPOX (capecitabina y oxaliplatino). La sustitución de irinotecán con oxaliplatino ha contribuido a mejorar la tasa de supervivencia [2, 3]. Irinotecan (CPT-11), un derivado de camptotecina natural, es un fármaco terapéutico importante para los pacientes con metástasis de cáncer colorrectal (CCR) [4]. Irinotecan se convierte químicamente en su forma activa, 7-etil-10-hidroxicamptotecina (SN-38), que inhibe la ADN topoisomerasa. El estancamiento de la topoisomerasa en el tenedor de replicación de SN-38 induce una ruptura permanente de ADN de doble cadena, que produce una respuesta al daño del ADN (DDR). daño en el ADN se detecta principalmente por las quinasas ATR y ATM, el aumento de la actividad de los cuales conduce a la activación del puesto de control quinasas Chk1 /Chk2 y la posterior fosforilación de p53. p53 fosforilada es más estable, que puede activar la apoptosis o regular la detención del ciclo celular. p53 también juega un papel en la respuesta antioxidante, que fue descubierto a través de la identificación de un nuevo sestrina (
SESN
) familia de genes, que está implicado en las especies reactivas de oxígeno (ROS) la regulación [5]. Sobre la base de análisis de la estructura primaria y secundaria mediante el 3DPSSM programas de PSI-BLAST y,
SESN
familia se informa lo que codifican proteínas antioxidantes [6, 7]. sestrina proteínas tienen un alto grado de homología con el
Mycobacterium tuberculosis
proteína AHPD, intercambio de similitudes en sus dominios N-terminal [5]. Ellos son responsables de catalizar la reducción de peroxirredoxinas (Prdx) que metabolizan peróxidos [8]. La proteína AHPD, un componente de la reductasa de alquil-hidroperóxido de participar en la defensa contra ROS, es responsable de la regeneración de AhpC, un miembro de una familia conservada de peroxidasas-tiol específica (prxs) [9]. El
Sestrin1
y
Sestrin2
genes están regulados transcripcionalmente bajo el control de p53, mientras que
Sestrin3
está regulada por el eje de AKT /FOXO, a través de la FOXO1 gen /FOXO3a mediada expresión [5, 10].
Sestrin3
también está implicado en la desintoxicación ROS, así como en el retraso de la senescencia celular a través de FOXO [11]. De los tres miembros de la familia sestrina, el tercer miembro,
Sestrin3
, se ha reportado en la literatura, en menor medida que los otros dos.
A pesar irinotecan muestra una potente actividad contra un amplio gama de tumores, incluyendo tumores colorrectales, resistencia a los medicamentos sigue siendo un obstáculo importante para la quimioterapia eficaz. Por lo tanto, se necesitan nuevos objetivos para superar la resistencia a fármacos para el tratamiento del cáncer con éxito. Se han propuesto varias hipótesis acerca de los mecanismos implicados en la resistencia a la CPT, incluyendo reducción de la acumulación celular de CPT debido a flujo de salida activa de casete de unión a ATP (ABC) transportadores, sistemas enzimáticos correspondientes a la conversión metabólica, alteración en la estructura o la localización de la topoisomerasa I , y las alteraciones en la respuesta celular a-TOPI-DNA CPT formación del complejo ternario [7]. Aunque varios enfoques experimentales se han intentado clínicamente para superar los mecanismos individuales de resistencia [7], un éxito notable aún no se ha logrado.
En este estudio, hemos establecido una línea celular que adquirió resistencia crónica a irinotecán. Nuestro objetivo fue comparar el perfil transcripcional en la línea celular de cáncer colorrectal irinotecán resistente a la de las células parentales irinotecán-sensibles, para buscar nuevos marcadores para aumentar la sensibilidad al irinotecán. También se investigó si Sestrin3 podría potenciar el efecto anticancerígeno de irinotecán
in vitro
, en la línea celular de cáncer colorrectal irinotecán resistente.
