Extracto
La genisteína (GEN) es una isoflavona de origen vegetal y puede bloquear el crecimiento celular incontrolado en el cáncer de colon mediante la inhibición de la vía de señalización de Wnt. Este estudio tuvo como objetivo probar la hipótesis de que la expresión génica mejorada de la señalización Wnt antagonista de la vía, DKK1 mediante tratamiento genisteína se asocia con modificaciones epigenéticas del gen en células de cáncer de colon. La genisteína tratamiento induce una detención en la fase G2 dependiente de la concentración en la línea celular de cáncer de colon humano SW480 y la proliferación celular reducida. Los resultados de varias otras líneas celulares de cáncer de colon humano confirmaron los efectos inhibidores del crecimiento de la genisteína. La sobreexpresión de DKK1 confirmó su participación en la inhibición del crecimiento. Desmontables expresión de siRNA DKK1 ligeramente induce el crecimiento celular. la expresión del gen DKK1 se incrementó por la genisteína en SW480 y HCT15 células. la metilación del ADN en el promotor DKK1 no se vio afectada por el tratamiento genisteína en todas las líneas celulares ensayadas. Por otro lado, la genisteína inducida histona H3 acetilación de la región promotora DKK1 en las células SW480 y HCT15. Esto indica que el aumento de acetilación de histonas está asociada con la expresión DKK1 genisteína inducida. La asociación entre la acetilación de histonas y la expresión del gen DKK1 se confirma por el inhibidor de histona desacetilasa tricostatina A tratamiento (TSA). En conclusión, el tratamiento genisteína disminuye el crecimiento celular y la proliferación en las líneas celulares de cáncer de colon. El efecto está asociado con el aumento de la expresión DKK1 través de la inducción de acetilación de histonas en la región promotora DKK1
Visto:. Wang H, Li Q, Chen H (2012) La genisteína Afecta modificaciones de las histonas en proteína relacionada con Dickkopf 1 (DKK1) Gen en SW480 de colon humano línea celular de cáncer. PLoS ONE 7 (7): e40955. doi: 10.1371 /journal.pone.0040955
Editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Marzo, 2012; Aceptado: 15 de Junio de 2012; Publicado: 18 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue financiado en parte por una subvención del NIH /NCI para HC (CA135262) y la Asociación de Soja de Illinois. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la soja contiene diversos componentes bioactivos, que han recibido mucha atención en su potencial capacidad para reducir el riesgo de cáncer [1], [2]. Los estudios epidemiológicos demostraron que el consumo de niveles más altos de los productos de soja en la dieta contribuye a la menor incidencia de cáncer colorrectal en los países asiáticos [3], [4], [5]. Específicamente, la genisteína (4, 5, 7-trihidroxi-isoflavona), una isoflavona natural abundante en la soja, se ha demostrado para reducir el riesgo de cáncer colorrectal [6], [7]. Estos estudios proporcionan una fuerte evidencia de la necesidad de investigar más a fondo los mecanismos detrás de potencial contra el cáncer de genisteína.
En estudios de cultivos celulares, la genisteína se ha informado de alterar la fisiología celular en varias líneas celulares de cáncer de colon. Un estudio reciente realizado por Fan et al. identificaron que las células de cáncer de colon habían cambiado morfología, incluyendo condensación de cromatina y fragmentación nuclear después del tratamiento genisteína [8]. Además, las concentraciones más altas de la genisteína de & gt; 10 mmol /L indujeron significativamente la inhibición de la proliferación celular y la fragmentación del ADN en una línea celular de colon humano [9]. Además, en líneas celulares de cáncer de colon Caco-2 y SW620, la muerte celular fue inducida por el tratamiento con extracto de soja [10]. Por lo tanto, la genisteína se está convirtiendo en un compuesto prometedor en la prevención y el tratamiento del cáncer de colon. En el presente estudio, hemos explorado adicionalmente las propiedades antitumorales de la genisteína mediante pruebas de la progresión del ciclo celular y la proliferación celular en varias células de cáncer colorrectal en respuesta al tratamiento con concentraciones crecientes de genisteína.
