Extracto
Fondo & amp; Objetivos
El tratamiento actual de destino hacia los cánceres colorrectales avanzados se centra principalmente en el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de señalización, pero sus efectos acumulativos con la quimioterapia son todavía limitados. Desintegrina y metaloproteinasa (ADAM) escinde el factor de crecimiento epidérmico de unión proheparin factor de crecimiento similar (proHB-EGF). Y soluble HB-EGF activa EGFR. En paralelo, el fragmento carboxi-terminal de proHB-EGF (HB-EGF-CTF) se transloca a la membrana nuclear interna, y posteriormente se ejerce sobre la regulación de la proliferación celular mediante la proteína nuclear dedo leucemia de zinc promielocítica (PLZF) de unión, un represor transcripcional , causando de ese modo su exportación nuclear. La hipótesis de que la inhibición de HB-EGF-CTF translocación nuclear puede ser una nueva estrategia en la prevención de la proliferación celular.
Métodos
12
-O-
tetradecanoylphorbor-13- acetato (TPA) se trató para activar ADAM. Nueve mil compuestos químicos fueron seleccionados por sus eficacias en el bloqueo de la unión de HB-EGF-CTF de dedo de zinc de leucemia promielocítica (PLZF) con sistema de Alphascreen. Los candidatos obtenidos fueron utilizados para bloquear la unión de HB-EGF-CTF para PLZF en células de cáncer de colon, HT29 y HCT116. La proliferación celular se investigó con un ensayo de curva de crecimiento. La localización intracelular, y la asociación entre el HB-EGF-CTF y PLZF, se evaluó con la tinción de inmunofluorescencia e inmunoprecipitación y Western Blot, respectivamente. Los efectos de los candidatos obtenidos en la fosforilación de EGFR y en la translocación nuclear de HB-EGF-CTF y exportación de PLZF durante el receptor tipo 1 de la angiotensina II (AT1R) desmontables también fueron investigados.
Resultados
Telmisartán y candesartan se encontró que eran posibles candidatos. Telmisartan inhibió la proliferación celular inducida por TPA fuerte que candesartán. Telmisartán, pero no candesartán bloquea la translocación nuclear de HB-EGF-CTF, y la unión de HB-EGF-CTF para PLZF, TPA durante la estimulación. Ambos candesartán y telmisartán no inhibieron la fosforilación inducida por TPA EGFR, y telmisartán, pero no candesartán, inhibieron TPA inducida por la translocación nuclear de HB-EGF-CTF después de la caída de AT1R.
Conclusiones
la inhibición de la translocación nuclear HB-EGF-CTF con telmisartán puede ser una nueva estrategia en la prevención de la proliferación de células
Visto:. Ozeki K, S Tanida, Morimoto C, Inoue Y, Mizoshita T, Tsukamoto H, et al . (2013) El telmisartán inhibe la proliferación celular mediante el bloqueo de la translocación nuclear proHB-EGF C-terminal del fragmento en células de cáncer de colon. PLoS ONE 8 (2): e56770. doi: 10.1371 /journal.pone.0056770
Editor: Jian-Xin Gao, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, China
Recibido: August 1, 2012; Aceptado 15 de enero de 2013; Publicado: 22 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Ozeki et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una subvención-en ayudas a la investigación científica C (KAKENHI 22590704) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores tienen las siguientes interés en competencia: Yoshimasa Inoue y Eiji Nishiwaki son empleados por comercial Incorporación empresa Carna Biosciences. No hay más patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores. Todos los autores declaran que no hay conflicto de intereses financieros existe en relación con el contenido del artículo.
Introducción
El cáncer colorrectal es la principal causa de muerte por tumores gastrointestinales [1]. Actualmente tratamientos terapéuticos hacia los cánceres colorrectales avanzados se centran principalmente en el diseño de agentes terapéuticos que se dirige al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), el bloqueo de anticuerpos tales como cetuximab y panitumumab la monoclonal [2], [3]. Se obtienen los efectos aditivos de estos anticuerpos terapéuticos más quimioterapia de combinación en el cáncer colorrectal avanzado, pero limitado debido a la mutación KRAS abolió estos efectos [3], [4].