Materiales y Métodos
líneas y de cultivos celulares in condiciones
la líneas celulares de cáncer colorrectal humano HCT116, HCT15, HCT29, KM12SM, SW620, DLD1, Colo205, y LoVo se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Las líneas celulares se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, piruvato de sodio 1 mM, y 2,05 mM de L-glutamina en 37 ° C. Las líneas celulares fueron probados periódicamente para la identidad y la infección por micoplasma, usando el kit de detección de MycoAlert micoplasma (Lonza).
análisis de transferencia de Western
Las células se lisaron en tampón RIPA (Tris 50 mM, NaCl 150 mM , 1% NP-40, 0,5% desoxicolato de sodio, y 0,1% de dodecil sulfato de sodio) suplementado con inhibidores de proteasa y inhibidores de la fosfatasa. Los anticuerpos utilizados para inmunotransferencia fueron conejo monoclonal anti-ATM (D2E2, Señalización celular), policlonal de conejo anti-fosfo-Chk1 (Ser317, la señalización celular), policlonal de conejo anti-ATR, TopBP1, CtIP (laboratorios Bethyl), y el anticuerpo monoclonal de ratón NBS1 (1D7, Novus Productos Biológicos). Los anticuerpos policlonales contra Sestrin3 se adquirieron de Abcam. Ratón monoclonal anti-Chk1 (G-4) y anti α-tubulina se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology. Los anticuerpos contra AMPKα (23A3), fosfo-AMPKα (Thr72, 40H9), p70S6K y fósforo-p70S6K (Thr389, 108D2), mTOR (7C10), y fosfo-mTOR (Ser2448) fueron adquiridos de señalización celular.
Desarrollo de la línea celular resistente a irinotecán
para crear una línea celular de cáncer colorrectal estable crónica resistente a irinotecán, las células LoVo fueron expuestos a irinotecán a una concentración inicial de 0,1 mol /l en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS. Cuando las células cultivadas alcanzaron una confluencia del 80%, 20% de las células se replated para el siguiente paso. Las células se pasaron 3 veces a la misma concentración de irinotecan para asegurar su adaptación y después se trataron con 2 veces más alta concentración de irinotecan. La concentración de irinotecan se aumentó de forma secuencial hasta que se alcanzó una concentración final de 8 mol /l. Irinotecan se adquirió de Sigma-Aldrich.
viabilidad celular y ensayos de citotoxicidad
líneas celulares de cáncer colorrectal se sembraron en placas de 96 pocillos de cultivo de células en RPMI 1640, suplementado con 10% FBS. Después de 24 h de incubación, el medio se reemplazó con medio fresco que contiene irinotecan. Varias concentraciones de irinotecan se utilizaron para tratar las células durante 72 h. La viabilidad de las células o la citotoxicidad se evaluó usando el ensayo de Cell Counting Kit-8 (CCK-8), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadieron 10 l de solución de CCK-8 a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 2 horas a 37 ° C. Los valores de absorbancia se midieron a 450 nm.
supervivencia clonogénico ensayo
Las células fueron cultivadas en un medio que contiene irinotecan en concentraciones de 0,05, 0,1, 0,4, 0,8, 1,5, y 3 mM, respectivamente . Después de 24 h, se separaron las células y se sembraron en placas de cultivo de 60 mm. Después de 14 días, las colonias restantes se lavaron con PBS, se tiñeron con violeta de cristal, y luego contados de acuerdo con tamaños de colonia definidos. Todos los experimentos fueron independientemente repetidamente al menos 3 veces. La significación estadística de la diferencia en el número de colonias se determinó mediante la prueba t de Student de dos colas.
análisis del ciclo celular
Para los análisis del ciclo celular, citometría de flujo se llevó a cabo utilizando células LoVo tratados con o sin irinotecan. Brevemente, las células fueron separadas con tripsina, se lavaron con PBS, y se resuspendieron en 0,5 ml de PBS. Después de la fijación con 4,5 ml de etanol al 70%, las células se incubaron en hielo durante 2 h. Se lavaron las células fijadas, se resuspendieron en 1 ml de una solución de yoduro de propidio tinción que contiene 0,1% (v /v) de Triton X-100, 0,2 mg /ml de RNasa A, y 20 g /ml de PI, se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min y, a continuación, se mantuvo en hielo hasta que se realizó la citometría de flujo análisis.
