Extracto
Antecedentes
La regulación de la apoptosis bajo basal (no estrés) condiciones es fundamental para el desarrollo normal de los mamíferos y también para la renovación celular normal en los diferentes tejidos a lo largo de la vida. regulación deficiente de apoptosis basal, o su perturbación, puede dar lugar a deterioro en el desarrollo y /o estados de enfermedad incluyendo el cáncer. En contraste a la apoptosis inducida por el estrés de la regulación de la apoptosis en condiciones basales es poco conocida. Para hacer frente a este problema hemos comparado la apoptosis inducida por el estrés y basal--en las células epiteliales humanas de origen normales y cancerosas. Con este fin hemos centrado nuestro estudio sobre las vías de NFkB /anti-apoptóticos opuestos JNK pro-apoptótica.
Metodología /Principales conclusiones
combinatoria RNAi plus eliminación de genes se emplearon para acceder y asignar basal reglamentario las vías de la apoptosis. Seguimiento, análisis en profundidad incluida la expresión exógena de mutantes fosforilación y la inmunoprecipitación de la cromatina. Se demuestra que la apoptosis basal es constitutivamente suprimida por JNK2 en una gama de líneas celulares de cáncer humano. Este efecto no se observó en las células no cancerosas. Silenciando JNK2 por RNAi dio lugar a la apoptosis JNK1 dependiente de las células cancerosas a través de la regulación de la AP-1 factor de c-jun. Inesperadamente, descubrimos que JNK1 y c-Jun promover la apoptosis basal en ausencia de "activación" fosforilaciones inducidas normalmente por el estrés. fosforilada hipo-c-Jun acumula a niveles altos siguientes silenciamiento JNK2, auto-regulado su propia expresión y suprimió la expresión de Bcl-3, una proteína de I? B inusual y regulador de NFkB. apoptosis basal fue mediada por los componentes de la vía de respuesta TNFa pero era mecánica distinta de la apoptosis inducida por TNF-.
Conclusiones /Importancia
Nuestros resultados demuestran que las vías mecánica distinta operan para regular la apoptosis en células de mamífero bajo basal (fisiológica) frente a condiciones de estrés inducido. También describimos una nueva red de apoptosis que regula la supervivencia basal de las células cancerosas. Esta información es crucial para entender la renovación celular normal durante el desarrollo de los mamíferos y, posteriormente, durante toda la vida. Esta información también abre nuevas vías para la intervención terapéutica en enfermedades proliferativas humanas como el cáncer
Visto:. Ahmed SU, J Milner (2009) Cancer Cell Basal Supervivencia Implica la supresión de una novela JNK2 JNK1 /c-Jun /Bcl -3 Red apoptótica. PLoS ONE 4 (10): e7305. doi: 10.1371 /journal.pone.0007305
Editor: Andreas Bergmann, Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 10 Agosto, 2009; Aceptado: 7 Septiembre 2009; Publicado: 6 Octubre 2009
Derechos de Autor © 2009 Ahmed, Milner. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto fue apoyado por un programa de investigación básica premio de Yorkshire de investigación del cáncer de JM. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los c-jun quinasas N-terminal (JNKs) son miembros de la familia de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAP quinasas, MAPKs) y se activan en respuesta al estrés celular [1], [2]. En respuesta al estrés JNK1 y JNK2 se activan a través de fosforilación dual de T183 y Y185 por quinasas MAPK (MAPKK), MKK4 y MKK7 específicamente [3], [4]. Las MAPK y MAPKKs forman parte de un super-familia de transducción de señales que incluye las quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK-MAPK) y p38. Las funciones de JNK1 y JNK2 se determinan por el tipo celular y por la naturaleza de la tensión responsable de su activación. Los estudios iniciales identificaron JNK por su capacidad para fosforilar el N-terminal de c-Jun, un miembro de la proteína activadora 1 (AP-1) factor de transcripción de la familia [5]. Posteriormente JNKs fueron mostrados para fosforilar y regular la actividad de otras proteínas AP-1, así como proteínas adicionales implicados en la proliferación celular y la apoptosis, incluyendo p53, c-Myc, Bcl-2 y Bim [2], [6].