fragmentos N-terminales de ligandos de EGFR que incluyen heparina de unión al factor de crecimiento epidérmico como factor de crecimiento (HB-EGF), que se consideran implicados en la proliferación celular principalmente en las células de cáncer de colon se unen a EGFR e inducir su fosforilación [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. G-receptor acoplado a proteína (GPCR) agonistas (por ejemplo, la interleucina-8) y 12
O
-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) inducida por la transactivación de EGFR a través de una desintegrina y metaloproteinasa (ADAM) - escindido proHB-EGF [10], [11]. Los fragmentos carboxi-terminal de proHB-EGF (HB-EGF-CTF) producido por ectodominio derramamiento translocan en la membrana nuclear interna, posteriormente ejercer sobre la regulación de la proliferación celular mediante la proteína nuclear dedo leucemia promielocítica zinc (PLZF) de unión, un represor transcripcional , causando de ese modo su exportación nuclear [12], [13]. Por lo tanto, la inhibición de la señalización de translocación nuclear de HB-EGF-CTF se considera que es una nueva estrategia contra el desarrollo de cáncer colorrectal. Sin embargo, no hay evidencia de agentes terapéuticos que bloquean específicamente la translocación nuclear de HB-EGF-CTF y vinculantes de que al PLZF
Por lo tanto, los objetivos del presente estudio fueron: i.) La pantalla de sustancia química potente compuestos que son capaces de inhibir las interacciones entre HB-EGF-CTF y PLZF través de GST-tire hacia abajo de ensayo, la resonancia de plasmón de superficie (SPR) espectroscopia y Alphascreen tecnología, ii) validar los efectos inhibidores de estos potentes compuestos sobre la proliferación celular, y iii ) certificar la importancia de la inhibición de la translocación nuclear de HB-EGF-CTF en la proliferación de células de cáncer de colon.
Materiales y Métodos
Materiales
TPA se adquirió de la célula tecnología de señalización (Berverly, MA, EE.UU.). Anti-EGFR anticuerpo policlonal, anti-fosfotirosina anticuerpo monoclonal (4G10) y normal IgG se adquirieron de Millipore (Billerica, MA, EE.UU.). El inhibidor de la tirosina quinasa de EGFR AG1478 y el anticuerpo anti-PLZF se adquirieron de Calbiochem (La Jolla, CA, EE.UU.). El candesartán se obtuvo de Takeda Pharmaceutical Company Limited (Osaka, Japón) y telmisartán era una especie dotada de Boehringer Ingelheim (Ingelheim, Alemania). Olmesartán y losartán fueron adquiridos de Daiichi Sankyo Company Limited (Tokio, Japón) y Merck Sharp & amp; Dohme (Whitehouse estación, NJ, EE.UU.), respectivamente. El anti-HB-EGF-CTF anticuerpo policlonal [12] y el inhibidor de metaloproteinasa, KB-R7785 [14], se prepararon. El anticuerpo anti-FLAG M2 monoclonal y el receptor activado por el proliferador de peroxisomas (PPAR) γ antagonista, GW9662 [15], [16], fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.).
Preparación plásmido
Un plásmido que codifica la bandera de etiquetado PLZF se generó subclonando el ADNc y secuencia FLAG PLZF humana en pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Los plásmidos para la expresión recombinante de derivados de PLZF marcado con FLAG, EGFR GST fusionado ligandos-CTF, y CFP (proteína fluoresceína cian)-etiquetados PLZF se prepararon [12]. dedos de zinc (ZnF) 5-8, y, EGFR-CTF se clonaron en pGEX6P-1 (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido).
Cell Cultura y
líneas celulares de cáncer de colon humano, HT29 y HCT116 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, EE.UU.), se cultivaron con McCoy's5A (Sigma), CaCo2 (American Type Culture Collection) se cultivaron con medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal 20% ( FBS). Y SW480 (American Type Culture Collection) fue DMEM cultivaron con 10% de FBS. Las células HT1080 y queratinocitos humanos primarios se cultivaron [12], [17].
GST pull-down de ensayo
GST y GST-fundido proHB-EGF-CTF, GST-factor de crecimiento transformante α (TGF-α) -CTF, GST-anfirregulina (AR) -CTF, y GST-epirregulina (EPR) -CTF se prepararon [12]. Después de la unión de GST y GST-EGFR ligandos-CTF a las perlas de glutatión sefarosa, los lisados que contienen varios derivados de PLZF marcado con FLAG se incubaron con 20 l de perlas durante 2 horas a 4 ° C. Después del lavado, las proteínas unidas se analizaron con inmunotransferencia utilizando un anticuerpo anti-FLAG.