Se han propuesto varias vías y mecanismos para ser responsable de la capacidad de la genisteína para reducir el riesgo de cáncer. la señalización de IGF-IR, la regulación AKT y el crecimiento celular se asocia con los efectos antitumorales de la genisteína [9], [11]. Además, la genisteína también posee propiedades antioxidantes mediante la imitación de estrógenos a través de estrógeno fosforilación mediada por receptor de ERK1 /2 y la activación de la vía de NFkB [12] de señalización. Otros informes de estudios recientes en animales indican que la genisteína inhibe las células de cáncer dependiente de hormonas o -independiente mediante la regulación de las interacciones entre la vitamina D y los receptores de estrógenos [13], [14], [15]. La genisteína regula la transcripción de genes en varias líneas celulares de cáncer de regulaciones epigenéticos, por ejemplo, metilación del ADN y las histonas modificaciones [16], [17], [18]. La genisteína altera la metilación del ADN de varios genes en modelos de rata y ratón [19], [20]. Sin embargo, los mecanismos detrás de papel de la genisteína en la proliferación celular o la apoptosis durante la carcinogénesis sigue siendo poco conocida.
El Wingless-int (WNT) vía de señalización comprende un gran número de factores de crecimiento que están involucrados en la organogénesis, la proliferación, la regeneración, la determinación de células destino y adhesión célula-célula [21], [22]. proteínas Wnt se unen a receptores Frizzled (FRZ) y proteína relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP) co-receptores, haciendo que la estabilización de β-catenina citosólica y la acumulación. En consecuencia, aumenta nucleares β-catenina y complejos con TCF /LEF factores de transcripción, lo que lleva al aumento de la transcripción de genes diana, incluyendo la ciclina D1 [23]. la señalización de Wnt aberrante es uno de los contribuyentes para la transición del epitelio del colon normal a células de tumores malignos [24], [25]. La genisteína se informó recientemente para suprimir la señalización de Wnt en líneas celulares de cáncer de colon [26], [27], que proporciona un mecanismo potencial para la capacidad anticancerígena de genisteína.
Uno de los principales reguladores de la vía de señalización Wnt es su antagonista Dickkopf 1 (DKK1). DKK1 impide β-catenina mediada por la transducción de señales mediante la unión a proteínas y PRL Kremen, la promoción de las células diferenciación y apoptosis [28], [29], [30], [31], [32]. El silenciamiento o pérdida de DKK1 se ha documentado en varias enfermedades. En el cáncer colorrectal silenciada
DKK1
expresión está estrechamente asociada con la inestabilidad de microsatélites de los subtipos de tumores [33]. Se ha informado de que la capacidad de supresión de tumor de DKK1 es reprimida por la hipermetilación de su promotor en las etapas avanzadas de cáncer de colon [34]. En células de carcinoma renal humano, inducir químicamente acetilación de histonas en el promotor DKK1 dio como resultado la re-activación de la expresión DKK1, lo que demuestra que, además de la metilación del ADN, las modificaciones de la histona cola también pueden contribuir al control de la transcripción de genes críticos relacionados con el desarrollo del cáncer [ ,,,0],35].
en el presente estudio, hemos investigado las propiedades anticancerígenas de la genisteína mediante la identificación de sus efectos sobre la fisiología de las células cancerosas y el examen de la base mecanicista de
DKK1
activación. En particular, este estudio es uno de los primeros en relacionar las modificaciones epigenéticas genisteína mediada de
DKK1
a las propiedades anticancerígenas de la genisteína en el cáncer colorrectal.
