Extracto
glucólisis aeróbica en las células cancerosas está regulado por múltiples efectores que incluyen Akt y piruvato quinasa M2 (PKM2). La mucina 1 (MUC1) es una glicoproteína heterodimérica que se sobreexpresa de forma aberrante por mama humano y otros carcinomas. Aquí mostramos que la transformación de fibroblastos de rata por el oncogénico subunidad MUC1-C se asocia con aumentos de Akt mediada en la captación de glucosa y la producción de lactato, de conformidad con la estimulación de la glicólisis. Los resultados también demuestran que el dominio citoplásmico MUC1-C se une directamente a PKM2 en el B- y C-dominios. Se encontró interacción entre la MUC1-C dominio citoplásmico Cys-3 y la PKM2 C-dominio Cys-474 para estimular la actividad PKM2. A la inversa, de crecimiento epidérmico receptor del factor (EGFR) mediada por la fosforilación del dominio citoplásmico MUC1-C en Tyr-46 conferidas unión a la actividad PKM2 inhibido PKM2 Lys-433 y. En las células de cáncer de mama humano, silenciando MUC1-C se asoció con la disminución de la captación de glucosa y la producción de lactato, lo que confirma la participación de MUC1-C en la regulación de la glicolisis. Además, la fosforilación mediada por EGFR de MUC1-C en células de cáncer de mama se asoció con una disminución en la actividad PKM2. Estos hallazgos indican que la subunidad MUC1-C regula la glucólisis y que esta respuesta se confiere en parte por PKM2. De este modo, la sobreexpresión de MUC1-C oncogénica en diversos carcinomas humanos podría ser de importancia para el efecto Warburg de la glucólisis aeróbica
Visto:. Kosugi M, Ahmad I, M Alam, Uchida Y, Kufe D (2011) MUC1-C oncoproteína Regula la glucólisis y la piruvato quinasa m2 Actividad en las células cancerosas. PLoS ONE 6 (11): e28234. doi: 10.1371 /journal.pone.0028234
Editor: Rebecca Berdeaux, Universidad de Texas Health Science Center en Houston, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de julio de 2011; Aceptado: 4 de noviembre de 2011; Publicado: 28 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Kosugi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por subvenciones CA97098, CA42802 y CA100707 concedidos por el Instituto Nacional del cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: DK mantiene la equidad en género Oncología y es consultor de la empresa. Género Oncología ejerce en las solicitudes de patentes para los péptidos penetran en las células, tales como GO-203, que la función de bloque de MUC1-C y la empresa tiene un péptido relacionado bajo desarrollo clínico. No hay productos comercializados que declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Las células cancerosas se distinguen de sus homólogos normales por diferencias metabólicas que incluyen la utilización de la glucosa aumentaron por la glucólisis aeróbica. Esta característica de las células malignas, conocido como el efecto Warburg, asocia una alta tasa de consumo de glucosa con la producción de lactato mejorada en presencia de oxígeno [1]. glucólisis aeróbica en las células del cáncer se ha relacionado con un aumento de la expresión de los genes glicolítico [2], [3]. Piruvato quinasa (PK) es uno de los productos de los genes upregulated glucolíticas que cataliza la producción de piruvato y ATP a partir de fosfoenolpiruvato (PEP) y ADP. Hay cuatro isoenzimas PK, M1, M2, L y R. El M1 isoforma se expresa en la mayoría de las células adultas. La isoforma M2 (PKM2), una variante de empalme de M1, se encuentra en las células embrionarias, ciertas células proliferantes normales y células de cáncer [4]. ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas se unen a PKM1 ARNm e inhiben su empalme [5]. Convertir expresión PKM2 a PKM1 en células de cáncer invierte el efecto Warburg y se asocia con la pérdida de tumorigenicidad, estableciendo la importancia de PKM2 para la glucólisis aeróbica y la proliferación de las células malignas [6]. La región distinta de PKM2, en comparación con PKM1, funciona en la activación alostérica de la enzima por la fructosa-1,6-bifosfato (FBP) [7] y su inactivación por las proteínas de fosfotirosina que contiene [8], [9]. En estas circunstancias, la regulación de la actividad PKM2 dicta el metabolismo de la glucosa en piruvato, que se convierte por la lactato deshidrogenasa (LDH) en lactato o es utilizada por el ácido tricarboxílico (TCA) del ciclo mitocondrial [10]. Por tanto, estos hallazgos han apoyado la necesidad de comprender mejor las señales que regulan la glucólisis aeróbica y la actividad PKM2 en las células malignas.