RNA de interferencia (RNAi)
Para transitoria silenciamiento de ARN, las células fueron transfectadas con siRNA de metas de Sestrin3 (siSESN3) o con no director siRNA (siCONTROL), utilizando el reactivo de transfección RNAiMAX lipofectamina (Life Technologies).
Medición de ROS celular
se evaluó la generación de ROS intracelular usando el reactivo CellRox estrés oxidativo verde ( Invitrogen). Brevemente, las células fueron transfectadas con siRNAs durante 48 h y posteriormente se incubaron con 5 mM del reactivo CellRox a 37 ° C durante 30 min. Después de lavar dos veces con PBS, la intensidad de fluorescencia se midió utilizando microscopía de fluorescencia.
Aislamiento de RNA y de expresión de genes
Perfilado En el presente estudio, se realizó un análisis de la expresión génica global utilizando Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0 ST arrays de oligonucleótidos utilizando células LoVo y células LoVo-R8 resistentes irinotecán cultivadas con o sin irinotecan (8 M). Las muestras se prepararon de acuerdo con las instrucciones y recomendaciones proporcionadas por el fabricante. El ARN total se aisló usando columnas RNeasy Mini Kit (Qiagen). La calidad del ARN se evaluó mediante el Bioanalyzer Agilent 2100 con un RNA 6000 Nano Chip (Agilent Technologies). La cantidad de ARN se determinó utilizando el ND-1000 Espectrofotómetro (NanoDrop Technologies, Inc.). Las muestras de ARN (300 ng cada uno) fueron utilizados como entrada para el procedimiento de Affymetrix como se describe en el protocolo. Brevemente, 300 ng de RNA total de cada muestra se convirtió a cDNA de doble cadena, usando un hexámero aleatorio que incorpora un promotor T7. ARN amplificado se genera a partir del molde de ADNc de doble cadena, aunque
in vitro
transcripción y purificado con el módulo de muestra de la limpieza de Affymetrix. ADNc se regeneraron mediante transcripción inversa usando cebadores aleatorios y una mezcla de dNTP que contiene dUTP. cDNAs fueron entonces fragmentados por la UDG y APE 1 endonucleasas de restricción y finales etiquetados por una reacción de transferasa terminal que incorpora un didesoxinucleótido biotinilado. ADNc fragmentados y marcados en el extremo se hibridaron utilizando los GeneChip Human Gene 1.0 arrays ST durante 16 horas a 45 ° C y 60 rpm, como se describe en el gen de la viruta Whole Transcripción (WT) Sense Target Labeling Ensayo Manual (Affymetrix). Después de la hibridación, los chips se tiñeron y se lavan en la estación de fluidos Genechip 450 (Affymetrix), y escaneadas usando un escáner GeneChip 7G matriz 3000 (Affymetrix). Para el análisis estadístico, una llamada de detección (presente /ausente) se generó por la suite de microarrays de Affymetrix 5 (MAS5) algoritmo. Los archivos en bruto escaneados se importaron en el entorno de programación estadístico R (Version2.3), para su posterior análisis con las herramientas disponibles en el proyecto Bioconductor. Los datos de expresión se normalizaron y log2-transformado, utilizando el método robusto promedio multichip (RMA) implementado en el paquete RMA Bioconductor (M2, M3). Para reducir el ruido en el análisis de la importancia, la sonda conjuntos que no mostraron una tasa de detección de llamada de al menos 50% de las muestras se separaron por filtración. Se seleccionaron los genes altamente expresados que mostraron un cambio de 2 veces en la expresión. Los resultados fueron clasificados utilizando algoritmos de agrupamiento jerárquico implementadas en el software de TMEV 4.0. matriz de datos se depositaron en el Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE59501.