Surface Plasmon Resonance (SPR) Espectroscopia
Un núcleo BIA S51 SPR System® (GE Asistencia sanitaria) se utilizó para cualitativa y cuantitativamente analizar las interacciones entre los cuatro inmovilizado EGFR-ligando-FASC (es decir, HB-EGF-CTF, TGF-α-CTF, AR-CTF, y EPR-CTF) y GST-Zn 5-8 de PLZF, que eran medido en unidades de resonancia (RU). El recombinante de biotina-EGFR ligando-FASC (Peptide Institute, Inc., Osaka, Japón) se inmovilizaron individualmente (~ 1000 RU) a través de acoplamiento de grupo amino en estreptavidina (SA) chips de certificados. Varios concentración de GST-Zn5-8 se añadieron en funcionamiento tampón HEPES (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,005% tensioactivo P20) a una velocidad de flujo de 30 l /min durante 2 min. Las pastillas de sensores se disociaron por una inyección de 30-sec de 10 mM de glicina-HCl, pH 1,5. Los sensogramas se analizaron con el software de evaluación BIA (versión 4.1; BIAcore). Las constantes de disociación de equilibrio ( 'constante de unión'; KD) de cada reacción se calcula dividiendo las velocidades de disociación ( 'tasa de descuento'; kd) por las velocidades de asociación ( 'sobre la tasa'; ka) (es decir, Kd = kd /ka) .
Imagen de proteínas de fusión de la PPC y la cuantificación de las fracciones celulares con nucleares localizados PPC-PLZF
células HT1080 transfectadas transitoriamente, y HT1080 estable /HB-EGF, HT1080 /TGF-α, HT1080 /AR, y células HT1080 /EPR se cultivaron durante 24 h y luego se pretrataron las células con 10 mM KB-R7785 en un medio libre de suero durante 30 min. Las células fueron incubadas en medio libre de suero con 100 nM TPA durante 1 h. localización subcelular de la proteína de fusión PPC fue examinada bajo un microscopio de epifluorescencia (Eclipse TE3000, Nikon, Tokio, Japón) [12].
AlphaScreen Ensayos
Un Alphascreen System® (PerkinElmer, Shelton, CT , EE.UU.) se utilizó para seleccionar una biblioteca de 9000 compuestos químicos (Carna Bioscience Inc., Kobe, Japón) cyclopaedically para su eficacia en el bloqueo de la interacción entre biotina-EGFR ligandos-CTF y GST-Zn5-8 de PLZF. 5 l de 1,25 mg /ml recombinante GST-ZnF5-8 se incubó con 2,5 l de 1,25 mg de biotina-EGFR /mL ligandos-CTF de 30 min, y 2,5 l de anticuerpo anti-GST se añadió (1,8 g /ml) durante durante 1 h. A continuación, 5 l de donantes recubierta con estreptavidina y anti-GST IgG perlas aceptor conjugado (01:01 mezcla) se incubaron durante 2 h en la oscuridad. señales AlphaScreen (cuentas por segundo) se analizaron con un lector de microplacas EnVision (Perkin-Elmer). Los ensayos se llevaron a cabo a 23 ° C en tampón que contenía HEPES 25 mM, MgCl 1 mM
2, NaCl 20 mM, pH 7,4, 0,1% de BSA.
Ensayo de proliferación celular (CCK-8 Kit de ensayo)
Un Recuento celular KIT8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japón) se utilizó para determinar la proliferación celular. Brevemente, 2 × 10
5 células por pocillo se cultivaron en placas de cultivo de 96 pocillos con 10% de FBS durante 24 h. A continuación, FBS se reemplazó con medio libre de suero durante 72 h con o sin 30 mM de los compuestos 12 candidatos y telmisartan o candesartán (0,3, 3 y 30 mM), y 30 mM de GW9662 durante la estimulación con 100 nM de TPA. 10 l de solución de CCK-8 a continuación, se añadió a cada pocillo, y se incubó a 37 ° C durante 2 h adicionales. La densidad óptica (DO) se examinó en una longitud de onda de 450 nm.
Supervisión Crecimientos celulares individuales
Las células se sembraron a una densidad de 5 × 10
2 células por 10 cm de un plato en el día 0 en FBS medio de crecimiento normal 10%. Después de 24 h (el día 1), las células aisladas y bastante morfológicamente sanos fueron marcados con el microscopio de contraste de fase. El medio se reemplazó con 5% de medio FBS (control) con o sin 100 nM de TPA, 10 M de KB-R7785, 100 nM de AG1478, 30 M de telmisartán y candesartan, y 50 ng /ml de recombinante HB-EGF ( Sigma). El medio se cambió cada 48 h con medio fresco. La morfología celular y los recuentos se anotó cada 24 h [18].