La mucina 1 proteína (MUC1) se sobreexpresa en la mayoría de los carcinomas humanos y ciertas malignidades hematológicas, por lo que es una de las alteraciones más comunes en los cánceres humanos [11]. MUC1 se expresa como dos subunidades que forman un heterodímero en la membrana celular. La subunidad grande MUC1 N-terminal (MUC1-N) se coloca extracelularmente y contiene las repeticiones en tándem glicosiladas que son característicos de la familia de mucina. La subunidad MUC1 C-terminal (MUC1-C) se extiende por la membrana celular y contiene un dominio extracelular 58 amino ácido y un ácido 72 amino dominio cytoplamic [11]. El dominio extracelular MUC1-C interactúa con la galectina-3 y por lo tanto forma complejos en la superficie celular con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) [12]. La activación de EGFR es a su vez asociado con la fosforilación de la MUC1-C dominio citoplasmático [11]. De manera significativa, la sobreexpresión de la subunidad de MUC1-C, y, específicamente, el dominio citoplásmico, es suficiente para inducir el crecimiento y la tumorigenicidad [13] de anclaje independiente, [14]. Con la sobreexpresión de MUC1 en células de cáncer, la subunidad MUC1-C se acumula en el citoplasma y se dirige al núcleo, donde contribuye a la regulación de la expresión de genes [11]. En este sentido, la transformación inducida por MUC1-C está asociada con la activación de genes involucrados en la proliferación y la tumorigénesis [15], [16]. MUC1-C también induce una firma asociada con el metabolismo de los lípidos y la regulación positiva de genes que regulan la síntesis de ácidos grasos y colesterol [17]. Otros estudios han demostrado que la MUC1-C activa el PI3K- & gt; Akt [18], [19], que a su vez estimula la actividad de las enzimas glucolíticas, hexoquinasa y phosphofructose quinasa. Hay, sin embargo, no hay relación entre MUC1-C y la vía glucolítica conocido.
Transformación
Los presentes estudios demuestran que la MUC1-C está implicada en la regulación de la captación de glucosa y producción de lactato en MUC1-C inducida por el de fibroblastos de rata y en células de cáncer de mama humano. Los resultados también demuestran que el dominio citoplásmico MUC1-C interactúa directamente con PKM2 y regula la actividad PKM2. El dominio citoplásmico MUC1-C contiene un residuo Cys que se une al PKM2 C-dominio Cys-474 y estimula la actividad PKM2. Por el contrario, la MUC1-C dominio citoplásmico EGFR-fosforilados interactúa con el PKM2 C-dominio en Lys-433 e inhibe PKM2. Estos hallazgos indican que la sobreexpresión de MUC1-C en las células cancerosas contribuye a la regulación de la glucólisis aeróbica.
Resultados
transformación inducida por MUC1-C se asocia con la inducción de la glucólisis aeróbica
La subunidad MUC1-C consiste en un dominio amino ácido 58 (aa) extracelular, un dominio transmembrana 28 aa y un 72 aa dominio citoplásmico (Fig. 1A). La expresión de la MUC1-C dominio citoplásmico (MUC1-CD) en 3Y1 fibroblastos se asocia con la inducción de la formación de colonias en agar blando y formación de tumores en ratones desnudos [13], [14]. En los presentes estudios, se encontró que la transformación de las células 3Y1 MUC1-CD-inducida está asociada con un aumento en la captación de glucosa (Fig. 1B) y la producción de lactato (Fig. 1C), consistente con la estimulación de la glicólisis. Para evaluar, al menos en parte, la base de esta respuesta, se realizaron estudios para determinar los efectos sobre PKM2. En particular, hubo un aumento significativo de la actividad PKM2 en la MUC1-CD transformado 3Y1 fibroblastos (Fig. 1D). células 3Y1 /vector expresar PKM2, pero no PKM1, y la transformación inducida por MUC1-CD no tuvo ningún efecto aparente sobre los niveles de PKM2 (Fig. 1E). Otros estudios han demostrado que la actividad PKM2 es inhibida por fosforilación en Tyr-105 en ciertas células de cáncer [9]. transformación inducida por MUC1-CD no se asoció con un cambio en la fosforilación de Tyr-105 (Fig. 1F). Además, no había ninguna redistribución celular aparente de PKM2 como se determina por microscopía confocal (Fig. S1). Estudios previos han demostrado que la activación de Akt, determinado por la fosforilación en Ser-473 se incrementa en las células 3Y1 /MUC1-CD en comparación con la encontrada en células 3Y1 /vector [18]. Para evaluar si el aumento de p-Akt es responsable de la activación de PKM2, silenciamos Akt en el 3Y1 /vectores y células 3Y1 /MUC1-CD (Fig. 1G) y la absorción de glucosa medida, la producción de lactato y la actividad PKM2. Los resultados demuestran que el silenciamiento Akt disminuye la absorción de glucosa tanto en 3Y1 /vector y 3Y1 células /MUC1-CD (Fig. 1H, izquierda). Por otra parte, el silenciamiento de Akt en el 3Y1 /vectores y células 3Y1 /MUC1-CD se asoció con una disminución parcial de la producción de lactato (Fig. 1H, derecha). Por el contrario, silenciando Akt tenía poco o ningún efecto sobre la actividad PKM2 en las células 3Y1 /MUC1-CD (Fig. 1I), lo que indica que la inducción mediada por MUC1-CD de PKM2 no depende de la activación de Akt.