El análisis estadístico
in vitro
datos experimentales fueron obtenidos a partir de experimentos repetidos tres veces por triplicado. Los valores medios se calculan y se determinó la significación, mediante la prueba de dos colas de Student.
P & lt
valores; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados
Establecimiento de líneas celulares resistentes a irinotecán
Antes de generar una línea celular de cáncer de colon con resistencia adquirida a irinotecán, se probó la citotoxicidad de irinotecan en varias líneas celulares de cáncer colorrectal para identificar el más sensible. De las ocho líneas celulares, la línea celular LoVo fue el más sensible a irinotecán (figura 1A). La citotoxicidad de irinotecan a las células parentales y resistentes LoVo (LoVo-R) se determinó usando el ensayo de CCK-8. Las células LoVo-R eran más resistentes a irinotecan que las células LoVo parentales. El IC
50 valores de LoVo-R y los padres eran LoVo 10 M y 1,5 M, respectivamente. Hemos establecido varias líneas celulares resistentes utilizando diferentes concentraciones finales de irinotecán. Sin embargo, los mismos niveles de CI
50 fueron encontrados a través de las líneas celulares resistentes con diferentes concentraciones finales de irinotecán (Figura 1B). La resistencia de la línea celular LoVo-R8 se confirmó usando un ensayo clonogénico (Fig 1C). La línea celular LoVo-R8 adaptado al irinotecan a una concentración final de 8 mM. Es bien sabido que irinotecán inhibe específicamente la replicación del ADN atrapando la topoisomerasa I en las hebras de ADN, induciendo una detención del ciclo celular en el G
2 de fase. Para investigar el efecto de irinotecan en la progresión del ciclo celular de las células LoVo-R8, que además analiza el ciclo celular de esta línea celular (Fig 1D). Las células parentales LoVo que fueron tratados con 5 M de irinotecan mostraron grave G detención
2 /M. Después de 24 h de tratamiento irinotecan (5 M), la detención del ciclo celular en el G
2 M-fase /se observó sólo en las células LoVo parentales, pero las células LoVo-8R tratados con o sin irinotecan no mostró diferencias en su progresión del ciclo celular.
(a) la sensibilidad de líneas celulares de cáncer de colon a ocho irinotecan se midió usando el ensayo de CCK-8. Para el ensayo de CCK-8, las células se expusieron a irinotecan a concentraciones dadas durante 72 h antes de la medición. La viabilidad celular se presenta como el porcentaje relativo a las células no tratadas. (B) La resistencia de las células LoVo establecidos a irinotecán se midió usando el ensayo de CCK-8 y (C) el ensayo de supervivencia clonogénico. Las colonias que sobrevivieron a la ensayo de supervivencia clonogénico se midieron después de una incubación adicional durante un período adicional de 14 días. (D) la progresión del ciclo celular de las LoVo-R8. *
p ≤ 0,05
.
Análisis
Gene gama de expresión de células LoVo-R8 irinotecán resistente
Después de establecer las líneas celulares LoVo-8R irinotecán resistente, investigamos sus perfiles de expresión génica mediante microarrays de ADN. El uso de un criterio de filtro de al menos un cambio de 2 veces con
p Hotel & lt; 0,05, el número de genes con cambios en la expresión en las células LoVo-8R, en comparación con sus células LoVo parentales, se determinó. Un total de 599 y 566 genes fueron reguladas y las reguladas, respectivamente, que representan el 3,5% del total de genes sondeadas (figura 2A y 2B). Una anotación funcional de estos genes se llevó a cabo utilizando un análisis basado en la ontología de genes de propiedades biológicas. Los genes se clasificaron en 15 grupos funcionales (Fig 2A y 2B). La mayoría de estos genes estaban asociados con la respuesta inflamatoria, la angiogénesis, la proliferación celular, o la migración celular.
