Extracto
terapia génica adenoviral diferente y oncolisis habría críticamente benefician de entrada a la célula blanco de los genéticamente modificados cápsides. Esto requiere tanto la ablación de tropismo adenovirus nativo y la identificación de ligandos que permanecen funcional en contexto virus. A continuación, establecemos la entrada específica del tipo celular de vectores basados en HAdV-5 mediante la inserción genética ligando en una fibra quimérica con eje y perilla dominios de la fibra corta HAdV-41 (Ad5T /41sSK). Se informó de este formato de fibra para la ablación de transducción de
in vitro Opiniones y biodistribución al hígado
in vivo
. Se demuestra que el péptido YSA, la unión a la EphA2 marker-cáncer de pan, se puede insertar en tres posiciones de la fibra quimérica, lo que resulta en una fuerte transducción de EphA2-positivo, pero no las células EphA2-negativo de biopsias de melanoma humano y de xenoinjertos de tumores después de inyección intratumoral. La transducción fue bloqueado por el péptido YSA soluble y restaurado para las células EphA2-negativos después de la expresión de EphA2 recombinante. El péptido YSA también podría insertarse en tres posiciones de un coche de unión-ablación HAdV-5 de fibra que permite la transducción específica; Sin embargo, el formato /41sSK Ad5T fue superior
in vivo
. En conclusión, establecemos una cápsida de adenovirus facilitar la inserción funcional de los péptidos de direccionamiento y una novela de adenovirus utilizando el EphA2 marcador tumoral como el receptor con un alto potencial para la terapia génica contra el cáncer y oncolisis viral
Visto:. Behr M, Kaufmann JK, Ketzer P, S Engelhardt, Mück-Häusl M, Okun PM, et al. (2014) los adenovirus Uso del cáncer Marcador EphA2 como un receptor in vitro y in vivo por Genetic ligando de inserción en diferentes cápside andamios. PLoS ONE 9 (4): e95723. doi: 10.1371 /journal.pone.0095723
Editor: Ilya Ulasov, Swedish Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 3 de diciembre de 2013; Aceptado: March 30, 2014; Publicado: 23 Abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Behr et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la concesión de Helmholtz-Universidad Investigador joven Grupo VH GN 212 y el Deutsche Krebshilfe (cáncer ayuda alemana) otorgan 10-7946. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los adenovirus recombinantes (ADS) están en desarrollo preclínico y clínico como agentes oncolíticos y vectores para la vacunación y la terapia génica [1], [2] fármacos basados en Ad .uch pueden beneficiarse considerablemente de o incluso depender un modo específico del tipo celular de acción con el fin de limitar los efectos secundarios, al tiempo que conserva la potencia terapéutica. Tipo de células especificidad de vectores y oncolíticos basada en anuncios, ha sido bien establecida en el nivel post-transcripcional de entrada por la focalización y la regulación microRNA [3], [4] .En contraste, la orientación de la entrada en la célula de anuncios, lo que evitaría mejor los efectos secundarios y el secuestro del virus, sigue siendo un desafío. estrategias genéticas para la orientación de anuncios entrada facilitar la producción de calidad clínica sencilla (no se requieren modificaciones químicas o adaptadores independientes) y garantizar que la progenie Anuncios oncolíticos producidos en los tumores de los pacientes conservan las propiedades mejoradas. Sin embargo, las estrategias para la entrada genética orientación de los anuncios se ven obstaculizados por la estructura de la cápside del anuncio rígida, la incapacidad de moléculas de anticuerpos, como restos de direccionamiento preferidos, para doblar correctamente después de la fusión a expresarse cytosolically proteínas de la cápside de anuncios, y las complejas interacciones de factores del huésped modulación Ad la entrada de células en los pacientes (ver más abajo)
entrada orientación de los anuncios requiere dos pasos:. ablación de tropismo nativo para las células sanas y re-orientación de un receptor expresado específicamente en las células diana mediante la inserción de un ligando correspondiente en el cápside Ad. entrada de la célula de anuncios nativos se inicia mediante la unión de la fibra de proteína de la cápside al receptor de unión, que es receptor de Coxsackie-Ad (CAR) para el serotipo más ampliamente utilizado HAdV-5 [5] .Virus internalización es entonces activado por la unión de la Penton de base para las integrinas celulares [6] .Para aplicaciones terapéuticas de los anuncios no están destinados a orientar el tejido hepático, hígado de segmentación es de vital importancia para evitar los efectos secundarios tóxicos. Sin embargo, la ablación de la unión mediante la mutación de la fibra no redujo la transducción de hígado después de la inyección sistémica virus [7] eliminación complementarias de la OMS de la integrina de unión mediante la mutación de la base pentón CAR resultó en una reducción de la transducción de hígado en algunos, pero no todos los estudios [7] .Por otra parte, Penton base de mutaciones podrían ser contraproducente en el contexto de la orientación de anuncios, como de entrada de virus y los pasos posteriores a la entrada de virus re-dirigido puede verse comprometida [8] .Liver transducción por HAdV-5, con independencia de su interacción con el coche y las integrinas, se atribuyó a los factores de coagulación de la sangre unidos a hexón y fibra [9] - [11] .¿Qué receptor media la transducción de hepatocitos por HAdV-5
in vivo
está siendo objeto de debate [12], [13]
.
