Extracto
El cáncer de pulmón es la neoplasia más frecuente y la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo. Mientras que fumar es, con mucho, la principal causa de cáncer de pulmón, otros factores ambientales y genéticos influyen en el desarrollo y progresión del cáncer. Dado que los patrones mutaciones únicas se han observado en las muestras de cáncer individuales, la identificación y caracterización del cáncer de pulmón distintivo perfil molecular es esencial para el desarrollo de terapias más eficaces adaptados. Hasta hace poco, la secuenciación del ADN personalizada para identificar mutaciones genéticas en el cáncer era poco práctico y caro. Los avances tecnológicos recientes en la secuenciación del ADN de próxima generación, como la plataforma de secuenciación Ion Torrent a base de semiconductores, ha hecho que el precio de la secuenciación del ADN y el tiempo eficaz con resultados más fiables. Usando el Torrent Cancer Panel Ampliseq Ion, secuenciado 737 loci de 45 genes relacionados con el cáncer para identificar las mutaciones genéticas en 76 muestras de cáncer de pulmón humano. El análisis de la secuencia reveló mutaciones sin sentido en KRAS, EGFR, y los genes TP53 en las muestras de cáncer de mama de diversos tipos histológicos. Por lo tanto, este estudio demuestra la necesidad de secuenciar los cánceres humanos individuales con el fin de desarrollar fármacos personalizados o terapias de combinación para hacer frente eficazmente individuo, las mutaciones específicas del cáncer de mama
Visto:. Cai X, J Sheng, Tang C, Nandakumar V, de Ye H, Ji H, et al. (2014) Las mutaciones más frecuentes en los genes EGFR, KRAS y TP53 en tumores de cáncer de pulmón humano detectados por Ion Torrent secuenciación de ADN. PLoS ONE 9 (4): e95228. doi: 10.1371 /journal.pone.0095228
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 25 Julio, 2013; Aceptado: March 25, 2014; Publicado: 23 Abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Cai et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación recibió el apoyo de las becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, la Fundación Wu Jieping, y el Instituto Nacional de Salud (R01 CA90427 & amp; R01 AI084811 a Chen SY). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Chuanning Tang, Hua Ye, Feng Lou, Dandan Zhang, Sun Hong, Haichao Dong , Guangchun Zhang, Liu Zhiyuan, Zhishou Dong, Baishuai Guo, He Yan, Chaowei Yan, Wang Lum, Ziyi Su, y Yangyang Li son empleados de Valle de San Biotechnology, Inc Esto no altera la adhesión de los autores a toda la PLoS One políticas en materia de datos y materiales de uso compartido.
Introducción
el cáncer de pulmón es la neoplasia maligna más común en todo el mundo, y también la principal causa de muertes relacionadas con el cáncer. En 2008, se registró una estimación de 1,61 millones de nuevos casos en todo el mundo, que representan el 12,7% de todos los nuevos casos de cáncer [1]. Además, se informó de aproximadamente 1,38 millones de muertes (18,2% del total de muertes de cáncer) en todo el mundo [2]. En China, el cáncer de pulmón tiene la incidencia más alta de todos los nuevos casos de cáncer en los hombres y las mujeres (21,7% en 2008), con más de una tasa de mortalidad del 24,9% [2]. Las mujeres en China registran sólo un poco mayor incidencia de cáncer de pulmón más de cáncer de mama este mismo año; sin embargo, la tasa de mortalidad de cáncer de pulmón es más de 3 veces mayor que el de cáncer de mama (20,2% vs. 6,1%, respectivamente) [2]. El cáncer de pulmón a menudo exhibe síntomas no específicos, y el diagnóstico a menudo se produce en una etapa avanzada o después de la metástasis ya ha ocurrido [3]. Mientras continúan los esfuerzos para mejorar el diagnóstico precoz y tratamiento del cáncer de pulmón, la incidencia de escalonamiento, mal pronóstico, y la tasa de mortalidad considerable prevalece.