A. Estructura de la subunidad MUC1-C con el dominio extracelular (ED), dominio transmembrana (TM) y la secuencia de aminoácidos del dominio citoplásmico (MUC1-CD). El motivo de CQC y el sitio de fosforilación de EGFR están resaltados. Se analizaron las células B y C. 3Y1 /vector y 3Y1 /MUC1-CD para la captación de glucosa (B) y la producción de lactato (C). Los resultados (media ± DE de cinco experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado) se expresan como /10
6 células nmol. D. Los lisados de rata 3Y1 /vectores y células 3Y1 /MUC1-CD se analizaron para la actividad PKM2. Los resultados (media ± SD de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado) se expresan como actividad PKM2 relativa en comparación con la obtenida en células 3Y1 /vector (asignado un valor de 1). Se utilizó la prueba t de estudiante para determinar los valores de p. E y F. Los lisados de 3Y1 /vectores y células 3Y1 /MUC1-CD se sometieron a inmunotransferencia con los anticuerpos indicados. SOLDADO AMERICANO. 3Y1 /vectores y células 3Y1 /MUC1-CD fueron transfectadas con siRNA control o piscinas durante 72 h Akt siRNA. Los lisados de las células indicadas se inmunotransferencia con anti-Akt y anti-β-actina (G). Se analizaron las células indicadas para la captación de glucosa (H, izquierda) y la producción de lactato (H, derecha). Los resultados (media ± desviación estándar de tres réplicas) se expresan como /10
6 células nmol. Los lisados de las células indicadas también se analizaron para la actividad PKM2 (I). Los resultados (media ± SD de tres réplicas) se expresan como actividad PKM2 relativa en comparación con la obtenida en las células 3Y1 /vector (asignado un valor de 1).
MUC1-C dominio citoplásmico Cys-3 residuo interactúa con PKM2
Para determinar si MUC1-CD interactúa con PKM2 y por lo tanto afecta a su actividad, se realizaron estudios coimmunoprecipitation con lisados de células 3Y1 /MUC1-CD. Análisis de anti-PKM2 precipita por inmunotransferencia con anti-MUC1-C apoyó la asociación de estas proteínas (Fig. 2A). En experimentos GST pull-down, la incubación de 3Y1 /vector lisados celulares con GST y GST-MUC1-CD proporciona un mayor apoyo para una interacción entre PKM2 y MUC1-CD (Fig. 2B). Para extender estas observaciones a las células que expresan MUC1 endógeno, se realizaron estudios coimmunoprecipitation en lisados de ZR-75-1 células de cáncer de mama humano. Aquí, PKM2 fue detectable en complejos con el 25-20 kDa MUC1-C de la subunidad (Fig. 2C). tirar abajo los experimentos con ZR-75-1 lisados celulares también demostraron unión de MUC1-CD para PKM2 (Fig. 2D). Los estudios con mutantes de deleción de MUC1-CD mostró además que la asociación con PKM2 es conferida por MUC1-CD (1-45) y no MUC1-CD (46 a 72) (Fig. 2D). La incubación de GST-MUC1-CD con PKM2 recombinante purificada marcada con His confirmó la unión directa de MUC1-CD y PKM2 (Fig. 2E). Los resultados también mostraron que MUC1-CD (1-45) y no MUC1-CD (46-72) es responsable de la interacción directa (Fig. 2E). MUC1-CD contiene un motivo CQC (aa 1 a 3) que contribuye a la formación de MUC1-C homodímeros (Fig. 1A) [20]. La mutación del motivo de CQC a AQA (C1A /C3A) bloqueó la unión de MUC1-CD para PKM2 (Fig. 2F). La unión de MUC1-CD a PKM2 también se suprime con el C3A, y no el C1A, mutante, lo que indica que Cys-3 es responsable de la interacción (Fig. 2F). Estos hallazgos indican que MUC1-C se asocia con PKM2 en células a través de una interacción directa mediado por el dominio citoplásmico Cys-3 residuo MUC1-C.