Nuestro enfoque para la entrada de la focalización de virus derivados de HAdV-5 es reemplazar los dominios del eje de la fibra y la perilla con los correspondientes dominios de la fibra corta HAdV-41 (Ad5T /41sSK) e insertar ligandos peptídicos en este cápside quimérica. HAdV-41 se une CAR a través de una segunda fibra larga, mientras que ninguna actividad de unión celular se ha atribuido a la corta fibra. En consecuencia, reduce fuertemente la transducción de
in vitro
y la transducción de hígado de
in vivo
han sido demostrado por varios grupos de vectores basados en HAdV-5 que contienen fibras cortas de HAdV-41 o de la estrecha relación HAdV -40 [14] - [19] .We han demostrado previamente que la infectividad de los anuncios con Ad5T quimérico /fibra 41sSK (entonces denominado F5 /41s) puede ser restaurada mediante la inserción ligando peptídico genética utilizando la RGD4C-péptido de unión como un péptido modelo integrina [14] hecho .En, hemos identificado varios sitios de inserción funcionales, estableciendo así la fibra Ad5T quimérico /41sSK como un andamio de fibra flexible para la inserción ligando: el HI y bucles de EG en el lado de la perilla y para el bucle de IJ en su parte superior , lo que resulta en la eficacia de transducción superior en comparación con las fusiones C-terminal. Sin embargo, como las integrinas se expresan de manera ubicua, el péptido RGD4C no era adecuado para demostrar el potencial del formato Ad5T /41sSK para la entrada de células de tipo específico de la célula y la transducción. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue establecer la orientación entrada en la célula por la estrategia Ad5T /41sSK usando un ligando de péptido-selectiva de células y comparar esta estrategia con un enfoque dirigido a base de fibra de HAdV-5.
La péptido YSA, un 12-mer identificados por presentación en fagos, se une selectivamente al receptor de la tirosina quinasa EphA2, pero quinasas no relacionadas [20] .We centrado nuestro estudio sobre este ligando peptídico porque en contraste con otros varios péptidos ensayados se retiene por células actividad de unión en el contexto de la fibra Ad. Es importante destacar que, EphA2 está ganando cada vez más atención como diana para la terapia del cáncer, ya que es (i) upregulated en la mayoría de los tumores sólidos y en el endotelio del tumor, (ii) mejor accesibles en tumores que a menudo carecen de ligandos asociados a células, (iii) funcionalmente asociado con tumor progresión, y (iv) se informó recientemente a ser un marcador de células madre de cáncer [21], [22] .Several EphA2-dirigidos modalidades terapéuticas han demostrado la prueba de concepto en los estudios pre-clínicos, incluyendo inhibidores de la quinasa, anticuerpos, inmunotoxinas, ingeniería las células T, receptores solubles, y vacunas [22] - [24].
a continuación, se investigó la entrada orientación de los anuncios
in vitro
y
in vivo
mediante la inserción de la genéticamente EphA2-péptido vinculante YSA en diferentes andamios fibra anuncio del receptor ciego. En concreto, hemos explorado sitios para la inserción funcional péptido YSA en los dominios de la perilla de la fibra corta HAdV-41 y de la fibra HAdV-5. Además de la producción de virus por la fibra de superinfección transfección /virus combinada como lo hemos hecho anteriormente [14], se determinó la ingeniería directa de los genes de fibra en los genomas de los virus, lo cual es una ventaja o requeridos para la facilidad de la fabricación del virus y para oncolisis viral, respectivamente . La selectividad y la eficacia de la entrada de células Ad mediada por el péptido YSA se investigó en cultivo celular, metástasis humanos biopsias, y modelos de xenoinjerto de animales que comparan tres formatos de fibra de: (i) la Ad5T /fibra 41sSK quimérico, (ii) una fibra quimérica de larga shafted que contiene la cola HAdV 5-fibra y los dominios del eje y la rueda corta la fibra HAdV-41, y (iii) una larga shafted pero ablación HAdV-5 coche de la fibra de unión.