microscopía de inmunofluorescencia
Las células que formaban una colonia se cambiaron a medio libre de suero durante 48 h y después se incubó durante 60 min en 5 % de medio FBS condicionados con o sin 10 mM de KB-R7785, 100 nM de AG1478, 50 ng /ml de recombinante HB-EGF, 30 M de telmisartán, y 30 M de candesartán. Posteriormente, las células fueron tratadas con 100 nM de TPA durante 90 min, y después se fijaron con etanol y acetona. La localización subcelular de HB-EGF-CTF y PLZF se analizó con inmunofluorescencia. Se utilizaron anticuerpos primarios contra HB-EGF-CTF o PLZF. Los anticuerpos secundarios fueron Alexa Fluor 594 de IgG anti-conejo o Alexa Fluor anti-IgG de ratón (Invitrogen). Las imágenes se obtuvieron en una fluorescencia 80i microscopio Eclipse (Nikon).
inmunoprecipitación y Western Blotting
Las células en un estado subconfluentes se cambiaron a medio libre de suero durante 48 h y se trataron con TPA en el los tiempos indicados. Telmisartan y candesartan se añadieron a las células durante 60 min, antes de los estímulos. Las células se lisaron con tampón de lisis, y se recogieron y se incubaron con 1 g de humano anti-EGFR o anti-HB-EGF-CTF-anticuerpos policlonales durante 2 horas a 4 ° C con rotación de extremo a extremo sobrenadantes. Se llevaron a cabo la inmunoprecipitación y transferencia Western [11]. Los anticuerpos primarios utilizados fueron 4G10 o anti-PLZF, y anti-HB-EGF-CTF. Los anticuerpos secundarios utilizados fueron anti-IgG de ratón-HRP vinculado o anticuerpos ligados a HRP anti-IgG de conejo (Cell Signaling Technology). Las membranas se desarrollaron en un sistema de detección de transferencia Western ECL (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Inglaterra).
Cómo silenciar la angiotensina II tipo 1 receptor (AT1R) y ADAM12
Las células fueron transfectadas con 30 mM de AT1R y siRNAs scramble (Santa Cruz, Delaware, CA, EE.UU.), y con 10 M de ADAM12 y siRNAs scramble (Invitrogen) utilizando el reactivo lipofectamina (Invitrogen). 72 h después se transfectaron células, la expresión de AT1R y ADAM12 (Santa Cruz Biotechnology) se analizaron por Western Blot.
Estadísticas
Los datos se expresan como media ± SEM. El análisis de varianza de una vía y prueba de procedimiento de comparación múltiple de Turquía-Kramer se utilizaron para determinar diferencias estadísticamente significativas (P & lt; 0,05)
Resultados
Dual vías de señalización del EGFR fosforilación y HB-EGF C. Fragmento-terminal durante la translocación nuclear de proliferación celular (Citado de Nº de ref [19] y de modificación.)
12
O
-tetradecanoylphorbor-13-acetato (TPA) de crecimiento epidérmico receptor del factor inducido (EGFR) de transactivación a través de una desintegrina y metaloproteinasa (ADAM) - escindido del factor de crecimiento similar a EGF de unión a proheparin-(proHB-EGF) y regula la proliferación celular [10]. En paralelo, los fragmentos carboxi-terminales (CTF) de proHB-EGF (HB-EGF-CTF) translocan en la membrana nuclear interna, posteriormente ejercen sobre la regulación de la proliferación celular mediante la proteína nuclear dedo leucemia de zinc promielocítica (PLZF) de unión, una represor transcripcional, provocando con ello su exportación nuclear (Fig. 1) [19].
Citado de [19] y modificar. TPA induce una escisión ADAM-mediada de proHB-EGF, y los resultados en el derramamiento ectodominio de su fragmento N-terminal y la generación de un fragmento C-terminal intracelular (CTF). La soluble HB-EGF se une al EGFR e induce una fosforilación transitoria rápida de EGFR. Esta fosforilación da como resultado la transcripción de diversos genes. Mientras tanto, el HB-EGF-CTF se transloca en el núcleo, en el que posteriormente induce la exportación nuclear de PLZF. Esto resulta en la progresión de ciclo celular. Los bloques potentes inhibidores de la translocación nuclear de HB-EGF-CTF. P indica la fosforilación. Abreviaturas: EGFR; de crecimiento epidérmico receptor del factor, TPA; 12-
O
-tetradecanoilforbol-13-acetato, PKC; proteína quinasa Cδ, ADAM; una desintegrina y metaloproteinasa, HB-EGF; heparina vinculante del factor de crecimiento similar a EGF, CTF; fragmento C-terminal, MAPK; activada por mitógenos proteína quinasa, PLZF; leucemia promielocítica dedo de zinc.