AP-1 factores son un grupo estructural y funcionalmente miembros relacionados de la familia de proteínas jun (c-jun, JunB y Jund) y la familia de proteínas Fos (c-Fos, FosB, Fra-1 y Fra-1) [7]. La dimerización dentro de estos miembros de la familia forma un AP-1 factor de transcripción y la abundancia relativa de AP-1 subunidades individuales y la composición del dímero son factores importantes que determinan el destino celular. El repertorio de AP-1 dímero composición permite la adaptación de una respuesta mediada por AP-1 por distintos tipos de células a un estímulo dado. Post-translacional modificación y recambio de las proteínas son dos mecanismos de regulación de la actividad de AP-1. Por ejemplo, en respuesta al estrés el potencial de transactivación de c-Jun se activa por fosforilación N-terminal JNK mediada por [8], [9], mientras que la estabilidad de la proteína c-Jun es reguladas por vía mediada por GSK-3 C-terminal de fosforilación que se dirige a c-Jun para ubiquitinylation y la degradación a través de la E3 ligasa Fbw7 [10].
un importante activador de la apoptosis vía de JNK es el factor de necrosis tumoral α (TNF), una citoquina proinflamatoria que regula la supervivencia celular a través de la promoción de ya sea la proliferación celular o la apoptosis [11]. TNF se acopla con su receptor trimérico, TNFR1, en la superficie externa de la membrana celular. TNF /TNFR1 interacción resulta en la formación de un complejo de proteína heterogénea intracelular (complejo 1) en la cola citoplásmica de TNFR1. A su vez este complejo conduce a la activación de JNK y también de I? B quinasa (IKK). Los estudios elegantes
in vitro
y
in vivo
han demostrado que, en los hepatocitos expuestos a TNF, JNK1 fosforila activa y activa la ubiquitina ligasa E3 PICOR [1], [12]. PICOR activado induce ubiquitinylation y la degradación de cFLIP (proteína inhibidora FLICE celular) que inhibe específicamente de otro modo la activación de pro-caspasa 8 (también llamado FLICE). Caspasa 8 resultados de la activación de la apoptosis [1], [10]. Esta vía pro-apoptótica es contrarrestado por NFkB, que hasta regula la expresión de c-FLIP y por lo tanto inhibe la procaspasa 8 activación y la apoptosis [13].
NFkB es un factor de transcripción compuesto de homo o heterodímeros de los miembros de la familia Rel de proteínas, incluyendo p65 (de RelA), RelB, c-Rel, p50 y p52 (revisado en [14]. dominios de activación de la transcripción están ausentes en p50 y p52, que por lo tanto necesitan para formar heterodímeros con el fin de transactivate los genes objetivo. El conjunto principal es un heterodímero de p65-p50 pero diferentes composiciones dímero también se forman. NFkB está sujeta a regulación por parte de las interacciones proteína-proteína con proteínas I? B. I? B? y IκBβ preferentemente se dirigen heterodímeros p65-p50. La fosforilación de I? B por I? B quinasas desencadena la degradación de I? B con la liberación de NFkB dimérica que se transloca en el núcleo y regula la expresión génica. Bcl-3 es un I? B inusual que se une preferentemente p50-p50 y homodímeros NFkB p52-p52 [15], [16]. Bcl-3 es distingue además de otras proteínas I? B en que puede localizarse en el núcleo, no se degrada tras la activación de NFkB y posee siete, en lugar de seis, dominios de repetición de anquirina. localización nuclear de Bcl-3 es compatible con su capacidad para formar un complejo ternario con p50 ADN-vinculados: homodímeros p50 de NFkB, y también para ayudar a la absorción de p50 en el núcleo (ver [17] y las referencias en él). Bcl-3 fue descrita por primera vez en las células B leucemia linfocítica crónica [18] y es considerado como una oncoproteína putativo
.
Además de su papel en la respuesta al estrés JNK1 y JNK2 también funcionará bajo basales, sin estrés condiciones como se evidencia por anormalidades específicas de tejido observados en JNK1 - /- y JNK2 - /- ratones. Por ejemplo, JNK1 - /- ratones muestran una disminución de la diferenciación de células T y la inmunidad defectuoso [19]. Es importante destacar que JNK1 - /- ratones también desarrollan tumores intestinales espontáneos, lo que indica que las funciones de JNK1 como un supresor de tumor para este tipo de tejido [20]. Sin embargo, los mecanismos de la JNK1 y JNK2 que funcionan bajo basal, las condiciones fisiológicas son poco conocidos.