Se seleccionaron
Genes utilizando un criterio de filtro de al menos un cambio de 2 veces en comparación con los controles con
p
& lt; 0.05. Los genes con expresión alterada en la línea celular LoVo irinotecán resistentes, en comparación con la línea original de células LoVo, se clasifican en 15 grupos funcionales sobre la base de la ontología de genes. Los números de genes se muestran en los gráficos (A) y el número de genes sondeadas en esta serie de análisis y valores porcentuales de los genes cambiado de manera significativa, se presentan en una tabla (B). (C) análisis de agrupamiento jerárquico de los microarrays de expresión de células LoVo irinotecán resistente. Una representación basada en el grupo de genes alterados en las células resistentes a irinotecán con intensidad, normalizados a la línea celular LoVo parental. Los genes que se relación con las células LoVo parentales hasta reguladas se muestran en rojo, y las que se redujeron reguladas se muestran en verde. Los niveles de expresión de estos genes se han alterado ≥1.5 veces o ≤0.6 veces en líneas celulares LoVo irinotecan-resistentes, en comparación con la línea celular original LoVo. los símbolos de genes se muestran en la fila de la derecha.
Un mapa de calor agrupación jerárquica (Figura 2C) representa los patrones de cambio en los niveles de expresión de genes observados en las células LoVo irinotecán resistente. se muestra un total de 24 genes de participar en la vía de irinotecan o para ser genes relacionados con la detención del ciclo celular, basados en el análisis de las propiedades biológicas llevadas a cabo usando la ontología de genes. Se encontró un total de 53 vías, basado en el análisis de la vía KEGG. Todo el mapa de calor agrupación se presenta como datos complementarios S1 en la Fig. Se analizaron también las funciones de los genes conocidos implicados en la ruta irinotecan de células de cáncer colorrectal. CYP3A4 y CYP3A5 están implicadas en la formación de carboniloxicamptotecina, un metabolito inactivo de irinotecan. Los niveles de ARN de dos proteínas que unen ATP casete de transmembrana (ABC), ABCG2 (conocida como proteína de resistencia al cáncer de mama) y ABCB1, fueron dramáticamente hasta reguladas en las células resistentes a irinotecán (Figura 2C y Tabla S1). Esto no es sorprendente, teniendo en cuenta el hecho de que el eflujo de irinotecán en las células tumorales se revela como una estrategia potencial para superar la resistencia a fármacos.
La expresión de los genes implicados en la ruta de daño en el ADN puesto de control
Para encontrar nuevos marcadores relacionados con la resistencia irinotecan, se determinó la expresión de varios genes implicados en la señalización de punto de control de daño del ADN. Las células LoVo irinotecán sensible mostró una mismos niveles en CtIP (proteína de interacción CtBP) y TopBP1 expresión (topoisomerasa (ADN) II proteína 1 de unión), de una manera dependiente de la dosis. En las células LoVo irinotecán resistente, la expresión CtIP era más o menos aumentó. Sin embargo, la expresión de TopBP1 no se cambió. CHK1 (chek1, kinasa de control 1) fue activado por 5 M de irinotecán en las células LoVo parentales. Sin embargo, CHK1 no se ha activado en las células LoVo-8R tratados con la misma concentración de irinotecan (Fig 3A). En consecuencia, sólo CHK1 fosforilada mostró un patrón de expresión diferencial en irinotecan sensibles a las células frente a resistente (S2 FIG). La activación de CHK1 después de la exposición a la radiación (IR) o la radiación ionizante UV era normal tanto en las células-irinotecán sensibles y resistentes a (Fig 3B). Sin embargo, el nivel de fosforilación de CHK1 en respuesta a IR y UV era mayor en las células LoVo irinotecan-sensibles. Estos resultados nos hizo investigar más a fondo los genes relacionados con la detención del ciclo celular, para encontrar nuevos marcadores de resistencia a irinotecán.