resultados
transducción específica de células EphA2-positiva por los anuncios con el péptido YSA inserta en fibras quiméricos que contienen el pomo de la HAdV-41 de fibra corta
Hemos investigado la entrada de orientación de anuncios por inserción genética de un péptido dirigido en fibras quiméricos con HAdV -41 mando como un andamio de-dirigida. Con este fin, hemos insertado el 12-mero de unión a EphA2-péptido YSA [20] flanqueada por engarces cortos en el HI, IJ o bucles de EG de este dominio mando. Para explorar la relevancia de la longitud del eje sobre la transducción de Ad mediada por YSA, se combinaron estos mandos YSA que contienen con el corto HAdV-41 eje de la fibra (virus Ad5T /41sSK, Fig. 1A) o el largo del eje de la fibra HAdV-5 (Ad5TS /virus 41sK, Fig. 1B). En un tercer conjunto de fibras, incorporamos el eje largo de la fibra HAdV-5 con un proteoglicano sulfato de heparina mutado (HSPG) -vinculante motivo (Ad5TS * /virus 41sK, Fig. 1C). Esta mutación se informó para conferir una mejor orientación de-[17], [25], [26] .Después de plásmido de la transfección, todas las construcciones se expresaron y poseían la capacidad de trimerización, pero trimerización fue claramente menos eficiente para las construcciones de larga shafted, especialmente aquellos que contiene el péptido en el bucle de HI (Fig. 2A). El uso de un protocolo de transfección /superinfección combinado (ver Materiales y Métodos), hemos sido capaces de producir con alta titulación pseudotyped vectores de anuncios reportero lacZ con todos los formatos de fibra. La incorporación de moléculas de la fibra en partículas virales fue eficiente para la fibra corta shafted y, a pesar de la reducción de la capacidad de trimerización, para las fibras largas shafted-IJ-YSA (Fig. 2B). fibras largas shafted EG-YSA y HI-YSA mostraron reducido o carecían de incorporación de fibra en las partículas de virus, respectivamente.
(A) fibras cortas quiméricos-shafted con la cola HAdV-5 fusionado con el eje y el mando de la fibra corta HAdV-41. (B, C) fibras quiméricas-Long shafted que contienen la cola HAdV-5 y de tipo salvaje (B) o el eje mutante (C) fusionado a la perilla de la fibra corta HAdV-41. (D) La unión CAR-ablación HAdV-5 fibras. sitios de inserción péptido YSA se indican mediante bucles. La inserción de la secuencia conectora en diferentes posiciones de la perilla de la fibra de bucle IJ HAdV-5 como resultado la pérdida de la capacidad de trimerización (datos no mostrados) y los virus no se produjeron en este sitio de inserción.