Para investigar los papeles individuales de JNK1 y JNK2 en las células epiteliales humanas bajo condiciones basales que empleó una combinación de (i) RNAi inducida en ausencia de esfuerzo aplicado, (ii) líneas de células knock-out de genes, y (iii) la expresión del gen exógeno. En una serie de líneas celulares humanas descubrimos que JNK1 es activamente pro-apoptóticos, pero es constitutivamente inhibida por la presencia de JNK2 en células de cáncer. Este efecto no se observó en las células no cancerosas. experimentos de co-silenciar revelaron que éstos basal, oponiéndose a las funciones de pro-y anti-apoptóticos de la JNK1 y JNK2 son en gran medida independientes de las quinasas en fases anteriores MKK4 y MKK7. Esto fue consistente con la falta de cambio discernible en la fosforilación JNK1 a pesar de la apoptosis dependiente de JNK1 tras el agotamiento de JNK2. Otros experimentos revelaron que la vía basal JNK1 pro-apoptótica implica c-Jun, más componentes de la vía de la MAP quinasa TNF-sensible, junto con la vía NFkB a través de c-Jun-mediada baja regulación de Bcl-3. Así, la regulación basal de la supervivencia celular de cáncer parece ser dependiente de las funciones opuestas de JNK2 /Bcl-3 (pro-supervivencia) y JNK1 /c-Jun (pro-apoptótica) y estar bajo control constitutiva por JNK2.
resultados
selectivo knock-down de JNK2 aumenta la expresión de JNK1
En el ARNi se empleó siRNAs sintéticos en condiciones previamente demostrado para dar eficiente de derribo de los ARNm diana sin la activación de la p53 celular respuesta al estrés [21], [22]. controles RNAi incluyen BCR-ABL siRNA, que no tiene objetivo mRNA en las células epiteliales y por lo tanto sirve como un control de siRNA no funcional, y la lamina A /C siRNA, dirigido a la lamina A C mRNA /y sirve como un control funcional siRNA (Métodos ). Selectiva knock-down de JNK1 y JNK2 ARNm se reprodujo con dos diferentes siRNAs para cada objetivo (Métodos y Fig. S1). La eficiencia de ARNm knock-down se determinó mediante PCR cuantitativa y fue similar para ambos JNK1 y JNK2 (~ 75% de reducción; ver Fig. 1A para los niveles de ARNm de JNK1). silenciamiento ARNi inducida de la lamina A /C o de JNK1 no indujo ningún cambio en p53 o p21
WAF1, un gen diana dependiente de p53 (Fig. 1B para JNK1 siRNA y la Fig. S2 para la lamina A /C siRNA) , lo que confirma que las condiciones de ARNi
per se
no inician una respuesta de estrés p53. Sin embargo silenciamiento JNK2 resultó en un aumento pliegue ~ 3 en la proteína p53 (Fig. 1B) lo que sugiere que JNK2 regula directa o indirectamente la cifra de negocios de la proteína p53. Esto es consistente con el informe de que las JNK pueden regular la rotación basal de p53 [23]. Curiosamente, la co-silenciamiento de JNK1 con JNK2 abrogó el aumento de p53 (Fig. 1B) lo que implica que JNK1 y JNK2 ejercen efectos coordinados sobre el volumen de negocios de p53.
niveles (A) JNK1 de ARNm, y ( B) JNK1, JNK2, y también p53 y p21 niveles de proteína determinada 48 horas después de la transfección con JNK1- y JNK2-siRNAs como se indica (Métodos). imágenes (C) Fase de contraste de las células HCT116 48 h después de la transfección con JNK1- y JNK2-siRNAs. (D) La apoptosis determinada por la anexina V etiquetado de células siRNA tratados con respecto a los controles no tratados en una gama de líneas celulares humanas (Métodos. Nota: los resultados de la apoptosis son representativos de al menos tres experimentos repetidos a menos que las barras de error se incluyen para la repetición de los análisis de una experimento individual). (E) La caspasa 8 y sus productos de escisión, que se activa la caspasa 7 y la caspasa efectora 3 siguiente silenciamiento mediado por RNAi de JNK1 y JNK2 como se indica. controles actina = carga. HCT116 p53 + /+ y HCT116 p53 - /- son clones isogénicas de células cancerosas HCT116 colorrectal humano (métodos)
Inesperadamente, en células de cáncer colorrectal HCT116 JNK2 knock-down consistente resultó en un ~ 50%. aumento en los niveles de ARNm de JNK1 y un aumento del pliegue ~ 3 en los niveles de proteína JNK1 (Fig. 1A y 1B). resultados similares para JNK1 mRNA se obtuvieron en isogénica p53 HCT116
+ /+ y HCT116 p53
- /- células (Fig. 1A y 1B), lo que indica que el efecto es independiente de p53. Por lo tanto, en las células HCT116, la presencia de JNK2 suprime directa o indirectamente los niveles de expresión basales JNK1.