Resultados
La genisteína Tratamiento selectivamente Expresión génica inducida DKK1 pero no alteró los patrones de metilación del promotor DKK1
Para investigar la correlación entre la metilación del ADN en el
DKK1
isla CpG promotor y el efecto del tratamiento con genisteína en
DKK1
expresión, en tiempo real RT-PCR se realizó para medir
expresión DKK1
ARNm y la reacción en cadena de polimerasa específica de metilación (MSP) y secuenciación de bisulfito (BSF) de la
se realizaron DKK1
región promotora para examinar el estado de metilación del promotor (Fig. 1). En primer lugar,
expresión DKK1
gen se analizó en líneas celulares de cáncer de colon disponibles para investigar los efectos del tratamiento de la genisteína. Entre las líneas celulares ensayadas, SW480 y HCT15 células mostraron la inducción de la expresión génica DKK1 por la genisteína (Fig. 1A). El análisis de la metilación del ADN en el
DKK1
región promotora confirmó que la expresión del gen DKK1 en general está inversamente relacionada con el nivel de metilación de la región ensayada (-159 /+ 109, Fig. 1B, 1C, y 1D) . Específicamente, RKO, SW48, y DLD-1 células exhiben muy alta, si no completa, la metilación de la región (Fig. 1C y 1D). Esta hipermetilación está inversamente relacionada con el nivel de expresión del gen DKK1 como se muestra en la Fig. 1A. Para las líneas celulares que expresan DKK1-HCT15, HT29, y SW480, hay un mínimo de la metilación del ADN observado (Fig. 1C y 1D). Más importante aún, el tratamiento genisteína no alteró la metilación del ADN de la
DKK1
región promotora en las líneas celulares ensayadas, independientemente del nivel de metilación del ADN en la región (Fig. 1C y 1D).
SW480, DLD-1, HCT15, HT29, RKO y SW48 fueron tratadas con genisteína durante 2 días antes de la recogida de muestras para su posterior análisis. A) la expresión de ARNm DKK1 relativa. la expresión de ARNm se analizó mediante RT-PCR. Los datos se normalizaron con el control interno L7a. Tres muestras de células independientes se analizaron y se presentan como la media ± SEM. Asteriscos (*) indican significación estadística en comparación con el control de la misma línea celular (p & lt; 0,05). B) Esquema de la región promotora DKK1. Barra horizontal representa la isla CpG dentro de la región promotora. Las barras verticales indican los sitios CpG individuales. puntas de flecha negras indican las posiciones de los cebadores utilizados en las amplificaciones de PCR para bisulfito de secuenciación (-159 a 109). Las flechas representan las posiciones de los cebadores usados para amplificaciones por PCR en MSP (-60 + 73). C) MSP de la región promotora DKK1 en HCT15, HT29, RKO y SW48. Eje Y representa el nivel de metilación y los valores se calcula como porcentaje de M /(M + UM). Cuando no se ve, las barras de error están dentro de las columnas. D) secuenciación de bisulfito de la región promotora DKK1 en SW480 y células DLD-1. Cada círculo abierto representa un C no metilado dentro de un CpG, mientras que un círculo relleno representa un metilado C dentro de un CpG. Cada fila de círculos representa un clon individual utilizada para la secuenciación.
La genisteína dosis y tiempo dependiente indujo la expresión de genes DKK1
En tiempo real se realizó RT-PCR para medir
niveles DKK1
mRNA de expresión en respuesta a diferentes dosis de genisteína y tiempos de exposición. En general,
DKK1
expresión se incrementó por la genisteína de una manera dependiente de la dosis (Fig. 2A). Después de 2 d de tratamiento genisteína,
expresión DKK1
mRNA fue 3 veces y 8 veces mayor después de los tratamientos de 50 y 75 mol /L de genisteína, respectivamente, en comparación con el control sin la genisteína (p & lt; 0,05, Fig. 2A). El nivel de mRNA de
DKK1
en las células SW480 también fue aumentado por el tratamiento genisteína (75 mmol /L) de una manera dependiente del tiempo (Fig 2B.) Y llegó a & gt; 10 veces de inducción en comparación d 4 al nivel en el control de DMSO.
células SW480
a) fueron tratados por diferentes concentraciones de genisteína durante 2 d. la expresión de ARNm se analizó por RT-PCR. El eje X indica la concentración de genisteína y el eje y muestra el nivel de expresión de mRNA relativa. Los datos se normalizaron con el control interno L7a. Asteriscos (*) indican significación estadística en comparación con 0 mmol /L de genisteína (
p Hotel & lt; 0,05). B) Evolución temporal de
DKK1
expresión en SW480 después del tratamiento con genisteína. células SW480 se trataron con 75 mmol /L de genisteína y se tomaron muestras en el día 1, 2, 3 y 4 del tratamiento. Los datos se normalizaron con el control interno L7a. Tres experimentos independientes se realizaron y se presentan como la media ± SEM. Donde invisibles, las barras de error están contenidas dentro de las barras. Asteriscos (*) indican significación estadística en comparación con d 1 de 75 mmol /L de genisteína (
p Hotel & lt; 0,05). C) expresión de la proteína DKK1. extractos de proteínas de células enteras se recogieron a partir de células SW480 y análisis de transferencia Western de DKK1 se realizó como se describe en materiales y métodos. Una transferencia desde el oeste de análisis se muestra y la cuantificación representa la media ± SEM de 3 muestras independientes. La actina se utilizó como control de carga. Asteriscos (*) indican significación estadística en comparación con el control de 0 mmol /L de genisteína (
p Hotel & lt; 0,05).