(A) inmunotransferencia de lisados de células sin hervir después de la transfección transitoria de la expresión fibra de plásmidos en células 293T. (B) inmunotransferencia de partículas de virus purificadas de virus pseudotyped reportero LacZ generados por el protocolo de transfección /superinfección. (C) Transducción de células EphA2-positiva y negativa con EphA2-pseudotyped virus reportero lacZ. células SK-MEL-28 se transdujeron por cuadruplicado, todas las demás líneas celulares se transducen por triplicado. Las columnas y las barras de error muestran los valores medios y las desviaciones estándar de la actividad β-Gal, respectivamente. RLU, unidades relativas de luminiscencia; * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt;. 0,001 frente 5T41sSK en la línea celular respectiva
A continuación, analizamos la expresión de EphA2 en un panel de células de cáncer de páncreas, las células del melanoma , células endoteliales, y una línea celular hepática. Se detectó la expresión de EphA2 fuerte para las células de cáncer de páncreas, células endoteliales, y de 4 de 6 cultivos de células de melanoma (Fig. S1). EphA2 no fue detectado por las dos líneas celulares de melanoma SK-MEL-28 y Mel624 y la línea celular HepG2 hepática. los experimentos de transducción con líneas celulares EphA2-positivo PANC-1, MIA Paca-2, Capan-1 (cáncer de páncreas) y C8161 (melanoma) arrojaron resultados que eran similares a las respectivas líneas celulares: Los tres virus pseudotyped con el corto-shafted YSA fibras mostraron transducción, que era sustancialmente más fuerte que para los virus de control sin péptido YSA (Fig 2C;. 10 veces a incremento 35 veces en la actividad β-Gal). Para los virus no modificado con HAdV 5-eje, la inserción de YSA en los lazos HI, IJ y EG mostró débil, fuerte, y la eficacia de transducción intermedia, respectivamente. El virus IJ-YSA shafted largo era incluso superior a los virus de corta shafted (P & lt; 0,05 para todas las líneas celulares.). Para todos los virus con el eje largo mutado, se observó la transducción ineficiente (que se muestra en las células PANC-1 y C8161). En las células SK-MEL-28 EphA2-negativo, el virus EG-YSA y especialmente el virus IJ-YSA con eje largo no modificado mostraron transducción significativamente mayor que los virus de control. Llegamos a la conclusión de que los virus de corta shafted Ad5T /41sSK con péptido YSA insertados en el EG, HI o IJ bucle transducen selectivamente las células tumorales EphA2-positivo, mientras que los Ad5TS largo shafted /41sK-IJ-YSA virus mostraron aún más fuerte, pero la transducción menos selectiva .
a continuación, se investigó cómo la eficacia de transducción de los virus pseudotyped YSA compara con los virus que contienen el péptido RGD establecida, unión a integrina en el tumor y las células endoteliales. La mayoría de los estudios anteriores sobre la inserción ligando peptídico genética utilizan péptidos que contienen RGD y mostró una mejoría, pero no son objeto de entrada a la célula [27] - [29] .Indeed, HAdV-5 virus con péptido RGD en el bucle de HI están siendo investigados en estudios clínicos, debido a su mayor eficiencia entrada en la célula [30] .We encontró que en el contexto de la Ad5T /41sSK fibra quimérica YSA transducción mediada por péptido de las células EphA2-positivo fue similar o incluso superior a la transducción mediada por el péptido RGD4C insertado en el HI bucle (Fig. 3A y B), el sitio de inserción más eficaz para este péptido [14] SK-MEL-28 células .En EphA2-negativas, sólo el virus RGD resultaron en la transducción significativamente mayor que el virus de control sin péptido. Por último, hemos podido demostrar que la transducción de las células EphA2-positivo por Ad5T /41sSK-HI-YSA y Ad5T /41sSK-IJ-YSA pero no Ad5T /41sSK-HI-RGD está bloqueado por el péptido YSA soluble, mientras que un péptido de control con secuencia al azar no bloquear la transducción (Fig. 3B). En general, estos resultados demuestran potente transducción YSA mediada específicamente de las células EphA2-positiva por los anuncios con el péptido YSA insertado en el Ad5T quimérico /fibra 41sSK.