JNK2 knock-down induce apoptosis
Knock-down de JNK2 dio lugar a la apoptosis en una variedad de cáncer líneas de células incluyendo las células HCT116 (Fig. 1C y 1D). La apoptosis se determinó mediante tinción con anexina V (Métodos) e implicado la activación de la caspasa-8 Pro y caspasas efectoras 3 y 7 (Fig. 1E). Este efecto apoptótico de agotamiento JNK2 era independiente de p53 como se evidencia por HCT116 p53 - /- células (Fig. 1C y 1D). En células no cancerosas JNK2 silenciamiento no indujo apoptosis (células epiteliales ARPE19 y MCF10A, y WI-38 fibroblastos) a pesar eficiente JNK2 mRNA knock-down (Fig. 1D y los datos no se muestra). En contraste con el silenciamiento JNK2, el silenciamiento de JNK1 no afectó la viabilidad en cualquiera de las líneas celulares ensayadas (Fig. 1C y 1D). En general estos resultados indican que JNK2, pero no JNK1, es esencial para la viabilidad basal en un número de líneas celulares de cáncer humano, incluyendo las células epiteliales de cáncer de mama MCF7, pero es prescindible para la viabilidad basal de las células no cancerosas, incluyendo las células epiteliales MCF10A de mama.
la apoptosis es dependiente de JNK1
a continuación JNK1 co-silenciada con JNK2 con el fin de investigar su vinculación funcional en la regulación de la supervivencia de las células cancerosas. En todos los casos en los que el silenciamiento JNK2 indujo apoptosis, se encontró que co-silenciar JNK1 con JNK2 rescatado células JNK2-agotado de la apoptosis (Fig. 1D). Por lo tanto concluimos que JNK1 y JNK2 contrapeso entre sí en el mantenimiento de la viabilidad de células cancerosas y que JNK2 suprime constitutivamente apoptosis JNK1 mediada en condiciones basales.
apoptosis dependiente de JNK1 es independiente de mayor JNK1 S63 /73 fosforilación
Los resultados anteriores indican que JNK1 está preparado para inducir la apoptosis en las células cancerosas epiteliales humanas pero es constitutivamente suprimida por JNK2. Tanto JNK1 y JNK2 son mediadores aguas abajo de la vía apoptótica MAP quinasa y se activan en respuesta al estrés por MKK4 y /o fosforilación en MKK7 T183 /Y185 (Introducción). A continuación comparó JNK1 y JNK2 fosforilación basal bajo (RNAi) e inducida por estrés condiciones (UV o TNFa).
A medida que la radiación UV se espera indujo una fuerte fosforilación en residuos T183 /Y185 tanto de JNK1 y JNK2 proteínas en las células HCT116 (Fig. 2A). Del mismo modo, el tratamiento de células HCT116 con JNK1 TNFa también indujo la fosforilación y JNK2 a T183 /Y185 (Fig. 2B, panel superior). En este último caso JNK1 fosforilación predominó sobre la fosforilación JNK2. Estos resultados demuestran claramente la fosforilación de JNK1 y JNK2 en respuesta a estrés genotóxico (UV) y al estrés mediada por receptor (TNFa) en células HCT116. Tanto la irradiación UV y la apoptosis inducida por TNF (datos no mostrados)
Comparación de JNK1 estado de fosforilación /JNK2 en control, JNK2-silenciado y después de la irradiación UV (células HCT116; Métodos) (A).. p-JNK1 = JNK1 fosforilada, pJNK2 = JNK2 fosforilada (flecha). (B) Efectos de TNFa en estado de fosforilación de JNK1, JNK2 y c-Jun. (C) Co-silenciamiento de c-Jun con JNK2 rescata a las células HCT116 de la apoptosis (etiquetado anexina V; Métodos). (D) JNK1, JNK2 y c-Jun niveles de proteína silenciamiento de JNK2 y c-Jun 48 h post-RNAi mediada. También se muestran los niveles de p53 y la proteína p21. (E) los niveles de c-Jun mRNA después de JNK1 y JNK2 silenciamiento. (F) Las veces de aumento en los niveles de ARNm de c-Jun en las células HCT116 en comparación con las células ARPE19 48 h después de silenciamiento JNK2. (G) desmontables de c-Jun mRNA y los niveles de proteína p53 en HCT116 + /+ células después del tratamiento de c-Jun siRNA.