La inducción de
DKK1
fue confirmada por la medición de su nivel de expresión de proteínas en células SW480 (Fig. 2C). DKK1 expresión de la proteína mostró una inducción de 3 veces por 75 mmol /L de tratamiento genisteína en las células SW480 después de un tratamiento de 4-d en comparación con el control.
Genistein inhibido la progresión del ciclo celular en las células SW480
Para investigar el efecto de la genisteína sobre la progresión del ciclo celular de las células SW480, el contenido de ADN de las células SW480 se midió por análisis de ajuste área después de la citometría de flujo análisis. Los histogramas muestran que la población de células en G1 se disminuyó notablemente por 75 mmol /L de tratamiento genisteína en comparación con el control sin genisteína, con una disminución de células en la fase S (Fig. 3A). Por otro lado, el tratamiento genisteína resultó en una acumulación de células en fase G2 /M en las células SW480.
SW480 células se trataron con varias concentraciones de genisteína para 2 d antes de la recogida de muestras. A) histogramas de ADN representativos de tratamiento genisteína de 0 y 75 mmol /L por citometría de flujo. Eje Y representa el contenido relativo de ADN y el eje x muestra las etapas del ciclo celular. B) Análisis del ciclo celular de las células tratadas genisteína. El porcentaje de células en G1 (•), S (▴) o G2 /M (▪) se muestra. Los datos representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. C) WST-1 ensayo de proliferación. WST-1 señales procedentes de cada pocillo se leyó a 450 nm para la absorbancia contra longitud de onda de referencia de 630 nm. La absorbancia se convierte en el número de células reales utilizando un estándar generada por diluciones en serie de un número conocido de células. Tres muestras de células independientes se analizaron y se presentan como la media ± SEM. Asteriscos (*) indican significación estadística en comparación con 0 mmol /L de genisteína (
p Hotel & lt; 0,05).
Los efectos de la genisteína sobre la progresión del ciclo celular se analizaron adicionalmente mediante tratamiento de las células con genisteína en concentraciones de 1 a 75 mol /L. Porcentaje de células en diferentes fases se calculó como la relación de células cerradas a la población celular total. concentraciones de genisteína por encima de 5 mmol /L aumentaron el porcentaje de células en fase G2 /M de manera significativa (p & lt; 0,05) con la más alta acumulación observada a 75 mol /L de genisteína (p & lt; 0,05, Fig 3B.). Los resultados demuestran que el porcentaje de células en la fase G1 se abolió siguiente 75 mmol /L de tratamiento genisteína (Fig. 3B). El porcentaje de células en fase S se redujo significativamente (p & lt; 0,05) después de 50 y 75 mol /L de genisteína tratamientos después de un aumento transitorio de 25 mmol /L genisteína en comparación con el control sin genisteína. En conjunto, la progresión del ciclo celular en las células SW480 estaba regulado por la genisteína en una forma dependiente de la dosis.
La genisteína inhibe la proliferación celular en SW480 y varias otras líneas celulares de cáncer de colon
La proliferación celular se ensayó por el ensayo de WST-1, que mostraron que los tratamientos genisteína disminuyó el número de células de las células SW480 de una manera dependiente de la dosis (Fig. 3C). A concentraciones por encima de genisteína número de células /L 15 mu mol se redujo significativamente en comparación con el control sin la genisteína (p & lt; 0,05). Este efecto anti-proliferativo de genisteína fue confirmado en varias líneas celulares de cáncer de colon (Figura S1). El ensayo de yoduro de propidio AnnexinV-no mostró ningún cambio por cualquiera de los tratamientos de genisteína, lo que indica que la genisteína no afecta a la tasa de apoptosis (datos no presentados). Estos resultados indican que el crecimiento de supresión efecto de la genisteína es generalizable a las líneas celulares de cáncer de colon humanas comunes.