La principal causa de cáncer de pulmón es el tabaquismo, y una mayor exposición se correlaciona directamente con una aumento del riesgo de desarrollar cáncer de pulmón [4]. 85-90% de las muertes por cáncer de pulmón están asociados con el tabaquismo, y los fumadores actuales son 15 veces más probabilidades de morir de cáncer de pulmón que los no fumadores [5]. Hay dos formas principales de cáncer de pulmón: cáncer de células no pequeñas de pulmón (NSCLC) y cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC). NSCLC, lo que representa aproximadamente el 85% de todos los cánceres de pulmón, puede ser dividida en tres grandes subtipos histológicos: carcinoma de células escamosas (SCC), el adenocarcinoma y el cáncer de pulmón de células grandes. Mientras que el fumar puede ser atribuido a todas las formas de cáncer de pulmón, que es más comúnmente vinculado con SCLC y SCC. Los no fumadores, por el contrario, son los más comúnmente diagnosticado de adenocarcinoma [3], [5]. Curiosamente, sólo 10 a 24% de los fumadores desarrollan cáncer de pulmón, lo que indica la importancia de otros factores genéticos y ambientales individuales [6], [7]. Aparte de humo de tabaco, otros agentes etiológicos y factores de riesgo han sido identificados, incluida la ocupación, la exposición al humo de segunda mano, el asbesto, el gas radón, y la contaminación del aire, además de los factores genéticos [8] - [10]. Aproximadamente el 10-15% de los cánceres de pulmón se plantea en pacientes que nunca se reportan haber fumado y estos cánceres hacerlo de forma espontánea con una acumulación de cambios genéticos y epigenéticos [5].
A pesar de los esfuerzos en curso para mejorar la detección y tratamiento de cáncer de pulmón tipos de cáncer, el pronóstico de los pacientes con la mayoría de las formas de cáncer de pulmón sigue siendo pobre [3]. Debido a que los factores genéticos y ambientales que causan cáncer de pulmón varían ampliamente, cada tumor tiene el potencial de exhibir un perfil único de mutación genética. Como tal, la evidencia acumulada sugiere que individualizados, terapias adaptadas son esenciales para un tratamiento eficaz contra el cáncer de pulmón. Esto se puede lograr mediante el perfilado del genoma del cáncer de un individuo con el fin de diseccionar los mecanismos oncogénicos que regulan la progresión del cáncer. Recientemente, una nueva tecnología basada en la secuenciación de semiconductores llama Ion Torrent secuenciación [11] está abordando muchos de los problemas asociados con otros métodos de secuenciación, a saber, el costo, el tiempo y la practicidad general de la secuenciación del genoma individualizado. En este estudio, hemos utilizado la secuencia Ion Torrent para analizar 76 muestras de cáncer de pulmón clínicos para identificar las mutaciones genéticas en 737 loci de 45 genes relacionados con el cáncer conocidos.
Resultados
análisis de la mutación del ser humano tumores de cáncer de pulmón con Ion Ampliseq Cancer Panel
Un total de se analizó utilizando Cancer Panel Ion torrent Ampliseq para identificar mutaciones en 737 loci de 45 oncogenes y genes supresores de tumores en el cáncer de pulmón humano 76 muestras de cáncer de pulmón (Tabla 1) . Estas muestras de cáncer de pulmón eran todos de los pacientes chinos que van desde 28-80 años de edad representados por 40 hombres, con una edad media de 62 años y 36 mujeres con una edad media de 59 años.