(A) Transducción de células EphA2-positivos y negativos por EphA2- pseudotyped vectores de anuncios que contienen fibras cortas quiméricos-shafted con inserción genética del péptido YSA en comparación con los vectores a juego con la inserción genética del péptido RGD4C. Las células fueron transducidas por cuadruplicado. (B) Transducción de células PANC-1 EphA2-positivas después de la competición con el péptido YSA soluble o con el péptido de control de secuencia al azar. Las células fueron transducidas con anuncios pseudotyped por triplicado. Las columnas y las barras de error muestran los valores medios y las desviaciones estándar de la actividad β-Gal, respectivamente. RLU, unidades relativas de luminiscencia; *
/# p & lt; 0,05, **
/## p & lt; 0,01 *** p & lt;. 0,001 frente 5T /41sSK (*) o 5T /41sSK-HI-RGD (
#)
transducción específica de células EphA2-positivo por anuncios con péptido YSA insertados en el CAR-unión ablación HAdV-5 fibra
Para aplicaciones específicas, por ejemplo, aquellos que requieren la transferencia de genes específicos de tumor pero no en el hígado de-la orientación (véase la discusión), los anuncios con una fibra a base de HAdV-5 podría ser suficiente o ventajoso en comparación con los virus quiméricos que contienen fibras más ampliamente modificados. Por esta razón y para comparar nuestro formato de fibra quimérica con el nativo, investigamos qué sitios de inserción permiten la incorporación genética del péptido YSA en el coche unión mediante ablación HAdV-5 perilla de fibra KO1 (mutaciones S408E y P409A, Ref [31], Fig. 1D). Se encontró que el péptido YSA se puede insertar en el CD, EG y bucles HI de la capacidad de retención de fibra de trimerización (un poco menos eficiente para el bucle CD) y la capacidad de incorporación en partículas de virus generadas por el protocolo de transfección /superinfección (Fig. 4A y SEGUNDO). También exploramos el bucle IJ como una posible posición para la inserción ligando peptídico teniendo en cuenta la ubicación favorable en la parte superior del dominio perilla. Sin embargo, se observó pérdida de trimerización de la fibra después de la inserción de un enlazador en las posiciones G560 /H561 o I564 /N565 (no mostrado). Pseudotyped Los anuncios con el péptido YSA insertado en el EG, HI o bucle CD de la perilla KO1 mediada transducción eficiente de células EphA2-positivo, que era de 8 veces a 230 veces superior a la Ad5KO1 virus de control sin inserción de péptido (Fig. 4C ). El virus Ad5KO-HI-YSA fue más eficiente que los virus Ad5KO-EG-YSA y Ad5KO-CD-YSA en todas las líneas celulares sometidas a prueba, así como superior a Ad5T /41sSK-EG-YSA. Además, el virus Ad5KO-HI-YSA mostró eficacia de transducción similar o superior en comparación con el virus Ad5WT, que contiene el tipo salvaje HAdV-5 de la fibra. En las células de EphA2-negativas, ninguno de los virus con el péptido YSA insertados en la fibra KO1 aumentó la eficacia de transducción en comparación con el virus parental (Fig. 4C), lo que demuestra la falta de transducción desviado. En conclusión, la eficacia de transducción de anuncios con inserción péptido YSA en la fibra HAdV-5 depende del lugar de la inserción con la inserción HI que muestra la mejor eficacia de transducción y la especificidad.
(A) por inmunotransferencia de lisados de células sin hervir después de transfección transitoria de la expresión fibra plásmidos en células 293T. (B) inmunotransferencia de partículas de virus purificadas de virus pseudotyped reportero lacZ. (C) Transducción de células EphA2-positiva y negativa con EphA2-pseudotyped virus reportero lacZ. Las células fueron transducidas por cuadruplicado, columnas y las barras de error muestran los valores medios y las desviaciones estándar de la actividad β-Gal, respectivamente. RLU, unidades relativas de luminiscencia; *
/# p & lt; 0,05, **
/## p & lt; 0,01, ***
/### p & lt; 0,001 frente 5T /41sSK (*) o 5KO1 (
#) .
transducción mediada por EphA2 del tumor y las células endoteliales por genómicamente fibra modificada Anuncios