(A) La expresión de varios genes implicados en la respuesta al daño del ADN en las células resistentes a irinotecán. CHK1 se activó a 5 mM en células LoVo parentales, pero las células LoVo resistentes no muestran la activación de CHK1. (B) el daño del ADN tales como IR y UV induce la activación de las células LoVo CHK1 en y LoVo-8R. La fosforilación de CHK1 en respuesta a IR (10 Gy) y UV (50 J /m
2) era mayor en las células LoVo que la de las células LoVo-8R. El gráfico muestra el nivel de fosforilación de CHK1. Las diferencias se consideraron significativas a
p Hotel & lt; 0,05 por la prueba t. *, La comparación entre las células LoVo vs células LoVo-R8.
Sestrin3 caída aumentada su citotoxicidad celular irinotecán en células LoVo resistentes
Para encontrar marcadores de resistencia a irinotecán, se analizó la regulación arriba genes que se encuentran implicadas en la detención del ciclo celular, basado en los datos de microarrays. Sestrin3 fue dramáticamente hasta reguladas en las células LoVo-R8 (Tabla 1). Sestrin3 caída no afectó a la toxicidad de irinotecan a las células LoVo parentales. La cantidad relativa de nivel Sestrin3 ARNm se incrementó en las células LoVo-R8, y análisis de Western blot mostró el nivel de proteína Sestrin3 también se incrementó en las células LoVo-R8 (Fig 4A y 4B). Utilizando el análisis de qPCR, se confirmó Sestrin3 transcripción a ser reguladas mediante la transfección de siSESN3, pero la viabilidad de las células LoVo no se vio afectada por el tratamiento siSESN3 (Fig 4C). Sestrin3 caída disminuyó la resistencia de las células LoVo-R8 al irinotecan, reduciendo su IC
50 valor a 4 M (figura 4D). Sestrins, una familia de proteínas de estrés-inducible, comparten un alto grado de homología con la proteína AHPD bacteriana que es responsable de catalizar la reducción de peroxirredoxinas. Se midió la acumulación de ROS bajo niveles Sestrin3 reguladas en cada línea celular (Figura 4E). células LoVo-R8 mostraron una acumulación de ROS bajo que sus células LoVo parentales. Sestrin3 caída aumentó la producción de ROS en ambos tipos de células.
(A) La cantidad relativa de nivel Sestrin3 ARNm se incrementó en células LoVo-R8 por PCR en tiempo real. (B) De acuerdo con la transcripción Sestrin3 upregulated, Western blot mostró el nivel de proteína Sestrin3 también se incrementó en LoVo-R8. El tratamiento de Sestrin3 siRNA (siSESN3) nivel de proteína con eficacia las reguladas de un aumento en Sestrin3 LoVo-R8. (C) Sestrin3 transcripción fue hacia abajo regulada mediante la transfección de siSESN3 en el análisis qPCR (izquierda). células LoVo era susceptible al irinotecan con dependiente de la dosis, y la viabilidad de LoVo no se vio afectada incluso bajo tratamiento siSESN3 (derecha). Las células se trataron con siSESN3 durante 48 h. Los medios de cultivo se cambiaron con el medio que contiene la concentración indicada de irinotecan y se incubaron adicionalmente durante 72 h. La viabilidad celular se presenta como el porcentaje relativo a la de las células no tratadas. (D) Sestrin3 transcripción también fue regulada en LoVo-R8 mediante la transfección de siSESN3 en el análisis qPCR (izquierda). células LoVo-R8 era resistente al irinotecan, pero se transformó en ser susceptible de irinotecan por tratamiento siSESN3 (derecha). imágenes (E) de fluorescencia de ROS intracelulares marcada con el reactivo verde CellRox. Las células fueron transfectadas con ARNsi de control o siSESN3. El ROS se midió después de 48 h. (F) de transferencia de Western que muestra los niveles de proteína de AMPK, p-AMPK, mTOR, p-mTOR, p70S6K, y p-p70S6K en LoVo y LoVo-R8 con o sin irinotecan. (G) Gráfico que muestra los niveles de proteínas. Las diferencias se consideraron significativas a
p Hotel & lt; 0,05 por la prueba t. *, La comparación entre el grupo sin irinotecán vs grupo con 10 mM irinotecán en LoVo y LoVo-R8; #, La comparación entre LoVo vs LoVo-R8.