Los datos secuenciados fueron procesados y mutaciones identificadas utilizando la versión 3.0 Ion torrent Software suite con un plug-in "variante de llamadas". A fin de eliminar la llamada base de error, se utilizaron tres pasos de filtrado para generar llamadas variante fiable como se describe en los Materiales y Métodos. La distribución leer la secuencia a través de 189 amplicones generados a partir de 76 muestras de FFPE se normalizaron a 300 000 lecturas por muestra (Fig. 1). Usando una estricta variante llamada estándar, se identificaron mutaciones en los genes siguientes que se enumeran en la Tabla 1:. BRAF, EGFR, erbB2, KRAS, PIK3CA, PTEN, SMAD4 y TP53
A. Distribución de la cobertura media de cada uno de amplificación. Los datos se muestran como media ± DE. B. Número de amplicones con una profundidad dada leer, ordenados en cajas de 100 lecturas. (Barras azules número actual de amplicones objetivo dentro de la profundidad de lectura, línea roja presenta% del objetivo amplicones & gt; = leen profundidad)
Las muestras fueron clasificados de acuerdo con su origen como adenocarcinoma de pulmón, de células grandes de pulmón. carcinoma, carcinoma de células escamosas de pulmón y carcinoma neuroendocrino del pulmón. Las diferentes etapas de los cánceres han progresado hasta fueron anotados sobre la base de "Comité Americano Conjunto sobre el Cáncer tamaño /tumor, nódulos linfáticos afectados, Metástasis (AJCC /TNM) sistema (Ia, Ib, IIa, IIb, IIIa, IIIb) y como metástasis y no hacen metástasis de cáncer de pulmón. Además, los cánceres fueron clasificados como de los fumadores pesados, ligeros fumadores y no fumadores para comprobar la correlación entre el tabaquismo y la acumulación de estas mutaciones. La lista detallada de mutaciones puntuales sin sentido, inserciones y deleciones perfilado en 737 loci de las muestras de cáncer de pulmón 76 se proporciona en la Tabla S1.
Fuera de las mutaciones identificadas en nuestra muestra, BRAF (2,6%), EGFR (42,1%), erbB2 (1,3%), KRAS (5,3%), PIK3CA (2,6%), PTEN (1,3%), SMAD4 (1,3%), y TP53 (22,4%) se generan las mayores tasas de mutaciones (Tabla 2 ). Las frecuencias de mutación en sus diferentes niveles de diferenciación (Tabla 3), a diferentes estadificación AJCC (Tabla 4), de los cánceres de pulmón metastásico y no metastásico (Tabla 5) y de pacientes con diferentes hábitos de fumar (Tabla 6) se describen en el Mesas. por lo tanto, se realizó un análisis de secuenciación detallada en los exones y los dominios funcionales de estos genes.
distribución mutación sin sentido en los exones y los dominios funcionales de EGFR
de 76 muestras secuenciadas de cáncer de pulmón, el 36,1% de las mutaciones de EGFR fueron sin sentido a lo largo de exón 19, el 50,0% eran de sentido erróneo a lo largo de exón 21, 5.6% a lo largo de exón 20 y el 8,3% a lo largo de exón 18 (Fig. 2A). Estas mutaciones estaban en y alrededor del dominio de tirosina quinasa de EGFR (Fig. 2B-3C). La activación de mutaciones en el dominio tirosina quinasa de la
EGFR
gen estimula la proteína tirosina quinasa, que conduce a la activación de las vías asociadas con el crecimiento celular y la supervivencia de señalización. Las mutaciones en el dominio extracelular de EGFR a menudo se asocia con la amplificación de genes en otros tipos de cáncer [12]. 57,7% de los cánceres de pulmón EGFR asociado son adenocarcinomas (Tabla 2) y el 86,7% de las mutaciones de EGFR asociadas con el cáncer '' alta diferenciación (Tabla 3). En nuestra muestra establecida el 50% de los cánceres de pulmón EGFR asociadas a metástasis en regiones locales, el 27,3% de linfa y el 46,2% de los cánceres con metástasis a órganos distantes en nuestra muestra (Tabla 5).
A. Las frecuencias de las mutaciones detectadas en diferentes exones. distribución B. La mutación en los exones. C. La distribución de mutaciones en los dominios funcionales.