a continuación desarrollamos virus EphA2-dirigida con fibras modificadas codificadas por su genoma en lugar de pseudotyped mediante transfección . Genómicamente virus modificados podrían simplificar los procedimientos de fabricación y facilitar la producción a gran escala de virus. Además, se requiere la inserción de fibra genómico en el contexto de la oncolisis viral. Sin embargo, no está claro cómo el reemplazo de fibra genómico afecta a la producción de virus infecciosos. De hecho, un estudio anterior informó de defectos de crecimiento y /o partículas defectuosas para vectores de Ad con el gen de la fibra nativa se sustituye por un gen que codifica la fibra corta HAdV-41 con inserciones de péptidos [32] tecnología recombinería .using BAC, hemos clonado seis genomas de primera generación GFP /Luc reportero virus. En tres genomas la fibra HAdV-5 fue sustituido por una fibra YSA que contiene representando cada uno de los formatos de fibra (Ad5T /41sSK-IJ-YSA, Ad5TS /41sK-IJ-YSA y Ad5KO1-HI-YSA). Los otros tres genomas representados los virus de control Ad5T /41sSK, Ad5wt, y Ad5KO1. Todos los virus podrían producirse a alto título y mostraron incorporación de fibra eficiente (Fig. 5A). Los resultados de los experimentos de transducción con estos virus modificados genéticamente reproducidos los obtenidos con pseudotyped virus producidos por el protocolo de transfección /superinfección, demostrando que la inserción de la fibra genómico fue exitosa (Fig 5B-D.): En las células EphA2-positivo del cáncer pancreático, células de melanoma y endotelial células, que de nuevo observaron un aumento dramático en la eficacia de transducción de YSA que contiene virus en comparación con los virus de control del receptor ciego (15 veces a 236 veces). La inserción del péptido YSA en la fibra KO1 resultó en el mayor aumento en la eficiencia de transducción. La fibra virus quimérico IJ-YSA con eje largo fue de nuevo un poco más fuerte que el virus coincidente con un eje corto. De nota, virus YSA resultaron en la transducción de fuertes incluso en comparación con el virus que contiene el tipo salvaje HAdV-5 de la fibra en las células EphA2-positivo. Este fue el caso, no sólo para las células débilmente transducidas con virus que contiene la fibra HAdV-5, es decir, las células C8161 (36 veces a 220 veces), sino también en el EphA2- y [33], [34] las células CAR-positivo MIA Paca-2, PANC-1 y HUVEC. En las células SK-MEL-28 y HepG2 EphA2-negativas, Ad5T /41sSK-IJ-YSA y Ad5KO1-HI-YSA no mostraron aumento significativo en la eficacia de la transducción en comparación con los controles respectivos sin inserción de péptido, mientras que Ad5TS /41sK-IJ-YSA volvió a mostrar algo mayor transducción. La visualización de la expresión de GFP confirmó que los anuncios con péptido YSA resultó en la transducción de marcadamente elevados porcentajes de células EphA2-positivas en comparación con los virus de control sin péptido como en comparación con Ad5wt (Fig. S2). En las células EphA2-negativas, la eficacia de transducción que determinen esta lectura de datos basada en GFP se redujo fuertemente para Ad5T /41sSK-IJ-YSA, Ad5KO1-HI-YSA, Ad5T /41sSK y Ad5KO1 en comparación con Ad5wt, pero no tanto para Ad5TS /41sK-IJ-YSA. Estos resultados confirman que los virus Ad5T /41sSK-IJ-YSA y Ad5KO1-HI-YSA cuentan con la mejor capacidad de orientación de entrada para las células EphA2-positivo. De nota, la transducción de la entrada de células SK-MEL-28 células por virus YSA pero no por los virus de control sin inserción de péptido podría ser restaurado por la sobreexpresión de EphA2 recombinante (Fig. 6, Fig. S3), lo que demuestra que EphA2 media de YSA péptido que contiene virus.
(A) por inmunotransferencia de partículas de virus purificadas generados por la inserción genómica de fibras recombinantes. (B-D) Transducción de células de cáncer de EphA2-positivo (B), las células EphA2-negativo (C) y las células endoteliales EphA2-positivo (D) con virus informadores /GFP Luc fibra modificada genómicamente. C8161 células fueron transducidas por triplicado, todas las demás líneas de células fueron transducidas por cuadruplicado. Las columnas y las barras de error muestran los valores medios y las desviaciones estándar de expresión Luc, respectivamente. RLU, unidades relativas de luminiscencia; *
/# p & lt; 0,05, **
/## p & lt; 0,01, ***
/### p & lt; 0,001 frente 5T /41sSK (*) o 5KO1 (
#) .
SK-MEL-28 células transfectadas con el plásmido de expresión de EphA2 (pcDNA-EphA2) o plásmido de control (pcDNA) fueron transducidas con virus reportero /GFP-Luc fibra modificada genómicamente. Las células fueron transducidas por cuadruplicado, columnas y las barras de error muestran los valores medios y las desviaciones estándar de expresión Luc, respectivamente. RLU, unidades relativas de luminiscencia; ** P & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001 para las comparaciones indicadas. Para la detección de la expresión de EphA2 de las células transfectadas ver Fig. S3.