A. Los lisados de células 3Y1 /MUC1-CD se sometieron a inmunoprecipitación con un control de IgG o anti-PKM2. Los precipitados se sometieron a inmunotransferencia con los anticuerpos indicados. B. Los lisados de células 3Y1 /vector se incubaron con GST o GST-MUC1-CD. Los adsorbatos a perlas de glutatión se inmunotransfirieron con anti-PKM2. Entrada de las proteínas GST se evaluó mediante tinción con azul de Coomassie. C. Lisados de ZR-75-1 células de cáncer de mama humano se inmunoprecipitaron con un IgG de control o anti-PKM2. Los precipitados se sometieron a inmunotransferencia con los anticuerpos indicados. D. ZR-75-1 lisados celulares se incubaron con GST, GST-MUC1-CD y los mutantes de deleción GST-MUC1-CD indicados. Los adsorbatos se inmunotransfirieron con anti-PKM2. Entrada de las proteínas GST se evaluó mediante tinción con azul de Coomassie. E. PKM2 se incubó con GST, GST-MUC1-CD y los mutantes de deleción GST-MUC1-CD indicados. Los adsorbatos se inmunotransfirieron con anti-PKM2. F. PKM2 se incubó con GST, GST-MUC1-CD y los mutantes GST-MUC1-CD indicadas en la que Cys-1 y /o Cys-3 fueron sustituidos por Ala. Los adsorbatos se inmunotransfirieron con anti-PKM2.
MUC1-CD se une directamente a la PKM2 dominio B Cys-165 y C-dominio Cys-474
PKM2 consiste en un N-terminal (aa 1-43), A1-dominio (aa 44-116), B-dominio (aa 117-218), A2-dominio (aa 219-389) y C-dominio (aa 390-531) [7] (Fig. 3A). La unión de MUC1-CD fue detectable con PKM2 (1-218) y PKM2 (390-531), pero no con PKM2 (219-389) (Fig. 3B). Un análisis más detallado con PKM2 (1-218) mutantes de deleción demostró que MUC1-CD se une directamente a la B-dominio (aa 117-218) y no el N-terminal (aa 1-43) o A1-dominio (aa 44-116 ) (Fig. 3C). El PKM2 dominio B contiene dos cisteínas en las posiciones 152 y 165. La mutación de PKM2 (117-218) Cys-152 a Ala (C152A) no tuvo ningún efecto en la interacción con MUC1-CD (Fig. 3D, izquierda). Por el contrario, la unión de MUC1-CD y PKM2 (117-218) fue derogada mediante la mutación de Cys-165 a Ala (C165A) (Fig. 3D, derecha). Con respecto a la PKM2 C-dominio (aa 390-531), residuos de Cys están situados en las posiciones 423, 424 y 474. La unión de MUC1-CD a PKM2 (390-531) no se vio afectada por la mutación de Cys-423 a Ala ( C423A) (Fig. 3E, izquierda) o Cys-424 a Ala (C424A) (Fig. 3E, medio). Sin embargo, la interacción con MUC1-CD fue atenuada por mutación del PKM2 (390-531) residuo Cys-474 a Ala (C474A) (Fig. 3E, derecha). Estos hallazgos indican que los MUC1-CD Cys-3 residuo se une directamente a (i) la PKM2 dominio B Cys-165, y (ii) la PKM2 C-dominio Cys-474.
A. Representación esquemática de la proteína PKM2 con el N-terminal (N) y la A1-, B-, A2- y C-dominios. Se destacan la Cys-Cys-165 y 474 residuos. B y C. MUC1-CD se incubaron con GST y los mutantes de deleción de GST-PKM2 indicados. Los adsorbatos se inmunotransfirieron con anti-MUC1-C. Entrada de las proteínas GST se evaluó mediante tinción con azul de Coomassie. D. MUC1-CD se incubó con GST, GST-PKM2 (117-218) y GST-PKM2 (117-218) con las mutaciones C152A y C165A indicados. Los adsorbatos se inmunotransfirieron con anti-MUC1-C. E. MUC1-CD se incubó con GST, GST-PKM2 (390-531) y GST-PKM2 (390-531) con el C423A indicada, C424A y C474A mutaciones. Los adsorbatos se sometieron a inmunotransferencia con anti-MUC1-C.