A. Las frecuencias de las mutaciones detectadas en diferentes exones. distribución B. La mutación en los exones. C. La distribución de mutaciones en los dominios funcionales.
distribución mutación sin sentido en los exones y los dominios funcionales del gen KRAS
De 76 muestras secuenciadas cáncer de pulmón, el 100% de las mutaciones KRAS eran sin sentido a lo largo de exón 2 (Fig. 3A). El 34G & gt; T mutaciones dan lugar a una sustitución de aminoácido en la posición 12 en KRAS, de una glicina (G) a una cisteína (C) o una valina (V). El 64C & gt; una mutación da como resultado una sustitución de aminoácido en la posición 22 desde una glutamina (Q) a una lisina (K) en KRAS. Todas estas sustituciones de aminoácidos ocurrido a lo largo del dominio de unión a GTP de KRAS (Fig. 3A-C). KRAS se une a GTP en el estado activo y posee una actividad enzimática intrínseca que escinde el fosfato terminal del nucleótido, la conversión a PIB. Tras la conversión de GTP a GDP, KRAS se apaga [13]. El resultado de estas mutaciones es la activación constitutiva de
KRAS
vías de señalización. Una vez que se enciende, se recluta y activa las proteínas necesarias para la propagación de la señal del factor de crecimiento y otros receptores ", tales como c-Raf y PI3-quinasa [13]. El 7,7% de los cánceres de pulmón asociados-KRAS eran adenocarcinomas (Tabla 2) y el 6,1% de las mutaciones KRAS asociados con el cáncer '' baja diferenciación y el 7,4% de las mutaciones KRAS eran cánceres mediados de diferenciación '' (Tabla 3). En nuestra muestra establecida 6,3% de los cánceres de pulmón asociado KRAS-metástasis en regiones locales, el 9,1% de linfa y el 5,1% de los cánceres con metástasis a órganos distantes en nuestro conjunto de la muestra (Tabla 5).
distribución mutación sin sentido en el exones y los dominios funcionales de TP53
la anormalidad del gen TP53 es uno de los acontecimientos más significativos de los cánceres de pulmón y juega un papel importante en el proceso tumoral de las células epiteliales del pulmón. El gen supresor de tumores p53 se encuentra en el cromosoma 17p13 y se extiende por el ADN genómico 20 kb que abarca 11 exones que codifica para una fosfoproteína 53KD [14]. La mayoría de las mutaciones TP53 se agrupan en el dominio de unión a ADN TP53, que abarca los exones 5 a 8 y se extiende por aproximadamente 180 codones o 540 nucleótidos y no se limita a unas pocas secuencias o codones particulares a lo largo de este gen [15]. TP53 incurrió en varias mutaciones deletéreas en nuestra muestra de 76 cánceres de pulmón, sobre todo a lo largo del dominio de unión a ADN codificado desde el exón 5 (27,8%), 6 (16,7%), 7 (33,3%), 8 (16,7%), ya lo largo de el dominio de oligomerización codificada desde el exón 10 (15,6%) (Fig. 4A-C). La mayoría de las mutaciones TP53 missense conducen a la síntesis de una proteína estable, que carece de su función de unión a ADN y de transactivación específico y se acumula en el núcleo de las células. Tales proteínas mutantes se vuelven inactivos y carecen de la capacidad de los transactivate los genes diana que regulan el ciclo celular y la apoptosis [16]. Aparte de estas mutaciones que afectan a la función de los TP53 como una proteína supresora de tumores, las mutaciones de TP53 también dotan a la proteína mutante con las actividades de ganancia de función "(GOF), lo que puede contribuir activamente a diversas etapas de la progresión del tumor, incluyendo metástasis a distancia , y al aumento de la resistencia a los tratamientos contra el cáncer [17] - [19]. 50,0% de los cánceres de pulmón asociados-TP53 fueron carcinoma de células escamosas (Tabla 2) y el 20,0% de las mutaciones de TP53 asociados con el cáncer '' alta diferenciación y el 25,9% de las mutaciones de TP53 fueron cánceres mediados de diferenciación '' (Tabla 3). En nuestra muestra establecida 25,0% de los cánceres de pulmón asociados-TP53 metástasis en regiones locales, el 54,5% de linfa y el 12,8% de los cánceres con metástasis a órganos distantes en nuestra muestra (Tabla 5).
A. Las frecuencias de las mutaciones detectadas en diferentes exones. distribución B. La mutación en los exones. C. La distribución de mutaciones en los dominios funcionales.