ciclina D1 mRNA de expresión disminuida tras el tratamiento genisteína en células SW480
genes de control del ciclo celular
p21
,
ciclina D1
y
c-MYC ¿Cuáles son altamente correlacionada con la regulación del crecimiento celular. Con base en los datos presentados anteriormente, la detención del ciclo celular en G2 se produjo en las células SW480 mediante tratamiento genisteína. Para investigar más a fondo los efectos de la genisteína en la progresión del ciclo celular, la expresión de mRNA de los genes que controlan el ciclo celular
p21
,
Ciclina D1
y
c-MYC
se mide por en tiempo real de RT-PCR. Nuestros resultados mostraron que la expresión de
Ciclina D1
se redujo significativamente (p & lt; 0,05) por 50 y 75 mmol /L de genisteína en comparación con el control (Fig 4, p & lt;. 0.05). La expresión de
p21
y
c-MYC
no fue afectada por ninguno de los tratamientos de genisteína. La disminución de expresión de
Ciclina D1
está de acuerdo con los datos del ciclo celular de citometría de flujo que muestra que la progresión del ciclo celular se inhibió por el tratamiento genisteína.
SW480 células se trataron con 0, 1, 5 , 15, 25, 50 o 75 mmol /L de genisteína para 2 d. Los niveles de expresión de ARNm de
p21, ciclina D1
y
c-MYC
se midieron por RT-PCR. L7a se utilizó como control interno. Tres experimentos independientes fueron analizados y presentados como la media ± SEM. Asteriscos (*) indican significación estadística en comparación con el control, 0 mmol /L de genisteína (
p Hotel & lt; 0,05).
La sobreexpresión de DKK1 inhibido la progresión del ciclo celular y la proliferación celular en SW480 las células
Para investigar el papel potencial de
DKK1 Hoteles en la progresión del ciclo celular, SW480 células fueron transfectadas con un plásmido pCMV-XL5 contiene humana
DKK1
. La sobreexpresión de
DKK1
se confirmó por análisis RT-PCR de ARNm y análisis de transferencia Western de la proteína (Fig. 5A y 5B). Análisis de
Ciclina D1
expresión mostró que la sobreexpresión de DKK1 inducida represión similar de la expresión de genes como el tratamiento genisteína (Fig. 5A). La sobreexpresión de
DKK1
aumentó significativamente el porcentaje de células en la fase G2 /M en comparación con el control de vector (p & lt;. 0.05, Fig 5C), aunque en menor medida en comparación con el tratamiento genisteína. Mientras tanto, el porcentaje de células en la fase G1 se redujo significativamente en las células que sobreexpresan DKK1 (p & lt; 0,05), y no hubo ningún cambio significativo en el número de células en la fase S. Los resultados del ensayo WST-1 mostraron que la sobreexpresión de
DKK1
disminuye la proliferación de células SW480, aunque en mucho menor medida en comparación con el tratamiento genisteína (p & lt; 0,05, Fig 5D.). En general, la sobreexpresión de
DKK1
produjo efectos similares en la inhibición de la progresión celular y la proliferación celular al igual que el tratamiento de la genisteína, lo que sugiere un papel de DKK1 en estos eventos celulares.