A continuación, se analizó la fosforilación de AMPK, mTOR, y p70S6K para investigar si Sestrin3 afecta la resistencia al irinotecan través de la vía AMPK /TORC1 ( La figura 4F y 4G). células LoVo-R8 mostraron mayores niveles de expresión de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) y de la fosforilación de AMPK que las células LoVo parentales. La fosforilación de mTOR y S6K (p70S6 quinasa), un sustrato mTORC1 se incrementó en las células LoVo-8R. Además, las células LoVo-8R mostraron una activación constitutiva de AMPK y mTOR con o sin irinotecan comparación con las células LoVo.
Discusión
Irinotecan se ha evaluado ampliamente como agente único, así como en regímenes de combinación con otros fármacos quimioterapéuticos. Después de la aprobación para el tratamiento del cáncer colorrectal metastásico, irinotecán se ha utilizado para tratar una serie de otros tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón, cáncer gástrico, tumores cerebrales y cáncer de mama. Sin embargo, la resistencia a fármacos de tumor a irinotecán ha limitado su eficacia en terapias clínicas. Hemos establecido una línea celular estable que es resistente a irinotecán. La línea celular más sensible fue seleccionada de ocho líneas de células colorrectales, basado en ensayos de citotoxicidad. Inducimos resistencia crónica mediante la exposición de las células a un aumento de la dosis de irinotecán. Para confirmar su adaptación, las células que adquirieron resistencia se cultivaron en un medio libre de drogas para tres pasajes. Después de cultivar en el medio libre de fármaco, las células LoVo-R8 que habían adquirido resistencia a irinotecan mantienen al mismo nivel que las células recién establecidas. Se analizaron los datos de microarrays para identificar los genes clave que juegan un papel importante en la resistencia al irinotecán. Se obtuvieron un total de 1165 genes expresados diferencialmente (DEGs). Un análisis de enriquecimiento de ontología de genes reveló que el nivel de Sestrin3 se incrementó dramáticamente. Sin embargo, los niveles de expresión de los otros dos miembros de la familia sestrina, Sestrin1 y Sestrin2, fueron ligeramente cambiados. Sestrins son una familia de proteínas altamente conservadas, de respuesta a estrés. Sestrin1 y Sestrin2 están transcripcionalmente regulados por p53. Sestrin3, regulado por el factor de transcripción forkhead, muestra actividad oxidorreductasa
in vitro
. Se ha informado de que SESN3 puede proteger las células contra el estrés oxidativo mediante la modulación de peroxiredoxin (Prx) regeneración [10]. Esperábamos que Sestrin1 y Sestrin2 expresión sería hasta regulado porque varios agentes de daño de ADN se sabe que afectan la progresión del ciclo celular a través de la activación de p53. A partir de nuestros datos de la matriz, S2 Tabla presenta los niveles de expresión de Sestrins, así como los genes relacionados con la ruta de p53. De los 24 genes identificados en este estudio como una persona implicada en la vía de irinotecán de cáncer colorrectal, los niveles de expresión de
CES1
y
CES2 gratis (implicada en la conversión del profármaco de irinotecán ) fueron disminuido en aproximadamente un 25%. De los 24 genes, que codifican las proteínas de unión a ATP de cassette (ABC) que participan en el eflujo, como
ABCB1
y
ABCG2
, eran los genes más altamente regulados hasta. Resistencia a irinotecan se ve afectada por los sistemas de reparación del ADN.