Las mutaciones múltiples y los puntos calientes de mutación en los cánceres de pulmón humanos
El éxito clínico con la terapia de combinación individualizada se basa en la identificación de combinaciones de mutaciones y las pautas de co -Administración de un único o combinación de agentes diana contra las combinaciones de mutaciones detectadas. Algunas de las mutaciones detectadas en nuestro grupo tumor a través de análisis de secuenciación no sólo eran recurrente y frecuente, pero también se produjo en combinación con otras mutaciones. Los cánceres de pulmón en nuestro conjunto de muestras contenían lo siguiente: el 64,5% de las muestras tenían al menos una o más mutaciones sin sentido, el 19,7% tenía al menos dos o más mutaciones sin sentido, 3,9% había por lo menos tres o más mutaciones sin sentido, 1.3% tienen al menos cuatro o más mutaciones sin sentido, y el 35,5% de las muestras no incurrió en mutaciones deletéreas en cualquiera de los loci examinados 13.500 del supresor de tumores potencial y oncogenes (Tabla 7).
Discusión
como el cáncer de pulmón es el cáncer más frecuente y la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo, los esfuerzos en curso están orientados a mejorar la prevención, el diagnóstico y las opciones de tratamiento eficaces para los pacientes con cáncer de pulmón. Actualmente hay una gran variedad de opciones de tratamiento para pacientes con cáncer de pulmón, la cirugía es el más eficaz para el tratamiento del NSCLC, y la quimioterapia con o sin terapia de radiación como el tratamiento estándar para SCLCs. Debido a que la mayoría de SCLCs metástasis temprana a órganos distantes, la cirugía es a menudo ineficaz para curar este cáncer. NSCLC, por el contrario, son más propensos a permanecer localizado durante el desarrollo, y son por lo tanto son tratados de manera más eficaz con una intervención quirúrgica. Además, SCLCs son típicamente mucho más sensible a la quimioterapia y /o radioterapia que son NSCLC [20], [21]. Uno de los retos en la clasificación y tratamiento del cáncer de pulmón adecuada es la extrema heterogeneidad causada por diferentes propiedades genéticas, biológicas y clínicas, incluyendo la respuesta al tratamiento, con más de 50 variantes histológicas reconocidas por el sistema de tipificación de la OMS [22], [23]. Debido a esto, la clasificación correcta de los casos de cáncer de pulmón es necesario para asegurar que los pacientes reciben una gestión óptima [24].
Debido a de estos diversos niveles de heterogeneidad, los tratamientos generalizados pueden ser menos eficaces. Alternativamente la terapia dirigida, que implica el uso de medicamentos especialmente diseñados para atacar selectivamente vías moleculares correlacionadas con el fenotipo maligno de las células de cáncer de pulmón, puede ser más útil [25]. Varios genes que se encuentran comúnmente mutado en varios tipos de cáncer de pulmón se ha informado, incluyendo ALK /ELM4 fusión, K
ras
, EGFR, VEGF, y p53, sin embargo, todo el perfil genético de cada forma está todavía no se ha completamente definido [3]. Esto indica la necesidad de los cánceres de pulmón humanos secuenciación individuales con el fin de que coincida con el uso de un único fármaco dirigido o dos o más fármacos en combinación dirigidos contra las mutaciones específicas del cáncer de pulmón individual. En este estudio hemos utilizado Ion Cancer Panel Ampliseq para secuenciar 13.500 loci en 45 genes relacionados con el cáncer, principalmente de los oncogenes y genes supresores de tumores, de 76 muestras de cáncer de pulmón humano. Se identificaron mutaciones frecuentes en un grupo de genes, incluyendo EGFR, KRAS, y TP53 (Tabla 2). Aunque la mayoría de estos genes ya eran conocidos por estar asociados con los cánceres de pulmón, los puntos mutadas y las mutaciones en otros genes asociados eran diferentes en nuestra muestra (Tablas 7).