Fosforilados MUC1-CD se une al dominio PKM2 C-Lys-433
El dominio citoplásmico MUC1-C es fosforilados en Tyr -46 por EGFR (Fig. 1A) [21]. Otros estudios han demostrado que ciertos péptidos de fosfotirosina interactúan con el PKM2 C-dominio e inhiben su actividad [8]. Para determinar si la tirosina fosforilada MUC1-C dominio citoplásmico se une a PKM2, primero se incubaron MUC1-CD y CD-MUC1 (Y46F) con EGFR y ATP. Análisis de los productos de reacción por inmunotransferencia con anti-P-Tyr confirmó la fosforilación de Tyr-46 (Fig. 4A, izquierda). Como se encontró con MUC1-CD, la incubación de p-MUC1-CD con los mutantes de deleción PKM2 demostrado la unión a PKM2 (1-218) y PKM2 (390-531) (Fig. 4A, derecha). La unión de p-MUC1-CD también fue detectable con PKM2 (390-531 /C474A) (Fig. 4B), apoyando una interacción que no está mediada por el residuo PKM2 Cys-474. Para extender estas observaciones, el mutante MUC1-CD (C3A), que carece de la unión a PKM2, se sometió a la fosforilación de EGFR. Comparación de MUC1-CD (C3A) y p-MUC1-CD (C3A) confirmó que la fosforilación de EGFR induce la unión a PKM2 (390-531) (Fig. 4C). Estos resultados también se confirmaron en experimentos en los que la unión de longitud completa PKM2 era detectable con p-MUC1-CD (C3A) y no MUC1-CD (C3A) (Fig. 4D). El PKM2 C-dominio contiene un residuo de Lys-433, que es esencial para el péptido de unión a fosfotirosina [8]. De hecho, la mutación de PKM2 (390-531) Lys-433 a glutamato (K433E) se redujo parcialmente la unión de p-MUC1-CD (Fig. 4E). La incubación de ZR-75-1 lisados celulares con GST-PKM2 (390-531) y GST-PKM2 (390-531 /K433E) demostraron además que la unión a endógena MUC1-C se redujo parcialmente por la mutación K433E (Fig. 4F) . Estos hallazgos demuestran que la fosforilación de la citoplásmica de dominio Tyr-46 residuo MUC1-C confiere la unión al PKM2 C-dominio en Lys-433.
A. Su-etiquetados MUC1-CD y MUC1-CD (Y46F) se incubaron con EGFR en ausencia y en presencia de ATP. Los productos de reacción se analizaron por inmunotransferencia con anti-p-Tyr y anti-MUC1-C (izquierda). GST y los mutantes de deleción de GST-PKM2 indicadas se incubaron con EGFR-fosforilados MUC1-CD (p-MUC1-CD) (derecha). Los adsorbatos se inmunotransfirieron con anti-MUC1-C. Entrada de las proteínas GST se evaluó mediante tinción con azul de Coomassie. B. GST y GST-PKM2 (390-531 /C474A) se incubaron con MUC1-CD o p-MUC1-CD. Los adsorbatos se inmunotransfirieron con anti-MUC1-C. C. GST y GST-PKM2 (390-531) se incubaron con MUC1-CD (C3A) o EGFR fosforilado p-MUC1-CD (C3A). Los adsorbatos se inmunotransfirieron con anti-MUC1-C. D. PKM2 se incubó con GST, GST-MUC1-CD (C3A) y GST-p-MUC1-CD EGFR fosforilado (C3A). Los adsorbatos se inmunotransfirieron con anti-MUC1-C y anti-p-Tyr. E y F. GST, GST-PKM2 (390-531) y GST-PKM2 (390-531 /K433E) se incubaron con p-MUC1-CD (E) o ZR-75-1 lisado celular (F). Los adsorbatos se inmunotransfirieron con anti-MUC1-C.