La hipótesis de que la inhibición de la translocación nuclear de HB-EGF-CTF podría conducir a una nueva estrategia para la prevención de la proliferación celular durante el desarrollo del cáncer de colon.
Sin embargo, actualmente no hay evidencia de candidatos potentes que bloquean específicamente la señalización translocación nuclear de HB-EGF-CTF.
el CTF de ligandos de EGFR interactuado con la parte específica del PLZF (ZnF5-8), se utilizó la célula HT1080 Dado que las células HT1080 líneas expresan pequeños endógenos precursores HB-EGF, y son útiles para analizar los puntos de unión entre HB-EGF-CTF y PLZF y exportación nuclear de PLZF después de que sobreexpresan precursores HB-EGF y derivados PLZF [12]. En primer lugar, la certificación de la interacción entre los dominios citoplasmáticos de los ligandos de EGFR y PLZF en células HT1080 que expresan los cuatro proEGFR ligandos y PLZF antes de cribado de los candidatos potentes. Dado que PLZF coimmunoprecipitates con un anticuerpo contra la CTF de proHB-EGF en las células HT1080 que sobreexpresan proHB-EGF y la bandera de etiquetado PLZF [12], un coimmunoprecipitation de PLZF se realizó con anticuerpos contra el CTF de los cuatro ligandos de EGFR (HB-EGF , TGF-α, AR, EPR), en células HT1080. El gen PLZF longitud completa marcado con FLAG se transfectadas transitoriamente en células que expresan de forma estable proHB-EGF, proTGF-α, PROAR o proEPR (Fig. 2A). PLZF se expresó en estas células (Fig. 2B, carril 1). Después de la estimulación TPA durante 1 h, la proteína PLZF bandera de etiquetado que inmunoprecipitó con cada anticuerpo se detectó por inmunotransferencia con un anticuerpo anti-FLAG (Figura 2B, carril 2)
.
(A) Esquema de la bandera de etiquetado PLZF longitud completa que consta de FLAG, CEL, Centro y nueve ZnFs. células (B) HT1080 que expresan de forma estable pro-HB-EGF, pro-TGF-α, pro-AR y pro-EPR fueron transfectadas transitoriamente con un vector de expresión que codifica PLZF bandera de etiquetado. expresión de la proteína PLZF de lisados de células (carril 1), así como, las células tratadas con 100 nM TPA durante 1 h, y se sondearon con anticuerpos anti-FLAG siguiente inmunoprecipitación con anti-EGFR ligandos de CTF anticuerpos (lane2) y un conejo anti-normal de IgG (lane3). (C) GST desplegable de ensayo. Los lisados celulares que contienen derivados de PLZF marcado con FLAG se incubaron con GST (carril 2), GST-HB-EGF-CTF (carril 3), GST-TGF-α-CTF (Lane4), GST-AR-CTF (carril 5), y GST-EPR-CTF (carril 6) los granos para las 2 h, y las proteínas unidas se detectaron mediante inmunotransferencia con un anticuerpo anti-FLAG. (D) Esquema de los derivados PLZF bandera de etiquetado. Las propiedades de unión de los derivados PLZF a GST-con fusibles HB-EGF-CTF, TGF-α-CTF, CTF y AR-EPR-CTF GST en un desplegable ensayo, que se resumen en los carriles de la derecha de cada estructura. propiedades de unión se basan en la estimación de la intensidad de la banda con son en relación con la banda de control y indican mediante ++ (& gt; 50%), + (50-10%), y - (& lt; 10%)
.
a continuación, se determinó las regiones de unión de PLZF a los dominios citoplásmicos de ligandos pro-EGFR en HT1080 en el ensayo GST pull-down. Un ensayo de pull-down GST mostró la interacción entre el ligando de EGFR-FASC y ZnF 5-8 de PLZF. Cada CTF GST fusionada recombinante (GST-CTF) bajó PLZF etiquetada con FLAG igualmente en lisados celulares preparados a partir de células HT1080 que expresan la bandera de etiquetado PLZF (Fig. 2C, el panel 1). Además, investigó las regiones de unión de la FFC en PLZF. Se prepararon varios derivados PLZF bandera de etiquetado (Fig. 2D) e incubadas con recombinante GST-EGFR ligando-FFC. La región entera dedo de zinc (ZnF1-9) y ZnF5-8 fueron derribadas por igual por GST-TGF-α-CTF, GST-AR-CTF y GST-EPR-CTF, así como HB-EGF-CTF, pero no GST solo (Fig. 2C, los paneles 3 y 4). Ninguno de los cuatro GST-FASC bajó el mutante de deleción que carecen de una región de dedo de zinc (BTB + Center) (Fig. 2C, panel 2). a continuación, hemos probado si los mutantes de deleción de ZnF6-7 (PLZF /ΔZnF6-7) y ZnF5-8 (PLZF /ΔZnF5-8) se unen a la GST-FFC. La supresión de ZnF6-7 abrogó la unión de PLZF a GST-TGF-α-CTF y GST-HB-EGF-CTF, lo que sugiere que el TGF-α-CTF y HB-EGF-CTF interactúan con PLZF través ZnF6-7. Por el contrario, PLZF /ΔZF6-7 obligado débilmente a GST-AR-CTF y GST-EPR-CTF (Fig. 2C, el panel 5). Por último, hemos probado si ZF5-8 es una región crítica para interactuar con AR-CTF o EPR-CTF. PLZF /ΔZnF5-8 obligado ninguno de los GST-CTF (Fig. 2C, el panel 6). Estos datos sugieren que la región ZnF5-8 es crítico para las interacciones entre PLZF y la FFC.