pCMV vector que contiene humano
DKK1
gen se utilizó para transfectar células antes de la recogida de muestras para su análisis. Vacío vector pCMV se utilizó como el control para los experimentos de sobreexpresión. Tres muestras de células independientes se analizaron y se presentan como la media ± SEM. A) la expresión del ARNm de
DKK1
y
Ciclina D1 Hoteles en regular y
DKK1 células transfectadas
SW480. La expresión de mRNA se analizó por RT-PCR. Los datos se normalizaron con el control interno L7a. B) expresión de la proteína DKK1 en las células normales y transfectadas células SW480. extractos de proteínas de células enteras se recogieron a partir de células SW480 transfectadas y análisis de transferencia Western de DKK1 se realizó como se describe en materiales y métodos. Una mancha representativo se muestra la cuantificación y representa la media ± SEM de 3 platos independientes. La actina se utilizó como control de carga. C) Análisis del ciclo celular de regular y
DKK1 células transfectadas
SW480. El resultado se obtuvo por citometría de flujo. Eje Y representa% de células cerradas y el eje x muestra las etapas del ciclo celular diferentes, incluyendo G1, S y G2 /M. D) WST-1 en el ensayo de proliferación de vectores y
DKK1 células transfectadas
SW480. señales de WST-1 se convierten en el número de células reales utilizando un estándar generada por diluciones en serie de un número conocido de células. Los datos se normalizaron para controlar el tratamiento de la genisteína y el vector de transfección DKK1, respectivamente. Asteriscos (*) indican significación estadística en comparación con el respectivo grupo de control (para controlar la genisteína; DKK1 al vector;
p Hotel & lt; 0,05). Para la caída de DKK1, dúplex de siRNA contra gen DKK1 humano se transfectaron en células SW480. secuencias revueltos fueron utilizados como el control de siRNA. E) la expresión del ARNm de
DKK1
y
Ciclina D1 Hoteles en control de siRNA (N SI /S) y
DKK1
siRNA (SI DKK1) tratados con células SW480 de control y tratamientos de genisteína. La expresión de mRNA se analizó por RT-PCR. Los datos se normalizaron con el control interno L7a. F) WST-1 en el ensayo de proliferación de células de control de siRNA y
DKK1
siRNA SW480. señales de WST-1 se convierten en el número de células reales utilizando un estándar generada por diluciones en serie de un número conocido de células. Asteriscos (*) indican significación estadística en comparación con el control de 0 mmol /L de genisteína (
p Hotel & lt; 0,05). El paréntesis indica la diferencia estadística entre los grupos N /S Si y Si DKK1 tratadas con genisteína (p = 0,002).
Desmontables de DKK1 en las células SW480 revertirse parcialmente los cambios de perfil celular causada por el tratamiento genisteína
Para investigar si la alteración de las propiedades celulares de SW480 causadas por la genisteína es dependiente de la
DKK1 expresión génica
, siRNA dirigidos DKK1 se transfectó en células SW480 seguido de tratamiento genisteína. Real-time RT-PCR mostró que siRNA redujo efectivamente la expresión DKK1 en SW480 en ambos tratamientos de control y genisteína (P & lt; 0.05., Fig 5E). Por otra parte, la reducción de los
Ciclina D1
la expresión del ARNm mediante tratamiento genisteína como se observa en las células no tratadas con siRNA (N /S SI) fue abolida por la caída de DKK1 (DKK1 si, Fig. 5E). Mientras tanto, aunque se observa el efecto inhibidor del crecimiento de la genisteína en tanto N /S siRNA y
grupos DKK1
siRNA, desmontables de DKK1 aumentó significativamente la proliferación de células SW480 en comparación con la de control de siRNA en el tratamiento de la genisteína (p & lt ;.. 0,05, DKK1 siRNA vs N /S siRNA en los tratamientos de genisteína, la figura 5F)
la genisteína se llevó a cabo la acetilación de histonas inducida dentro del DKK1 génica en células SW480 y HCT15
chip para analizar la estructura de la cromatina en el promotor (-96 /-28), codificación (+ 635 /+ 742), y 5 'regiones de control aguas arriba (-2781 /-2713) de la
DKK1
gen (Fig. 6A) . región de control aguas arriba de la 5 'se utilizó como control negativo para mostrar la región inactiva relativa durante la transcripción. Se utilizaron células DLD-1 como control negativo para indicar el estado de la cromatina cuando el
expresión DKK1
gen es silenciado y no responde al tratamiento con genisteína. IgG de conejo normal se utiliza como un anticuerpo de control interno y de unión a cualquier ADN similar a la unión en la IgG de control se consideró no específica. El aumento de la ARN polimerasa II (PolII) de unión en el
DKK1
región promotora se indica aumento de la transcripción de la
DKK1
gen en las células SW480 en respuesta a la genisteína (p & lt; 0,05, Fig 6B.). En contraste, no hubo PolII unión mínima dentro de los
DKK1
de genes en las células DLD-1, lo que confirma la transcripción del gen silenciado en LDN-1 células (Fig. 6B).