En condiciones basales, cuando era JNK1 activamente pro-apoptótica después de silenciamiento JNK2, hay hubo un aumento apreciable en la fosforilación de JNK1 T183 /Y185 (Fig. 2A, comparar carriles con carriles de control JNK2 siRNA). Esto está en marcado contraste con las condiciones inducidas por el estrés (Figura 2A;. Comparar carriles JNK2 siRNA con carril UV). Por lo tanto inferimos que JNK1 es capaz de promover la apoptosis en ausencia de 'activación' fosforilaciones T183 /Y185 que son inducidos típicamente en respuesta al estrés. en fases anteriores quinasas co-silenciar MKK4 o MKK 7 con JNK2 sólo parcialmente rescatado apoptosis JNK1-dependiente (Fig. S3), mayor fundamentación de la capacidad de JNK1 para promover la apoptosis en ausencia de una mayor T183 /Y185 fosforilaciones.
Llegamos a la conclusión de que, en condiciones basales, JNK1 puede promover de forma activa la apoptosis, sin someterse a una mayor T183 /Y185 fosforilación característico de la respuesta al estrés celular. Esta función pro-apoptótica basal de JNK1 es evidente en las células cancerosas epiteliales humanas (pero no en células no cancerosas) y es constitutivamente inhibida por JNK2 endógeno. Para investigar la ruta apoptótica basal bajo control JNK1 que junto realizó una serie de experimentos de co-silenciar el fin de identificar mediadores pro-apoptóticos esenciales relacionados con la apoptosis dependiente de JNK1 siguientes silenciamiento JNK2.
c-Jun es una mediador esencial de la apoptosis basal y está sujeta a los efectos de la JNK1 y JNK2
para oponerse a preguntar si se requiere de c-Jun para la apoptosis en condiciones basales que co-silenciado c-Jun con JNK2 (figura 2;. la eficiencia de c-Jun mRNA desmontables se muestra en la Fig. 2G). Los resultados demuestran claramente que c-Jun co-silenciamiento rescata células HCT116 JNK2-silenciado de apoptosis identificando así c-Jun como un mediador esencial de la apoptosis sujeto a la supresión JNK2 bajo condiciones basales (Fig. 2C).
La c-Jun proteína acumulado a altos niveles siguientes silenciamiento JNK2 en las células HCT116 (Fig 2D;. aumentó c-Jun también se observó en células RKO y Lovo siguiente silenciamiento JNK2, que no se muestra) en paralelo con un aumento de c-Jun mRNA (Fig. 2E). Curiosamente, este efecto fue abolida cuando JNK1 fue co-callar con JNK2 (Fig. 3A para la proteína c-Jun y la Fig. 2E de c-Jun mRNA) que indica que la regulación de c-Jun es dependiente de la presencia continuada de JNK1 . JNK1 silenciar solo provocó una disminución de c-Jun mRNA y de la proteína (Fig. 2E y la Fig. S4). Estas observaciones combinados indican que JNK1 y JNK2 ejercen efectos opuestos sobre la expresión de c-Jun y se requiere que JNK1 para el mantenimiento de los niveles basales c-Jun mRNA y de expresión de proteínas, mientras que suprime JNK2 constitutivamente niveles de c-Jun mRNA y expresión de proteínas. Se observaron resultados similares en p53 HCT116
+ /+ y p53 HCT116
- /- células (véase por ejemplo la figura 2E.). Curiosamente aumento de los niveles de ARNm de c-Jun no se observaron en células ARPE19 JNK2-silenciado (Fig. 2F) consistente con la falta de apoptosis en estas células (Fig. 1D).
(A) La proteína total y c-Jun fosforilaciones en S63, S73 y T91 siguientes ya sea irradiación UV (carril derecho) o el silenciamiento inducido por RNAi JNK1 y JNK2. (B) muestra el Esquema
c-Jun
y la amplificación utilizado para la detección de c-Jun en el promotor. anticuerpos (C) totales y formas fosforiladas de c-Jun con destino en el promotor c-Jun detectado por inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) con c-Jun y c-Jun-fosfo-específicos. Histograma muestra plegable enriquecimiento relativo a los controles de IgG (Métodos).