débil afinidad de unión de HB-EGF-CTF y PLZF era importante para la exportación nuclear de PLZF
Para aclarar aún más si los cuatro FFC interactúan directamente con PLZF, se analizó la unión entre la FFC y ZnF5-8 marcada con GST recombinante (GST-ZnF5-8) utilizando un sistema de SPR. GST-ZnF5-8 atado con inmovilizada biotina-AR-CTF y biotina-EPR-CTF (Fig. 3A) a una concentración de 0,03 a 1,0 mM. El
K
D para la interacción entre GST-ZnF5-8 y biotina-AR-CTF fue de 76,5 nM, y para GST-ZnF5-8 y biotina-EPR-CTF fue de 146 nM (Tabla 1 ). Por el contrario, el
K
valor D para la interacción entre GST-ZnF5-8 y biotina-HB-EGF-CTF no fue calculado debido a su disociación rápida. La señal de unión de GST-ZnF5-8 a inmovilizada-TGF-α-biotina CTF se observó, pero era menor que la de la biotina-AR-CTF o biotina-EPR-CTF. Por lo tanto, la constante de disociación no se pudo calcular debido a la ausencia de la unión de GST-ZF5-8 a una concentración de ≤0.5 mu M y la interferencia con los residuos SH libres de las siete cisteínas en TGF-α-CTF (Fig dependiente de la dosis . 3A).
(A) la interacción directa entre EGFR-ligando-CTF y PLZF (GST-etiquetados-ZnF5-8) con el sistema de SPR. La biotina-EGFR ligando-FASC recombinante se inmovilizaron individualmente, por chips sensores SA. a continuación, GST-Zn5-8 con concentraciones que van de 0,03 a 1,0 M se inyectaron con tampón a 25 ° C y un caudal de 30 l /min durante 2 min en funcionamiento. (B) La expresión vector de codificación PPC-PLZF fue co-transfectaron en células HT1080 de tipo salvaje y las células HT1080 que expresan establemente o bien proHB-EGF, proTGF-α, PROAR o proEPR. Las células se cultivaron durante 24 h y luego se tratan previamente en medio libre de suero con KB-R7785. Las células se trataron a continuación, en el medio condicionado libre de suero con TPA, y se observó la localización subcelular de la proteína de fusión de la PPC. Para determinar el porcentaje de células (promedio ± SD) que demuestran la localización nuclear de CFP-PLZF, se contaron las células en al menos dos transfecciones, y se examinaron al menos 200 células que expresan CFP-PLZF en cada experimento. * P & lt; 0,05 para el efecto de estímulo durante el tratamiento TPA vs. ningún tratamiento, y ** P & lt; 0,05 para el efecto inhibidor durante el tratamiento KB-R7785 vs. tratamiento con TPA. (C) Un diagrama esquemático del sistema de alto rendimiento Alphascreen. Tras la excitación a 680 nm, el oxígeno del ambiente se convierte a oxígeno singlete (
1O
2) por un fotosensibilizador presente en las perlas de donantes. Si las perlas aceptoras están en estrecha proximidad (& lt; 200 nm),
1O
2 transfiere su energía a tioxeno derivados presentes en las perlas aceptoras que conducen a emisión de luz a 520-620 nm. Un complejo se compone de esferas donantes recubiertas con estreptavidina y biotina-EGFR ligandos CTF. Otra consiste en perlas aceptoras de anticuerpo conjugado anti-GST y GST-ZF5-8. Si se produce la asociación entre el ligando de EGFR-CTF y ZnF5-8, las perlas son lo suficientemente cerca como para permitir la detección de una señal. Cualquier inhibidores de esta interacción aumentarían la distancia entre los talones, y la señal se pierde. (D) las señales AlphaScreen de GST o GST-Zn5-8 incubaron con varias concentraciones de biotina-HB-EGF-CTF. (E) las señales AlphaScreen de biotina-HB-EGF-CTF incubaron con varias concentraciones de GST o GST-Zn5-8. (E) Las capacidades de unión de HB-EGF, TGF-α, anfirregulina (AR), y epirregulina (EPR), que PLZF con sistema de Alphascreen.