A medida que cada vez hay más conciencia sobre los cambios en células de cáncer de pulmón en los últimos tiempos, los nuevos fármacos que se dirigen específicamente a estos cambios se han desarrollado. Estos medicamentos dirigidos ya sea trabajan sinérgicamente con los medicamentos de quimioterapia o por sí mismos con mucha menor toxicidad debido a un efecto selectivo como una alternativa a una modulación más sistémica de proteínas asociadas con la oncogénesis. inhibidores de EGFR (Afatinib, Erlotinib, y Gefitinib) e inhibidores de VEGF (bevacizumab) se utilizan actualmente para terapias diana para los pacientes con CPNM con mutaciones en el VEGF y EGFR [26]. Erlotinib es un medicamento que bloquea la señalización del EGFR de la célula para crecer. Se evita la progresión del cáncer de pulmón, específicamente en las mujeres no fumadoras, y se utiliza sobre todo en el tratamiento del NSCLC avanzado que no era sensible a la quimioterapia. También se utiliza como el primer tratamiento en pacientes cuyos cánceres tienen una mutación en el
EGFR
gen [27]. Cetuximab es un anticuerpo monoclonal que se dirige EGFR que también se utiliza en NSCLC avanzado en combinación con la quimioterapia estándar como parte del tratamiento de primera línea [28]. Al igual que el erlotinib, afatinib es un medicamento que bloquea la señal del crecimiento del EGFR y utilizados para NSCLC avanzado que tienen mutaciones en el
EGFR
de genes [29]. Algunos, los no fumadores más jóvenes con los adenocarcinomas se encuentran para tener un oncogén de fusión /EML4 ALK que actualmente es un objetivo para el fármaco crizotinib [30]. Otros fármacos actualmente utilizados para tratar el cáncer de pulmón no son de genes específicos, y en su lugar se dirigen a las vías generales moleculares como anitmetabolites folato (metotrexato y pemetrexed), inhibidores de la mitosis (docetaxel, piclitaxel, y vinorelbina), inhibidores de la topoisomerasa (Etopophos y topotecan), y los nucleósidos análogos que interfieren con la síntesis de ADN (carboplatino, cisplatino, y gemciabine) [31], [32]. Los inhibidores de EGFR-dirigida tirosina quinasa se establecen para ser una opción de tratamiento eficaz para NSCLC avanzado que no responden a la quimioterapia. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales EGFR-dirigida, en combinación con la quimioterapia de primera línea basada en platino, cetuximab en combinación con cisplatino /vinorelbina y bevacizumab en combinación con quimioterapia basada en platino como resultado una mejor supervivencia en comparación con la quimioterapia sola en pacientes con avanzada EGFR-positivo NSCLC [ ,,,0],33]. Otras terapias dirigidas que incluyen inhibidores duales y multi-quinasa están en las primeras etapas de desarrollo clínico [34].
Con la acumulación de conocimiento y experiencia en tecnologías de próxima generación, es necesario ampliar nuestra comprensión de la sensibilidad de mutaciones específicas a las terapias individualizados. Por lo tanto, la recopilación de un perfil completo de las mutaciones en los cánceres de pulmón para la aplicación de la terapia dirigida personalizada y adaptada es fundamental para el desarrollo de futuros tratamientos contra el cáncer. Creemos que una herramienta de genotipado más rápido y rentable como la tecnología de secuenciación Ion Torrent será muy beneficioso para la asignación de dichos productos terapéuticos específicos en un futuro próximo para utilizar los cánceres de pulmón.
Materiales y Métodos
ética declaración
el estudio ha sido aprobado por el Comité Ético de Investigación humana de la primer hospital Afiliado de la Universidad médica de Dalian, china. Para fijados con formol y embebidos en parafina (FFPE muestras) tumorales desde el banco de tejidos del tumor en el Departamento de Anatomía Patológica del Hospital, el comité de ética institucional renunciado a la necesidad de consentimiento. Todas las muestras y los datos médicos utilizados en este estudio han sido irreversiblemente anónimos.