YSA péptido mediada por la transducción adenoviral de cáncer de melanoma xenoinjertos y pancreáticas
in vivo
Producción de preparados alto título de virus de la cápside modificado genómicamente nos permitió para realizar estudios en animales para explorar YSA péptido mediada por la transducción adenoviral
in vivo
. Con este fin, hemos utilizado ratones NOD-SCID con tumores de xenoinjertos subcutáneos de PANC-1 en las células de cáncer de páncreas o las células C8161 de melanoma. la expresión de EphA2
in vivo
se verificó tanto en modelos tumorales (Fig. S4). En un primer experimento, se inyecta animales portadores de PANC-1 o C8161 tumores por vía intratumoral (i.t.) con Ad5T /41sSK-IJ-YSA o Ad5T /41sSK (Fig. 7A). En ambos modelos tumorales se observó transducción significativamente más fuerte con Ad5T /41sSK-IJ-YSA (2,9 veces para PANC-1 y 5,9 veces para el C8161), lo que demuestra que la transducción mediada por YSA-péptido es funcional
in vivo
. En un segundo experimento se inyectó C8161 tumores i.t. con los anuncios que contienen YSA-que representan cada uno de los formatos de fibra (Ad5T /41sSK-IJ-YSA, Ad5TS /41sK-IJ-YSA y Ad5KO1-HI-YSA) o con virus de control (Fig. 7B). Se confirmó el aumento de la transducción de Ad5T /41sSK-IJ-YSA frente Ad5T /41sSK. Ad5TS /41sK-IJ-YSA mostraron algo más alta que la transducción Ad5T /41sSK-IJ-YSA. Estos resultados están de acuerdo con los
in vitro
resultados de transducción. Sin embargo, en contraste con el
in vitro
datos Ad5KO1 mostraron la eficacia de transducción similar a Ad5wt después i.t. inyección en xenoinjertos C8161 pérdida de revelar desapuntan. Por consiguiente, el aumento en la transducción mediante inserción péptido YSA era menor (1,6 veces), pero alcanzó significación. Por lo tanto, des- y re-orientación de los anuncios para la entrada específica a través de EphA2 después i.t. inyección
in vivo
se implementan mejor con el formato de fibra Ad5T /41sSK. En general, estos resultados muestran que la entrada péptido mediada por la orientación usando el formato Ad5T fibra /41sSK es funcional
in vivo después de
i.t. inyección de virus.
(A, B) 2 × 10
10 vp de virus, Luc reportero EphA2 orientada fibra modificada /GFP y de control se inyectaron por vía intratumoral genómicamente en ratones NOD-SCID que llevan xenoinjertos de tumores ( n = 6 a 9 tumores por grupo). expresión del gen informador de luciferasa en los tumores se cuantificó 3 días después de la inyección de virus. Las columnas y las barras de error muestran los valores medios y las desviaciones estándar, respectivamente. RLU, unidades relativas de luminiscencia. * P & lt; 0,05 frente a 5T /41sSK,
#p & lt; 0,05 y
### p. & Lt; 0,001 frente 5KO1
YSA péptido mediada por la transducción de adenovirus en las biopsias de metástasis de melanoma humano
a continuación se investigó si los anuncios orientados por EphA2 resultado un aumento de la transducción no sólo en cultivos de células tumorales en monocapa y xenoinjertos de células tumorales, sino también en el material tumoral recién biopsia de pacientes. Estos representan sustratos más clínicamente relevantes con respecto a la fisiología de las células tumorales y la presencia del microambiente tumoral. Las biopsias de metástasis de melanoma se cortaron en cortes de tejidos vivos inmediatamente después de la cirugía y posteriormente fueron transducidas con el anuncio, genómicamente cápside modificado con YSA contienen representan cada uno de los formatos de fibra o con el virus de control. se detectó la expresión de EphA2 en cortes de tejido de todas las biopsias obtenidas a partir de 5 pacientes vivos. Sin embargo, la expresión varió entre pacientes y fue más débil que para los cultivos en monocapa (Fig. S5A). Esto se esperaba como biopsias contienen una mezcla de células de las que sólo una fracción son células tumorales. Se observó fuerte eficacia de transducción como se determina por la expresión de GFP en busca de virus con el péptido YSA y para el virus de control con nativo HAdV-5 de la fibra, lo que confirma la transducción mediada por péptido YSA (Fig. S5B). Como señales de GFP en las fotografías 2D no representan cuantitativamente la eficacia de transducción, en parte debido a la forma arrugada de las lonchas después del cultivo 3 días, se cuantificó la expresión de luciferasa para estas rebanadas (Fig. 8A) y para biopsias de cuatro pacientes adicionales (Fig. 8B-e, una biopsia dado sólo suficientes rebanadas de transducción con Ad5T /41sSK-IJ-YSA y Ad5T /41sSK). Tenga en cuenta que las lecturas de luciferasa son altos porque hemos realizado transducción de alto título que permite el seguimiento de la expresión de GFP. Se observó un marcado aumento de la transducción de Ad5T /41sSK-IJ-YSA en comparación con Ad5T /41sSK en 5 de 5 biopsias (significación se alcanza en 3 biopsias con 4.3- a las diferencias 576 veces, no en el resto de las biopsias debido al material limitada) . Se observó el mayor aumento en la transducción de la biopsia que mostraba la expresión de EphA2 fuerte. Ad5TS /41sK-IJ-YSA mostraron transducción mayor que Ad5T /41sSK en 4 de 4 biopsias, pero fue menor que para Ad5T /41sSK-IJ-YSA en 3 de 4 biopsias, que estaba en contraste con los resultados en cultivos en monocapa. Por último, la transducción de melanoma que viven cortes de tejido por Ad5KO1-HI-YSA fuertemente aumentó en comparación con Ad5KO1 en 4 de 4 biopsias (2,1 veces a 17,1 veces, importantes en 2 biopsias). Estos resultados confirman re-dirigidos transducción adenoviral mediado por el péptido insertado YSA para Ad5T /41sSK-IJ-YSA y Ad5KO1-HI-YSA también en material de biopsia de tumores clínicamente relevantes.