A continuación, para aclarar las exportaciones nucleares de PLZF provocada por el derramamiento TPA-inducible de ligandos de EGFR, la localización subcelular de la proteína PLZF se examinó durante la translocación intracelular de los cuatro FASC. El vector de expresión que codifica CFP-PLZF se transfectó en células HT1080 y las células HT1080 transfectadas de forma estable que expresan proHB-EGF, proTGF-α, PROAR o proEPR. Se sabe que las células de tipo salvaje HT1080 expresan constitutivamente menos HB-EGF y por lo tanto, no se observó la translocación nuclear de HB-EGF-CTF [14]. CFP-PLZF se localizó predominantemente en el núcleo de las células HT1080 y en los cuatro transfectantes. tratamiento con TPA durante 1 h indujo una distribución de CFP-PLZF en todo el citoplasma de HT1080 /HB-EGF, HT1080 /TGF-α, y las células de EPR HT1080 /. Sin embargo, TPA no alteró la localización subcelular de CFP-PLZF en HT1080 y células HT1080 /AR. Las proporciones de PPC-PLZF de localización en el núcleo después del derramamiento TPA-inducible fueron significativamente más bajos en HT1080 /HB-EGF, HT1080 /TGF-α y células HT1080 /EPR (Fig. 3B). Pre-tratamiento con 10 mM de KB-R7785, un inhibidor de metaloproteinasa, abrogó efectivamente la frecuencia de CFP-PLZF exportación nuclear después de la estimulación TPA en HT1080 /HB-EGF, HT1080 /TGF-α y células HT1080 /EPR (Fig. 3B) . Curiosamente, la frecuencia de la exportación nuclear de PLZF está inversamente correlacionada con su afinidad. Estos resultados indican que la afinidad de la interacción CTF-PLZF afecta a la localización intracelular y la función de PLZF.
selección de alto rendimiento sistema de ensayo para los inhibidores que bloquean la interacción entre el ZnF5-8 de PLZF y AR- o HB -EGF-CTF medio cerrado 12 candidatos y los BRA Cuatro
un ensayo de cribado de alto rendimiento se ha desarrollado en una AlphaScreen® para la detección de inhibidores que bloquean la interacción entre ZnF5-8 y los FFC. El diseño del ensayo Alphascreen se basa en el hecho de que una señal se puede detectar sólo cuando donante recubierta con estreptavidina y perlas aceptoras de anticuerpo conjugado anti-GST se cierran dentro de una distancia de 200 nm. Las perlas se ponen en estrecha proximidad para esta reacción a través de interacciones específicas de los complejos de ZnF5-8 y FASC acoplados a ellos (Fig. 3C). Concentraciones crecientes de biotina-HB-EGF-CTF dependiente de la dosis aumentó la señal de Alphascreen, cuando se incubaron con GST-ZnF5-8 (Fig. 3D). Las concentraciones crecientes de GST-ZnF5-8 también aumentaron dosis-dependiente de la señal cuando se incubaron con biotina-HB-EGF-CTF (Fig. 3E). Las señales de AlphaScreen para la interacción entre biotina-AR-CTF, biotina-EPR-CTF, biotina-TGF-α-CTF, y biotina-HB-EGF-CTF con GST-ZnF5-8 eran comparables a las afinidades de unión determinadas con SPR sistema (Fig. 3F).