Nuestros resultados identificar los efectos opuestos de JNK1 y JNK2 en c-Jun. En este sentido se diferencian de las observaciones obtenidas usando un método '' genética química catalítica en la que el bolsillo de unión a ATP de JNK2 se amplió por mutación [2]. La conclusión de este último enfoque es que JNK1 y JNK2 tanto regulan positivamente la expresión de c-jun. Sin embargo, es posible que la expansión del bolsillo de unión a ATP de JNK2 puede perturbar la organización molecular espacial de la región de β-strand-como adyacente de la proteína JNK2. Desde este dominio β-capítulo-al igual que es importante para JNK2 interacciones proteína-proteína se sugiere que la perturbación localizada en este sitio puede comprometer las características de unión de la proteína JNK2 por sus sustratos diana. Esto podría afectar el funcionamiento de JNK2 mutante en formas adicionales de los efectos previstos sobre el acceso molecular en el bolsillo de unión del ATP ampliada de JNK2
Otro estudio que compara los fibroblastos murinos derivados de JNK1 -. /- Y JNK2 - /- ratones indicaron que JNK1 y JNK2 pueden funcionar como reguladores de c-Jun oponerse [3]. Nuestros propios resultados, en condiciones basales, son consistentes con este informe y muestran que en HCT116 células da como resultado (i) JNK2 silenciamiento en la regulación de c-Jun mRNA acompañada marcada acumulación de la proteína c-Jun, y (ii) la regulación de c-Jun en estas condiciones depende de JNK1.
sobre regulación de JNK1 en las células JNK2 empobrecido es independiente de c-Jun
Dado que basales sobre regulación de c-Jun (en las células JNK2-agotado) requiere JNK1 (véase más arriba) nos preguntamos si c-jun, a su vez, es necesario para la regulación de la proteína JNK1 siguiente JNK2 silenciamiento (fig. 1B). Sin embargo, el aumento de la JNK1 observado consistentemente en las células JNK2 silenciados no se vio afectada por la co-silenciamiento de c-Jun con JNK2 (Figura 2D;. Panel superior). Esto indica que el aumento de ARNm y la expresión de la proteína JNK1 tras el agotamiento JNK2 es independiente de c-jun.
Hypo-c-Jun fosforilado se une al promotor c-Jun
El estrés inducido S63 /S73 la fosforilación de c-jun por las quinasas JNK libera de c-jun a partir de un complejo inhibidor permitiendo así c-jun de atar y promotores diana transactivate [24]. la fosforilación inducida por estrés de c-Jun en las células HCT116 tratadas con irradiación UV se muestra en la Fig. 3A. Sin embargo, aunque se observó alta acumulación de la proteína c-Jun siguiente silenciamiento JNK2 (Fig 3A;. Carril JNK2 siRNA) esto era independiente de aumento de la fosforilación N-terminal en S63, S73 o S91 a (Fig 3A).
silenciamiento JNK2 induce un marcado aumento en los niveles de ARNm de c-Jun (ver más arriba, Fig. 2E). Preguntar si el aumento de las transcripciones de c-Jun fueron atribuibles, al menos en parte, a un bucle positivo de auto-regulación de retroalimentación se realizó la inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) para c-Jun /c-Jun complejos promotor (Fig. 3B y 3C) . En las células HCT116 no tratados c-Jun fue indetectable en el promotor c-Jun (Fig. 3C, los controles). Después de la irradiación UV c-Jun se fosforiló en S63 y S73 (Fig. 3A) y la proteína fosforilada se une en el promotor c-Jun como se indica por el análisis de chip usando anticuerpos anti-fosfo-T63 /73 c-Jun (Fig. 3C). En las células JNK2-agotado, en condiciones basales, ningún cambio en c-Jun T63 /73 fosforilación fue evidente con respecto a los controles (Fig. 3A). No obstante c-Jun en estas células fue atado en el promotor c-Jun (Fig. 3C). La falta de fosforilación de la cromatina determinada c-Jun se confirmó por la falta de reactividad con anti-fosfo-T63 /73 anticuerpos c-Jun (figura 3C;. Comparar las muestras de las células irradiadas con UV con células JNK2-silenciado). Por lo tanto concluimos que S63 /73 hipo-fosforilados c-Jun se une a su propio promotor tras el agotamiento JNK2 y es probable que contribuya a los altos niveles de expresión de ARNm de c-Jun (aumento ~ 9 veces sobre el control, véase la Fig. 2E) indujo en estas condiciones basales.