estimulación de la actividad PKM2 por MUC1-CD Cys-3
PKM2 se alostéricamente activa por la unión de FBP a la C-dominio [7]. De potencial importancia funcional de la interacción entre MUC1-CD y PKM2, la incubación de MUC1-CD con PKM2 se asoció con una modesta estimulación de la actividad PKM2 (5A. Fig, izquierda). la estimulación inducida por MUC1-CD de PKM2 era dependiente de la Cys-3 MUC1-CD con motivos en que MUC1-CD (C3A) no tuvo ningún efecto aparente sobre la actividad PKM2 (Fig. 5A, derecha). Como se muestra anteriormente [7], FBP fue eficaz en la estimulación de la actividad PKM2 (Fig. 5B). Por otra parte, la adición de tanto FBP y MUC1-CD resultó en al menos un aumento aditivo (Fig. 5B), lo que indica que MUC1-CD puede promover la activación inducida por PKM2 FBP. Para extender estas observaciones, que se incubaron PKM2 con GO-203, un péptido que contiene poli-Arg ([R]
9) y la secuencia CQCRRKN MUC1-CD que contiene el residuo Cys-3 que se muestra arriba para unirse PKM2 ( Fig. 5C). GO-203 fue muy eficaz en la estimulación de la actividad PKM2, mientras que un péptido de control, designada CP-2, en el que el residuo Cys-3 fue sustituido con Ala (AQARRKN) tuvo poco efecto (Fig. 5C). Por otra parte, la mutación de PKM2 Cys-474, pero no Cys-165, a Ala dio lugar a la derogación de los aumentos inducidos-GO-203 en la actividad PKM2 (Fig. 5D). La incubación de PKM2 tanto con FBP y GO-203 demostró además que IR-203 es aditiva con FBP en la inducción de la actividad PKM2 (Fig. 5E). Estos resultados indican que la interacción entre los MUC1-CD Cys-3 residuo y PKM2 Cys-474 estimula la actividad PKM2.
A. PKM2 recombinante se incubó en ausencia y en presencia de las concentraciones indicadas de MUC1-CD (izquierda) o MUC1-CD (C3A) (derecha) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los resultados (media + SD de cinco experimentos independientes) se expresan como la actividad PKM2 relativa en comparación con la obtenida con el control. B. PKM2 se incubó con las concentraciones indicadas de FBP solamente, MUC1-CD solo, o FBP y MUC1-CD. Los resultados (media + SD de tres experimentos separados) se expresan como la actividad PKM2 relativa en comparación con la obtenida con el control. C. secuencias de aminoácidos de GO-203 y CP-2 péptidos. PKM2 se incubó con 100 mM GO-203 o CP-2. Los resultados (media + SD de cinco experimentos independientes) se expresan como la actividad PKM2 relativa en comparación con la obtenida con el control. D. los mutantes PKM2 indicados PKM2 y se incubaron en ausencia (barras abiertas) y en presencia de 100 mM GO-203 (barras sólidas). Los resultados (media + SD de tres experimentos separados) se expresan como la actividad PKM2 relativa en comparación con la obtenida en ausencia de GO-203. E. PKM2 se incubó con las concentraciones indicadas de FBP solamente, GO-203 solo, o FBP y GO-203. Los resultados (media ± desviación estándar de tres experimentos separados) se expresan como la actividad PKM2 relativa en comparación con la obtenida con el control.
tirosina fosforilada MUC1-CD inhibe la actividad PKM2
la unión de péptidos de tirosina fosforilada a la PKM2 C-dominio está asociado con la inhibición de PKM2 [8]. En consecuencia, se compararon los efectos de MUC1-CD y EGFR fosforilado p-MUC1-CD sobre la actividad PKM2. Como se muestra anteriormente, la estimulación inducida por FBP de PKM2 se incrementó en MUC1-CD (Fig. 6A). En comparación, fosforilada p-MUC1-CD fue ineficaz en el aumento de la actividad PKM2 (Fig. 6A). Estos estudios con p-MUC1-CD son, sin embargo, complicado por el potencial tanto para los efectos estimulantes de la Cys-3 y efectos inhibidores de p-Tyr-46. En consecuencia, se realizaron experimentos con el mutante de MUC1-CD (C3A), que es ineficaz en la estimulación de PKM2. Aquí, MUC1-CD (C3A) no tuvo ningún efecto estimulante aparente y MUC1-CD (C3A) suprimió la actividad PKM2 (Fig. 6A) EGFR-fosforilados. Como control, la MUC1-CD (Y46F) mutante que había sido incubado con EGFR y ATP tenía poco o ningún efecto (Fig. 6A). Para confirmar estas observaciones, hemos sintetizado péptidos correspondientes al control y MUC1-CD Tyr-46 (YEKV) motivo EGFR-fosforilada (Fig. 6B). El péptido fosfo-Tyr-46, pero no la forma no fosforilada, la actividad PKM2 inhibido (Fig. 6C). Los experimentos también se realizaron con GO-203 solo y en combinación con el péptido fosfo-Tyr-46. En estas condiciones experimentales, la estimulación inducida por 203-GO de la actividad PKM2 no fue afectado por el péptido fosfo-Tyr-46 (Fig. 6D). Estos hallazgos indican que la fosforilación mediada por EGFR de MUC1-CD en el motivo YEKV inhibe la actividad PKM2 y que la estimulación inducida por 203-GO de PKM2 no está bloqueado por este mecanismo.