Información al paciente
Las muestras tumorales utilizados en el estudio se obtuvieron de la Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Dalian, China. Se analizaron un total de 76 muestras tumorales FFPE de pacientes con cáncer de pulmón. La edad media de los 76 pacientes fue de 61 años (rango: 28-80 años). De estos, 40 pacientes eran varones con una edad media de 61 años (rango: 28-80 años), y 36 pacientes eran mujeres con una edad media de 61 (rango: 36-75 años). Las muestras tumorales utilizados en el estudio se obtuvieron de la Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Dalian, China. Se analizaron un total de 76 muestras tumorales FFPE de pacientes con cáncer de pulmón. La edad media de los 76 pacientes fue de 61 años (rango: 28-80 años). De estos, 40 pacientes eran varones con una edad media de 61 años (rango: 28-80 años), y 36 pacientes eran mujeres con una edad media de 61 (rango: 36-75 años). 33 de los 76 pacientes (20 hombres, 13 mujeres) fueron clasificados como de baja diferenciación patológica; 27 (14 hombres, 13 mujeres) a mediados, 15 (6 hombres, 9 mujeres) a alta, y 1 mujer de diferenciación desconocida. AJCC Cancer Staging es la siguiente: 0 pacientes en I o Ia; 18 (10 hombres, 8 mujeres) en la etapa Ib; 3 (2 hombres y 1 mujer) en el estadio IIA; 9 (5 hombres, 4 mujeres) en fase IIb; 26 (14 hombres, 12 mujeres) en estadio IIIa; 8 (4 hombres, 4 mujeres) en estadio IIIb; 0 pacientes en estadio IIIc; y 12 (5 hombres y 7 mujeres) en estadio IV. Del total de 76 pacientes, 16 de los 40 hombres reportaron sin antecedentes de tabaquismo, mientras que ninguna de las 36 mujeres informó de que los fumadores; 6 hombres informaron de fumar luz; 17 hombres reportaron fumar en exceso, y 1 hombre con una historia desconocida de fumar.
preparación de ADN
Se aisló el ADN a partir de muestras FFPE después de deparaffinization y extracción de parafina secciones de espesor 3-5 micras de xileno, utilizando el QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.
Ion torrent PGM preparación de la biblioteca y la secuencia
Una biblioteca de Ion torrent ligado al adaptador se realizó siguiendo el protocolo del fabricante para el Ion AmpliSeq biblioteca Kit 2.0 (Life Technologies) (Parte#4475345 Rev. A). Brevemente, 50 ng amplicones agrupados fueron reparados final, y la ADN ligasa se utilizó para ligar Ion Torrent adaptadores P1 y A. Después de la purificación con cuentas AMPure (Beckman Coulter, Brea, CA, EE.UU.), los productos ligados a adaptadores fueron mella-y PCR-amplificación para un total de 5 ciclos. perlas AMPure (Beckman Coulter) se utilizaron para purificar la biblioteca resultante, y un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) y Agilent BioAnalyzer ADN de alta sensibilidad LabChip (Agilent Technologies) se utilizaron para determinar la concentración y el tamaño de la biblioteca.
emulsión muestra de PCR, rotura de la emulsión, y el enriquecimiento se realizaron utilizando el Ion PGM Kit Plantilla 200 Xpress (parte#4474280 Rev. B), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, una concentración de entrada de una copia de plantilla de ADN /se añadió Ion Esfera Partículas (ISPs) a la emulsión de la mezcla de PCR master y la emulsión generada usando un mezclador IKADT-20 (Life Technologies). A continuación, se recuperaron los ISP y proveedores de Internet plantilla-positivas fueron enriquecidas para su uso con Dynabeads perlas de estreptavidina MyOne C1 (Life Technologies). enriquecimiento ISP se confirmó usando el fluorómetro Qubit 2,0 (Life Technologies). 316 fichas se utilizaron para la secuenciación en el Ion Torrent PGM para 65 ciclos y fueron un código de barras de las muestras. Ion PGM Kit 200 La secuenciación se utiliza para las reacciones de secuenciación, de acuerdo con el protocolo recomendado (parte#4474004 Rev. B). El conjunto de datos se ha depositado en el Archivo Lee NIH secuencia y el número de acceso es SRP028756 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?study=SRP028756).