acumulación de la proteína c-Jun se correlaciona con pérdida de fosforilación en S243
es posible que c-Jun se mantiene en niveles bajos en las células HCT116, inferior a la observada para la no células: cáncer ARPE19 (datos no mostrados), a través de continua degradación de la proteína c-Jun. La degradación de c-Jun implica la fosforilación C-terminal en S243 que ceba c-Jun para la fosforilación mediada por GSK3 en el T239. Esto genera un sitio de unión para la ubiquitina ligasa E3 Fbw7, resultando en polyubiquitinylation y la degradación de c-Jun [10]. En nuestro estudio hemos observado que el silenciamiento JNK1 causó un aumento leve pero reproducible en c-Jun S243P (véase la figura 4B-4D;. De control de carril cp JNK1 siRNA carril inmunotransferencias S243P). Por el contrario JNK2 silenciar a niveles reducidos de forma reproducible causadas de c-Jun 243P, a veces no detectables a pesar de la acumulación masiva de proteínas totales (Figura 4B-4D;. De control de carril cp JNK2 siRNA para inmunotransferencias S243P). Por lo tanto JNK1 y JNK2 ejercen efectos sobre la fosforilación de c-Jun a S243, una modificación vinculado con de-estabilización de la proteína c-Jun opuestas.
(A) los sitios de esquema que muestra la fosforilación de c-Jun por JNK, GSK -3 y ERK, y sus respectivas consecuencias funcionales. Tenga en cuenta que S243P es un requisito previo de la fosforilación de T239 (indicada por la flecha curva). (B) Las inmunotransferencias que muestra los efectos de JNK1, JNK2 y el silenciamiento GSK3, solos y en combinaciones, en un panel de proteínas celulares HCT116. (C) y inmunotransferencias (D) después de silenciamiento combinatoria de JNK1 y JNK2 con Fbw7 y ERK. (E) los intermedios pro-apoptóticos esenciales determinadas por la co-silenciamiento con JNK2. (F) La apoptosis después de silenciamiento JNK2 en condiciones basales es independiente de Bax como se evidencia por Bax Bax +/- y - /-. Clones de HCT116 isogénicas
GSK3, ERK, Fbw7 y el picor son mediadores esenciales de la basal JNK1 dependiente de apoptosis
en una serie adicional de experimentos de co-silenciamiento se demuestra que quinasas GSK3, ERK, y la ubiquitina ligasa Fbw7 3 son también mediadores esenciales de la apoptosis JNK1 dependiente en las células JNK2-agotado (Fig. 4E). Sin embargo, ninguno de estos componentes apareció a incidir en la fosforilación de S243 o la acumulación de la proteína c-Jun (Fig 4B, 4C y 4D;. Carriles GSK3, Fbw7 y ERK, respectivamente). Esto fue inesperado ya que, en respuesta al estrés, los tres han sido relacionados con la degradación de c-Jun a través S239 y la fosforilación S243 (ERK y GSK3, respectivamente) y la degradación mediada por ubiquitina (Fbw7) [10], [25], [26] . Parece que, en condiciones basales, GSK3, ERK y Fbw7 funcionan como mediadores esenciales de la apoptosis a través de sustratos distintos de C-jun.
Bax y CKII son prescindibles para la ruta apoptótica basal JNK1 /JNK2
Tras el estrés Bax es un mediador pro-apoptótica de JNK inducida por la apoptosis [27], [28]. Para preguntar si Bax también se requiere para la JNK1 vía apoptótica basal /JNK2 reguladas utilizamos isogénica Bax +/- y Bax - células HCT116 [2] - /. silenciamiento JNK2 indujo apoptosis tanto en HCT116 Bax
+/- y HCT116 Bax
- /- las células (Fig 4F.), indicando que Bax no se requiere para la apoptosis en estas condiciones basales. Co-silenciar CKII, una quinasa putativo para c-Jun [3], también falló para rescatar las células HCT116 JNK2-agotado de la apoptosis (Fig. 4E). Así, tanto Bax y CKII aparecen prescindible para la ruta apoptótica JNK1 /JNK2 basal.
La interacción entre c-Jun y PICOR
La vía pro-apoptótica inducida por TNFa culmina en la activación de JNK1 dependiente fosforilada de la tiña, la degradación de c-FLIP y la caspasa 8 de activación (véase la Introducción). Aquí nos muestran que la comezón es también un mediador pro-apoptótica esencial gobernado por JNK1 /JNK2 en condiciones basales y que co-silenciar PICOR con JNK2 rescata a las células de la apoptosis (Fig. 5A y 5B).
(A) y (B) Las proteínas y los niveles de apoptosis observados luego de picar y silenciamiento JNK2 en las células HCT116. (C) Complejos de proteínas comezón-c-Jun endógenos detectados antes de silenciamiento JNK2 se pierden tras el agotamiento JNK2.