ERCC1
y
ERCC2
, que participan en la reparación por escisión de nucleótidos, mostraron cierto aumento en su expresión. Sin embargo, la expresión de
MLH1
y
MLH6
(que participan en el proceso de reparación de genes) cambió muy poco. De los 24 genes, los que participan en la ruta apoptótica no mostraron ninguna diferencia en la expresión entre las células-irinotecán sensibles y resistentes irinotecán. Teniendo en cuenta estas variaciones en la expresión génica, la resistencia adquirida a irinotecan en las células LoVo-R8 puede ser debido a la disminución de la acumulación celular de irinotecan, o a la conversión de irinotecán a un metabolito activo SN-38 porque se redujo hasta cierto punto.
tratamiento de irinotecan se asocia con la detención del ciclo celular en G2. Se investigó la categoría de la detención del ciclo celular en la ontología de genes, para encontrar los objetivos clave del ciclo celular mediada por la resistencia. Sestrin3 se demostró para modular Prx regeneración en las células cancerosas. El nivel de expresión de Sestrin3 se incrementó mediante la activación transcripcional por FoxO1. Mientras que la familia sestrina está implicado en el control redox [5, 8, 12], estudios recientes han demostrado el papel de Sestrins en la señalización mTORC1. mTORC1 es inhibida por miembros de la familia sestrina (SESN1 /2), a través de la activación de AMPK mediada de la TSC1 /2 complejo [12]. Sestrin3 ha informado de obstaculizar mTORC1, basado en el hallazgo de que FoxO1 /3a mediada por transcripcional regulación de Sestrin3 procede a activar AMPK /TSC1 /2, que finalmente inhibe la actividad mTORC1 [13]. Además, la activación mTORC1 conduce a la acumulación de ROS, lo que resulta en la activación de la señalización /FOXO JNK, y un bucle de retroalimentación positiva de sestrina expresión [5, 14]. Sin embargo, el papel de Sestrin3 en la oncogénesis y la resistencia a fármacos contra el cáncer sigue siendo ambigua. El examen de la AMPK vía /mTOR en las células LoVo y LoVo-R8 mostró que la señal de la AMPK se activa en las células tratadas irinotecán o células resistentes a irinotecán (figura 4F). En general, se espera que mTOR señalización bajo la inhibición por AMPK activa induciría la autofagia [15]. En nuestro estudio, sin embargo, la activación de la AMPK no inhibe mTOR. Aunque la señalización de mTOR está estrechamente asociada con la señal de la AMPK y es, de hecho, aguas abajo de la AMPK, TSC1 /2 y Rheb son moléculas de cubo de mTOR vía de señalización de la integración de diversos insumos [16, 17]. Nuestro estudio revela una positiva en lugar de una relación negativa entre la AMPK reguladora y mTOR.
Nuestros resultados e interpretaciones se han centrado en el efecto antioxidante de Sestrin3 sobre la resistencia a fármacos contra el cáncer. En general, las células cancerosas se someten a la glucólisis aeróbica para satisfacer la alta demanda de nutrientes impuesto al ambiente celular y extracelular por su rápida proliferación. La demanda de aumento de la producción de energía traer las células cancerosas a cara grave estrés oxidativo, que activa diversos mecanismos de defensa y de reparación contra las drogas genotóxicos, aunque ROS puede funcionar también como segundos mensajeros específicos en cascadas implicados en la proliferación y la diferenciación celular. En las células cancerosas, la acumulación de ROS podría estimular la proliferación celular, la mutagénesis, y la inestabilidad genómica [18, 19]. En consecuencia, se detecta una acumulación de grandes cantidades de ROS en células transformadas con el
RAS
oncogén [18, 20, 21].