A. PKM2 se incubó con 10 mM FBP en ausencia (control) y presencia de 10 mM MUC1-CD no fosforilada y EGFR-fosforilados, MUC1-CD (C3A) y MUC1-CD (Y46F). Los resultados (media + SD de tres experimentos separados) se expresan como la actividad PKM2 relativa en comparación con la obtenida con el control. B. Secuencias de los Tyr-46 y fosfo-Tyr-46 péptidos. C. PKM2 se incubó con 10 mM FBP en ausencia (control) y presencia de 100 mM de fosfo-Tyr-46 péptido o péptido Tyr-46. Los resultados (media + SD de tres experimentos separados) se expresan como la actividad PKM2 relativa en comparación con la obtenida con el control. D. PKM2 se incubó en ausencia (control) y presencia de 20 mM GO-203 solo, 100 M péptido fosfo-Tyr-46 solo o IR-203 con el péptido fosfo-Tyr-46. Los resultados (media + SD de tres experimentos separados) se expresan como la actividad PKM2 relativa en comparación con la obtenida con el control.
MUC1-C promueve la glucólisis aeróbica en células de cáncer de mama
Para determinar si endógena MUC1-C afecta a la glucólisis, estudiamos ZR-75-1 y células MCF-7 de cáncer de mama con el silenciamiento estable de la expresión de MUC1-C (Fig. 7A). Regulación a la baja de MUC1-C no tuvo efecto sobre los niveles de PKM2 o fosforilación en Tyr-105 (Fig. 7A). Significativamente, el análisis de ambas células ZR-75-1 y MCF-7 demostró que el silenciamiento MUC1-C se asocia con una disminución de la captación de glucosa (Fig. 7B) y la disminución de la producción de lactato (Fig. 7C), lo que indica que MUC1-C promueve la glucólisis en las células del cáncer de mama. Además de la supresión de la glucólisis, silenciando MUC1-C conferido disminuciones de ZR-75-1 y MCF-7 de formación de colonias (Fig. 7D).
A. Los lisados de ZR-75-1 y MCF-7 células expresan de forma estable un vector vacío o una MUC1siRNA se inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados. B. La indicada se analizaron las células para la captación de glucosa. Los resultados (media ± desviación estándar de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado) se expresan como /10
6 células nmol. C. La indicada se analizaron las células para la producción de lactato. Los resultados (media ± SD de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado) se expresan como la producción de lactato relativa en comparación con la de las células que expresan el vector vacío (asignado un valor de 1). D. El indicado células se sembraron en agar blando y se contaron las colonias después de la incubación durante 14 días. Los resultados (media ± DE de dos experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado) se expresan como el número de colonias en relación a la obtenida con ZR-75-1 o células MCF-7 que expresan un vector vacío (cada uno le asigna un valor de 1).
Efectos de MUC1-C sobre la actividad PKM2 en células de cáncer de mama
se realizaron estudios para determinar si el efecto de MUC1-C de la glucólisis aeróbica en las células de cáncer de mama se asocia con cambios en PKM2 actividad. A las 24 h después de la aprobación de las células ZR-75-1, la actividad se redujo PKM2 con regulación a la baja de la expresión de MUC1-C (8A Fig., Izquierda). Por el contrario, a las 72 h de la cultura, silenciando MUC1-C se asoció con un aumento de la actividad PKM2 (8A Fig., Izquierda). Estas observaciones correspondían con un aumento en el grado de MUC1-C fosforilación de la tirosina de 24 a 72 h de cultivo (Fig. 8A, derecha). Se obtuvieron resultados similares con células MCF-7 (Fig. 8B, izquierda y derecha), lo que indica que el estado de fosforilación de la tirosina-MUC1 C contribuye a la regulación de PKM2. En esa línea de razonamiento, se realizaron estudios para evaluar los efectos de la estimulación de EGF. El tratamiento de las células MCF-7 /vector con EGF se asoció con un aumento de la fosforilación de MUC1-C en tirosina (Fig. 8C, izquierda). Por otra parte, la estimulación de EGF de las células MCF-7 /vector, pero no MCF-7 /MUC1siRNA, las células dio lugar a la regulación por disminución de la actividad PKM2 (Fig. 8C, derecha). Estos hallazgos indican que la tirosina fosforilada MUC1-C suprime la actividad PKM2 en células de cáncer de mama y que este efecto es más pronunciado en la respuesta a la estimulación de EGF.