(A-E) cortes de tejido de estar de metástasis de melanoma de 5 pacientes diferentes fueron transducidas con 10
10 pv /rebanada de virus con fibra modificada, Luc reportero EphA2 orientada /GFP y control genómicamente. El número de rodajas transducidas por virus era dependiente del tamaño de la biopsia y era n = 4 (A, B), n = 3 (C), n = 2 (D) y n = 5 (E). expresión del gen informador de luciferasa se cuantificó 3 días después de la transducción. Las columnas (A-E) y las barras de error (A, B, C, E) muestran los valores medios y las desviaciones estándar, respectivamente. RLU, unidades relativas de luminiscencia. *
/# p & lt; 0,05 frente a 5T /41sSK (*) o 5KO1 (
#) guía empresas
Discusión
En este estudio establecemos tipo de células específicas. entrada a la célula mediante la inserción de anuncios ligando de péptido funcional en un andamio de fibra quimérica de-específico con el eje corto HAdV-41 de la fibra y la perilla (Ad5T /41sSK). Por otra parte, se describen vectores de Ad entrada orientada a la EphA2 marcador de superficie pan-cáncer altamente relevante mediante la inserción genómica del gen que codifica la fibra quimérico o un CAR ablación vinculante HAdV-5 fibra con ligando peptídico YSA. Transducción de células EphA2-positivo
in vitro
se aumentó dramáticamente por inserción ligando peptídico para ambos formatos de fibra (hasta 236 veces), lo que subraya la potencia del péptido YSA para re-direccionamiento de célula viral de unión y la entrada . Hemos identificado previamente el EG, HI y bucles de IJ Ad5T /41sSK como sitios para la inserción funcional del péptido RGD4C, que se une a integrinas se expresa ampliamente [14]. Aquí hemos confirmado la viabilidad de estos sitios de inserción utilizando el péptido de unión a EphA2-YSA. En contraste con el péptido RGD, que mostró una actividad superior en el bucle de HI, se observó una actividad similar en cada uno de los tres bucles para el péptido YSA (Fig. 2), revelando que los sitios de inserción afectan las interacciones péptido-receptor dependiente de manera diferente en el péptido . Con el péptido YSA, hemos podido demostrar por primera vez que la fibra Ad5T /41sSK quimérico facilita específica del tipo celular de transducción de Ad utilizando un panel de células EphA2-positivas y EphA2-negativo (. Figs 2 y 5). competencia de péptidos y los estudios de expresión del receptor recombinante prueban claramente que la transducción es específica de péptido y mediada por EphA2 (Figs. 3 y 6). Estos resultados establecen una base para futuros estudios que se deben explorar si otros péptidos ligandos son funcionales en el andamio de fibra Ad5T /41sSK, lo que permite la entrada del virus de orientación a través de otros marcadores de superficie.
Se demuestra que la introducción de las fibras modificadas en el genoma del virus, sustituyendo así la fibra nativa, es factible (Fig. 5), además de pseudotyping a través del protocolo de transfección de dos paso /superinfección, como también utilizado en nuestro estudio anterior ([14], Figs. 2-4). Hemos observado trimerización fibra eficiente, la producción de virus y la incorporación de fibra en las partículas de virus de los virus genómicamente modificados con fibras 5T /41sSK (y fibras KO1, ver más abajo). ß-actina se utilizó como control de carga.