A) Un dibujo esquemático de la
DKK1
gen. puntas de flecha negras representan los cebadores utilizados para la PCR para probar tres regiones en el chip de ensayo: promotor, codificación y control de aguas arriba 5 '. cajas llenas representan exones del
DKK1
gen, mientras que la caja abierta representa el
DKK1
promotor. Las líneas negras representan intrones. B) Chip análisis de la abundancia relativa de proteínas dentro de las diferentes regiones del
DKK1
de genes en las células SW480 y DLD-1. ADN inmunoprecipitado se analizó por PCR en tiempo real. Los anticuerpos específicos utilizados para la inmunoprecipitación se etiquetan en el eje x. Una IgG de conejo no específico se utilizó como control negativo. Los datos se representan como la relación con el valor de 25% de ADN de entrada. Tres experimentos independientes se analizaron y se presentan como la media ± SEM. Asteriscos (*) indican significación estadística en comparación con el control usando el mismo anticuerpo dentro de la línea celular (p & lt; 0,05).
Para determinar si el aumento del nivel de transcripción de la
DKK1
génica en respuesta a la genisteína fue modulada por alteraciones de estructura de la cromatina, anticuerpos contra histonas acetiladas, metiladas, o fosforilados fueron utilizados en el chip de ensayo. modificaciones de las histonas en las tres regiones representativas de la
DKK1
gen fueron examinados por primera vez en las células SW480 después del tratamiento genisteína, utilizando células DLD-1 como control negativo. Los aumentos en la histona H3 acetilada en el promotor y regiones de
codificación DKK1
se observaron en las células SW480 después del tratamiento genisteína (p & lt;. 0.05, Fig 6B, H3Ac), sin acetilación significativa de las histonas en células DLD-1 antes o después del tratamiento con genisteína (Fig. 6B). La abundancia de la otra histona acetilada prueba, la histona H4 acetilado, no se vio afectada por el tratamiento genisteína en cualquiera de las líneas celulares (H4ac). Aunque había un nivel mucho más alto de dimetil histona H3 lisina 4 en las células SW480 comparación con las células DLD-1, el tratamiento genisteína no afectó el estado de metilación de este residuo de la histona H3 (Fig. 6B, H3K4me2). La fosforilación de la histona H3 en serina 10 También se investigó y el resultado mostró que había una disminución modesta en varias regiones del
DKK1
gen por tratamiento genisteína en todas las líneas celulares ensayadas (p & lt;. 0.05, Fig 6B, H3S10p). En resumen, la transcripción activa del
DKK1
gen se asoció con el aumento de la acetilación de la histona H3 en su región del gen, lo que probablemente dio lugar a la contratación de PolII a su promotor.
DKK1 mRNA Expresión fue inducida por la histona deacetilasa (HDAC) inhibidor en células SW480
TSA es un inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC) que interactúa con la mayoría de los miembros de la familia HDAC e induce la acetilación de las histonas. Para confirmar los efectos de la genisteína inducida por la acetilación de histonas en
DKK1
la transcripción, se trataron las células SW480 con una serie de concentraciones de TSA y compararon los resultados con el tratamiento genisteína. La expresión de mRNA
DKK1
se incrementó significativamente por el tratamiento de TSA en una forma dependiente de la dosis, similar al resultado observado del tratamiento genisteína (p. & Lt; 0,05, Figura 7).
nivel DKK1
mRNA se analizó en las células SW480 tratadas con 50, 100 o 200 nmol /L de TSA (TSA50, TSA100, y TSA200, respectivamente) para 1 d. tratamiento genisteína se realizó como se ha descrito anteriormente. nivel de expresión de ARNm se analizó mediante RT-PCR. Tres muestras de células independientes se analizaron y se presentan como la media ± SEM. Valores con letras diferentes difieren (
p Hotel & lt; 0,05).