Para investigar más a fondo el papel pro-apoptóticos de la tiña en condiciones basales que llevamos a cabo la inmunoprecipitación /inmunotransferencia El análisis de los complejos endógenos de comezón-c-Jun antes y después de silenciamiento mediado por RNAi de JNK2 (Fig. 5C). De manera significativa, los complejos de comezón-c-Jun fueron detectables en condiciones de control, pero estos complejos se perdieron después de JNK2 silenciamiento (Fig. 5C).
Apoptosis tiene lugar a través de c-FLIP y la caspasa 8
Co- silenciando la caspasa 8 con células JNK2 rescatados de la apoptosis (Fig. 4E). Este efecto se limita a condiciones basales desde la caspasa 8 RNAi no para rescatar a la apoptosis después de la irradiación UV (datos no mostrados). c-FLIP silenciamiento solo indujo apoptosis en las células HCT116 [29]. Co-silenciamiento de c-Jun, GSK3, o Fbw7 con c-FLIP no para rescatar células de la apoptosis (Fig. 6A), lo que indica que cada uno de estos intermedios pro-apoptóticos función Up-stream de c-FLIP (Fig. 7A-esquemática ). Por lo tanto las vías de MAP quinasa apoptótica inducida basales y de estrés-convergen en el nivel de c-FLIP. Como era de esperar, co-silenciamiento de caspasa 8 con células rescatados c-FLIP de la apoptosis (Fig. 6A y 6B).
(A) Los niveles de apoptosis observados después co-silenciamiento de c-FLIP con mediadores pro-apoptóticos . (B) Los niveles de proteína que muestra la procaspasa 8 división y acumulación de c-Jun tras el agotamiento de c-FLIP por RNAi.
(A) Esquema que muestra tipo salvaje de c-Jun (wt-c-Jun) y no phosphorylatable mutante de c-Jun construye. V medida (B) Anexina de la apoptosis después de la sobreexpresión de peso-c-Jun o mut-c-Jun como se indica. (C) Las inmunotransferencias que muestran c-Jun siguiente sobreexpresión total y fosforilada, el control de carga SIRT1 muestran. (D) Los niveles de apoptosis tras el tratamiento combinado de siRNA en presencia o ausencia de especies no objetivo mut-c-Jun, (ver materiales y métodos).
La sobreexpresión de la exógenos induce c-Jun apoptosis
Nos preguntó a continuación si la expresión de alto nivel de c-Jun sola es suficiente para inducir la apoptosis. La sobreexpresión de tipo salvaje exógena apoptosis inducida por c-Jun en las células cancerosas HCT116 (Fig. 7A y 7B). Es importante destacar que la sobre expresión de un mutante de la fosforilación de c-Jun, en la que S63, S73, T91 y T93 están mutados a alanina, la apoptosis también inducida por tanto pruebas vuelve a hacer cumplir para las funciones de pro-apoptóticos de la hipo-fosforilados c-Jun (Fig . 7A y 7B). Tenga en cuenta que la expresión exógena de otra proteína, SIRT1, no induce la apoptosis en las células HCT116 [22] lo que indica que los presentes resultados son específicos de c-jun. La expresión proteica de las construcciones y la fosforilación de los mismos c-Jun, indican la fosforilación en todos los sitios examinó el tipo salvaje de c-Jun (Fig. 7C). Esto es indicativo de estrés celular en respuesta a gen exógeno sobre-expresión. Tenga en cuenta que este es en contraste con el estado hipo-fosforilados c-Jun sostenida tras el silenciamiento de genes mediada por RNAi en las condiciones basales empleadas largo de este trabajo (véase por ejemplo la Fig. 3A). El mutante de la fosforilación de c-Jun carecía de reactividad con anti-fosfo-S63, S73 y T91 como se esperaba anticuerpos (anticuerpos contra fosfoserina 93 no estaba disponible). Aunque ambos de tipo exógenos proteínas c-Jun mutantes y salvajes fueron fosforilados en T239 y S243 (Fig. 7C) creemos que esto era no esencial para la inducción de la apoptosis puesto que se requiere endógena c-Jun para la apoptosis a pesar de la falta de fosforilación C-terminal (ver por ejemplo la Fig. 4B-4D siguiente silenciamiento JNK2). De manera significativa, la sobre expresión de c-Jun exógeno no indujo apoptosis en células de cáncer no ARPE19 (Fig. 7B). Estas observaciones generales más volver a hacer cumplir nuestras conclusiones (i) que los niveles elevados de hipo-fosforilados c-Jun son pro-apoptótica en células cancerosas HCT116, y (ii) que el efecto es específico para las células cancerosas (HCT116) y no se observó