Variant llamando
los datos de las pistas de PGM se procesaron inicialmente utilizando el software de tubería específica de la plataforma Ion torrent torrent suite para generar la secuencia lee, recortar secuencias adaptadoras, filtrar y eliminar señal pobre perfil lee. variante inicial llamando a partir de los datos de secuenciación Ion AmpliSeq se ha generado utilizando la versión 3.0 Torrent Software Suite con un programa plug-in "variante de llamadas". A fin de eliminar la llamada base de errónea, se utilizaron tres pasos de filtrado para generar llamadas variante final. El primer filtro se fijó en un promedio de profundidad de cobertura total & gt; 100, cada cobertura variante & gt; 20, una frecuencia variante de cada muestra & gt; 5, y el valor de p & lt; 0,01. Con el fin de eliminar el error de llamada base, se utilizaron varios pasos de filtrado para generar la variante de llamada final (Fig. S1.). El primer filtro se fijó en una profundidad media de cobertura total de & gt; 100, una cobertura de cada variante de & gt; 20, una frecuencia de la variante de cada muestra de & gt; 5 y P-valor & lt; 0,01. El segundo filtro fue empleado por mutaciones que examinan visualmente utilizando el software Integrativa Genómica Visor (IGV) (http //www.broadinstitute.org /IGV) o Samtools SAMtools de software de software (http://samtools.sourceforge.net), así como por filtrando los posibles errores específicos de cadena, es decir. una mutación sólo se detectó en cualquiera de los dos "+" o "-" cadena, pero no en ambas hebras de ADN. La tercera etapa de filtrado se estableció como variantes dentro de 727 puntos de acceso, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El último paso del filtro era eliminar variantes en AMPL339432 amplicón (PIK3CA, exon13, chr3: 178938822-178938906), que no es única igualada en el genoma humano. Desde nuestra secuenciación se ejecuta utilizando el Panel de cáncer Ion Ampliseq, datos falsos fueron generados a partir de deleción del locus del gen JAK2 y por lo tanto los datos de secuenciación de este locus se excluyeron del análisis adicional.
Las mutaciones somáticas
Detectado las mutaciones se compararon con las variantes en el Proyecto 1000 Genomas [35] y 6500 exomas del Instituto Nacional del corazón, los Pulmones y la sangre Proyecto de Secuenciación Exoma [36] para distinguir mutaciones somáticas y mutaciones de línea germinal.
bioinformatical y validación experimental aplicadas
Se utilizó el CÓSMICO [37] (versión 64), la base de datos MyCancerGenome (http://www.mycancergenome.org/) y algunas publicaciones para evaluar las mutaciones reaparición en el cáncer de pulmón (Tabla S1). Además, algunas mutaciones sin sentido detectadas fueron confirmadas por secuenciación de Sanger (Fig. S2).
El análisis estadístico
Seleccionamos reaparición de sentido erróneo somática /en-del mutaciones de cáncer de pulmón que se puede hacer el análisis estadístico.
Apoyo a la Información
Figura S1. Filtro proceso Red de variantes. Nota: (a) las variantes Strand-sesgada fueron eliminados usando Integrativa Genómica software de visualización (IGV) (http //www.broadinstitute.org /IGV); (B) variantes en AMPL339432 debe ser eliminado, ya que este amplicón no es única adaptado a PIK3CA en el genoma humano; (C) Todos nuestros análisis estadístico se basó en los datos de la caja azul
doi:. 10.1371 /journal.pone.0095228.s001 gratis (DOCX)
figura S2. validaciones
Sanger de 15 variantes
doi: 10.1371. /journal.pone.0095228.s002 gratis (DOC)
Tabla S1.
Las frecuencias de mutaciones puntuales, mutaciones de inserción y supresión de 737 loci de 76 cánceres de pulmón humanos
doi: 10.1371 /. journal.pone.0095228.s003 gratis (DOCX)
Nos gustaría dar las gracias a Rong Shi en la Fundación Wu Jieping, el Dr. Wang Haibo, Zhi Yu, Li Ying y otros miembros del Valle de San Biotechnology Inc. Beijing por su ayuda en la muestra y la recopilación de datos. También nos gustaría dar las gracias al personal del Hospital Militar de Beijing por su generoso apoyo para la secuenciación del ADN y la recogida de datos.