Un análisis con biotina-AR-CTF y GST-Zn5-8 de PLZF pudiera indicar claramente los efectos inhibitorios de los candidatos obtenidos en la interacción de la biotina-AR-CTF con GST-Zn5- 8 de PLZF porque Alphascreen señal de biotina-AR-CTF fue más alta que la biotina-HB-EGF-CTF. Con base en su eficacia de bloqueo de la unión de AR-CTF así como HB-EGF-CTF y para Zn5-8 de PLZF, doce candidatos, incluyendo no.8016, 7701 y 7804 se obtuvieron mediante el cribado de compuestos químicos 9000 (Fig. 4A ). El% de inhibición de 10 M de NO. 8016, 7701 y 7804 sobre la interacción entre la biotina-AR-CTF y GST-Zn5-8 de PLZF fueron 30,4, 60,5 y 49,9, respectivamente. El efecto inhibidor de no.8016 compuesto en la interacción no fue la más alta (Tabla 2). Sin embargo, No.8016 inhibió la proliferación celular más fuerte entre doce candidatos en ensayo de proliferación celular (Fig. 4B). Con base en los resultados de la proliferación celular, se seleccionaron no. 8016 como candidato. La media máxima concentración inhibitoria (IC
50) obtenido con el compuesto no. 8016 fue de 29,9 M (Fig. 4C).
fórmula estructural del compuesto candidato (a) Doce basado en la eficacia para bloquear la unión de HB-EGF-CTF o AR-CTF a Zn5-8 de PLZF con sistema de Alphascreen. (B) Efectos inhibidores de los doce compuestos candidatos sobre la proliferación celular inducida por TPA en queratinocitos con un ensayo de proliferación celular. 2 × 10
4 células fueron tratadas en el medio acondicionado con o sin los compuestos candidatos doce durante la estimulación TPA, y la absorbancia a 450 nm se determinó cada 12 h hasta 60 h. ** P & lt; 0,05 para los efectos inhibidores durante el tratamiento 12 candidatos vs. tratamiento con TPA. (C, D) Los efectos inhibidores de los candidatos, específicamente no.8016 compuesto y telmisartán, en la unión de AR-CTF de PLZF. Parcelas con el porcentaje de inhibición frente a diversas concentraciones de compuesto no.8016 y telmisartán se presenta con los IC
50 valores observados por el sistema Alphascreen. (E) Efectos inhibidores de los tres candidatos ARB sobre la unión de AR-CTF de PLZF. Parcelas con el porcentaje de inhibición frente a diversas concentraciones de cada inhibidor y la inhibición presentados con IC
50 valores.
continuación, se centró en la fórmula estructural específica del tetrazol bifenilo en el compuesto candidato , y se seleccionan además compuestos químicos, incluyendo los ARA II (es decir, telmisartán, candesartán, olmesartán, y losartán). Sobre la base de la eficacia de bloqueo de la unión de AR-CTF para PLZF, la IC
fueron 27,8, 21,9, 87,7 y 28,4 mM, respectivamente, y su fórmula estructural química se muestran 50 de telmisartan, candesartan, olmesartán, y losartan ( La Fig. 4D y e). Estos hallazgos sugieren que el telmisartán y candesartán son candidatos satisfactorios en el bloqueo de ambos HB-EGF-CTF y AR-CTF de la interacción con PLZF.
No.8016 de compuestos candidatos Doce y Telmisartán inhibió la proliferación celular
células de queratinocitos tienen una gran cantidad de precursores endógenos HB-EGF, y son útiles para analizar la proliferación celular a través de la señalización de HB-EGF-CTF. Se utilizaron las líneas de células HT1080 cuando los inhibidores fueron seleccionados [17]. Para examinar si los compuestos candidatos que bloqueaban la interacción entre la FFC y PLZF también inhibe la proliferación celular, se probaron los efectos inhibitorios de estos doce candidatos y cuatro (AT1R) bloqueadores de la angiotensina II tipo 1 del receptor (BRA) sobre la proliferación celular inducida por TPA de queratinocitos con un ensayo de proliferación celular. Las células fueron tratadas en medios acondicionados con o sin 30 mM de los compuestos candidatos doce y 30 M de los ARA para un máximo de 60 h en presencia de TPA, y la absorbancia se midió cada 12 h. Se encontraron no.8016 Compuesto y telmisartan para inhibir la proliferación celular (Fig. 4B, 5B y D). Además, los valores de absorbancia se recuperaron gradualmente los de los niveles inducidos por TPA (es decir, sin no.8016 compuesto y telmisartan), cuando se lavaron las células 12 h después de la incubación con compuesto no.8016 y telmisartan (Fig. 5A y C).
(AD) efectos inhibidores de los no.8016 compuesto (a) y cuatro ARA II (B) sobre la proliferación celular inducida por TPA en queratinocitos con un ensayo de proliferación celular. 2 × 10
4 células fueron tratadas en medios acondicionados con o sin la no.8016 o cuatro ARA II durante la estimulación TPA, y la absorbancia a 450 nm se determinó cada 12 h hasta 60 h. (A, C) Inhibición de la proliferación celular con no.8016 y telmisartan se verificó después de un lavado a 12 h. También se observaron (D) Las células con el microscopio.