A y B. Los lisados de la ZR-75-1 se indica ( a) y las células recolectadas en los tiempos indicados después del paso se analizaron para la actividad PKM2 (izquierda) MCF-7 (B). Los resultados (media + SD de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado) se expresan como actividad PKM2 relativa en comparación con la obtenida en células que expresan el vector vacío (asignado un valor de 1). El ZR-75-1 /vector (A) y lisados de células MCF-7 /vector (B) también se incubaron con anti-MUC1-C y los precipitados se inmunotransferencia con los anticuerpos indicados (derecha). C. MCF-7 /vector y células MCF-7 /MUC1siRNA se dejaron sin tratar y estimulados con EGF durante 5 min. Los lisados de células /vector MCF-7 se incubaron con anti-MUC1-C y los precipitados se inmunotransferencia con los anticuerpos indicados (izquierda). Los lisados se ensayó la actividad PKM2 (derecha). Los resultados (media + SD de tres experimentos separados) se expresan como la actividad PKM2 relativa en comparación con la de las células MCF-7 /vector no estimuladas.
Efectos de expresar un MUC1 (C3A) mutante en actividad PKM2
para determinar si los efectos de silenciamiento de MUC1-C se podrían atribuir a la interacción entre el dominio citoplásmico MUC1-C y PKM2, se realizaron estudios con las células HCT116, que son nulo para la expresión de MUC1 y eran de forma estable transfectadas para expresar un vector vacío, de tipo salvaje o MUC1 MUC1 con la mutación C3A (Fig. 9A). MUC1 y MUC1 expresión (C3A) no tuvieron efecto sobre PKM2 o los niveles de p-PKM2 (Tyr-105) (Fig. 9A). La captación de glucosa se incrementó en HCT116 /MUC1, pero no HCT116 /MUC1 (C3A), las células (Fig. 9B). Se obtuvieron resultados similares cuando se mide la producción de lactato (Fig. 9C). MUC1, pero no MUC1 (C3A), la expresión también se asoció con aumentos en la actividad PKM2 (Fig. 9D). Por otra parte, como se indica anteriormente [20], la expresión de MUC1 se asoció con aumentos en la formación de colonias HCT116 y este efecto fue derogada por la MUC1 (C3A) mutante (Fig. 9E). Estos hallazgos indican que el bloqueo de la interacción entre MUC1-CD y PKM2 atenúa los efectos mediados por MUC1-CD en la glucólisis, la actividad PKM2 y la formación de colonias.
A. Los lisados de células HCT116 que expresan de forma estable un vector vacío, de tipo salvaje o MUC1 MUC1 (C3A) se sometieron a inmunotransferencia con los anticuerpos indicados. B. La indicada se analizaron las células para la captación de glucosa. Los resultados (media ± desviación estándar de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado) se expresan como nmol /106 células. C. La indicada se analizaron las células para la producción de lactato. Los resultados (media ± SD de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado) se expresan como la producción de lactato relativa en comparación con la de las células que expresan el vector vacío (asignado un valor de 1). D. Los lisados de las células indicadas se analizaron para la actividad PKM2. Los resultados (media ± SD de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado) se expresan como actividad PKM2 relativa en comparación con la obtenida en células que expresan el vector vacío (asignado un valor de 1). E. El indicado células se sembraron en agar blando y se contaron las colonias después de la incubación durante 14 días. Los resultados (media ± DE de dos experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado) se expresan como el número de colonias en relación a la obtenida con células HCT116 /vector (asignado un valor de 1).
Discusión
MUC1-C promueve la oncoproteína glucólisis
la mayoría de las células cancerosas dependen de la glicolisis aerobia para la generación de energía que se necesita para los procesos celulares. Esta alteración del metabolismo, conocido como el efecto Warburg, implica aumento de la captación de la glucosa con disminución de la utilización del ciclo TCA, tal que el piruvato generado durante la glucólisis se convierte en lactato [22].