Discusión
El presente estudio pretende identificar los mecanismos potenciales de los efectos antitumorales de la genisteína. Hemos observado que los niveles de ARNm y proteínas tanto de DKK1 se upregulated por el tratamiento genisteína. Nuestros resultados demostraron que el tratamiento genisteína induce la detención del ciclo celular y la proliferación celular inhibida en células de cáncer de colon SW480. Esto fue confirmado luego en varias líneas celulares de cáncer de colon. Tanto la sobreexpresión y desmontables de
DKK1
confirmaron la participación de DKK1 en la inhibición de la progresión del ciclo celular y la proliferación celular. Nuestro resultado demostró que el aumento de expresión DKK1 podría ser una de las razones que provocaron la detención del ciclo celular y la inhibición de la proliferación celular mediante el tratamiento genisteína. Además, la comparación entre las células
DKK1
que expresan incluyendo HCT15, HT29 y SW480, y las células
DKK1
reprimidos incluyendo RKO, SW48 y DLD-1 mostró que la transcripción de genes de
DKK1
está inversamente relacionada con su estado de metilación. La genisteína no afecta a la metilación del ADN de la
DKK1
promotor. Por otro lado, y más importante aún, hemos hecho la observación de que la genisteína induce la acetilación de histonas en el
DKK1
gen y esto se correlaciona con la activación de la transcripción de genes.
Los papeles contra el cáncer de genisteína, incluyendo la promoción de la apoptosis, la inhibición de la progresión del ciclo celular, la proliferación celular y la invasión, el bloqueo de la angiogénesis y la metástasis en varios tipos de cánceres han sido bien documentado [7], [36], [37], [38]. Los mecanismos moleculares detrás de estas funciones contra el cáncer de genisteína incluyen modulaciones de inhibidores del ciclo celular, la regulación de los genes relacionados con la apoptosis, así como la inhibición de IGF-IR y de señalización PI3K /AKT [11], [39], [40], [41]. El trabajo de nuestro grupo ha demostrado que la genisteína inhibe otra vía fundamental en el desarrollo del cáncer de colon, la vía Wnt /β-catenina, al interferir con la metilación del promotor de genes específicos. Específicamente, la genisteína inducida
WNT5a
expresión por la disminución de la metilación dentro de la región promotora del gen [27]. La genisteína también inhibió la vía /β-catenina WNT mediante la activación de otro antagonista de WNT,
sFRP2
, por desmetilación de las islas CpG dentro del gen [26]. El presente estudio se amplió el conocimiento para incluir DKK1 como otro factor en la señalización de WNT que media la respuesta del tratamiento genisteína. Como un represor del crecimiento celular del cáncer, DKK1 es un antagonista principal que interfiere con la vía Wnt y regula a la baja la expresión de los genes diana aguas abajo incluyendo ciclina D1 [28], [42], [43].
La expresión de DKK1 fue silenciado por la hipermetilación del promotor en la etapa avanzada de cáncer de colon (Dukes C y D) [34]. En DLD-1 línea celular de Dukes C, una etapa más avanzada del cáncer de colon, desmetilación del gen DKK1 por 5-aza-2'- desoxicitidina, un inhibidor de DNMT, reactivó la expresión DKK1 [34], [44] . Dado que la genisteína se ha demostrado que activan los genes a través de CpG desmetilación [19], primero a prueba la posibilidad de DKK1 promotor desmetilación mediante la genisteína. Nuestro resultado confirmó que el nivel de metilación en la isla CpG promotor está inversamente relacionada con la expresión génica de DKK1. En las líneas celulares con la región promotora hypermethylated, incluyendo DLD-1, RKO, y SW48, hubo mínimo si no silencia la expresión del gen DKK1. Además, el tratamiento genisteína no cambió la hipermetilación de la región en estas células, ni tampoco indujo ningún expresión génica. Por otro lado, DKK1 era no metilado en la etapa temprana de cáncer de colon (Dukes B) y líneas celulares relacionadas, incluyendo SW480 [34] y HCT15. Tanto MSP y secuenciación de bisulfito confirmaron que la metilación del ADN era muy poca, o ninguna, en las líneas celulares. Además, la hipometilación no se cambia por el tratamiento genisteína. Por lo tanto, la desmetilación del ADN se descartó como un mecanismo para la inducción de la expresión del gen DKK1 por genisteína en estas líneas celulares.
Se ha informado de que la genisteína también modula otros marcadores epigenéticos en el nivel de la cromatina [16], [45 ], [46].