colorrectal
Extracto
Antecedentes
de cáncer colorrectal (CCR) la investigación se ha beneficiado en gran medida de la disponibilidad de modelos animales de tumores pequeños. modelos espontáneos e inducidos químicamente-CRC son ampliamente utilizado todavía limitados en su parecido con la enfermedad humana y con frecuencia se prolongan, no repetitivo con precisión, y asociados con efectos secundarios inflamatorios. In-situ murino o de la implantación del tumor humano en el tracto gastrointestinal de los ratones es extremadamente difícil, y limitado por la variabilidad entre animales y complicaciones relacionadas con el procedimiento y la mortalidad. Como resultado, en los estudios frecuentes CRC se implanta en sitios distales, más comúnmente la región subcutánea, un enfoque que se limita en gran medida por la ausencia de medio tumor gastrointestinal normal y tiene efectos sustanciales sobre el desarrollo de tumores.
Objetivos
en este estudio tuvo como objetivo desarrollar una herramienta repetitiva bien tolerado para estudiar CRC en pequeños animales mediante la adaptación del sistema de colonoscopia murino para servir como una plataforma para el colon sub-mucosa implantación ortotópico de células tumorales CRC humanos y murinos.
resultados
se presenta el establecimiento de un nuevo modelo de CRC pequeña animal que es mínimamente invasivo, rápido, bien tolerado, altamente reproducible, y confiere un control preciso del número de tumor, su localización y el crecimiento tarifa. Por otra parte, nos muestran que este modelo permite únicamente la inducción de lado a lado de diferentes tumores manipuladas genéticamente, lo que permite el estudio de la interacción mecánica del tumor y la diafonía dentro del microambiente intestinal nativa.
Conclusiones
el empleo de este nuevo enfoque puede representar un avance técnico importante para el
in vivo
estudio de CRC
Visto:. Zigmond E, Z Halpern, Elinav E, E Brazowski, Jung S , Varol C (2011) Utilización de la colonoscopia para murino ortotópico Implantación de cáncer colorrectal. PLoS ONE 6 (12): e28858. doi: 10.1371 /journal.pone.0028858
Editor: Vladislav V. Glinskii, Universidad de Missouri-Columbia, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Julio, 2011; Aceptado: 16 de noviembre de 2011; Publicado: December 12, 2011
Derechos de Autor © 2011. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por la enfermedad de Crohn & amp; Colitis Foundation of America (CCFA) (a S. J., número - 7108160101; página web: www.ccfa.org). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
de cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa de mortalidad por cáncer en muchos países industrializados [1]. CRC modelos en animales pequeños han proporcionado herramientas importantes para la investigación de los mecanismos etiológicos y fisiopatológicos subyacentes de la Convención de desarrollo y para la evaluación preclínica de nuevas modalidades terapéuticas. Numerosos modelos murinos de CRC se han desarrollado y descrito en la literatura [2], [3]. Los principales enfoques incluyen ratones mutantes que desarrollan tumores espontáneos, el tratamiento con una amplia gama de agentes cancerígenos, con o sin inducción de la inflamación crónica, y la implantación ectópica o ortotópico de células tumorales.
espontáneas CRC cepas de ratón transgénico estrechamente imitan síndromes de cáncer humano, como el cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC) [4] y familiar adenomatosis poliposis (FAP) [5]. Estos modelos se han demostrado muy valiosa para el estudio de los efectos de las alteraciones genéticas conocidas en el curso de la enfermedad. Sin embargo, muchos de estos modelos de ratón formar adenomas principalmente en el intestino delgado, y por lo general se asocian con una tasa de crecimiento lento y una considerable variabilidad entre los animales [3] El Apc
cepa Min /+ ratón se estableció sobre la base de los resultados obtenidos de un estudio de mutagénesis de la línea germinal con N-etil-N-nitrosourea combinada con la detección fenotípica [5]. Aunque este modelo se asocia con la aparición de un gran número de adenomas benignos en el intestino delgado, tumores de CRC se desarrollan en menos de la mitad de los animales. Sin embargo, el tratamiento de estos ratones con el azoximetano agente cancerígeno (AOM) aumenta sustancialmente la incidencia de tumores en el colon de estos ratones, y este modelo ha demostrado ser útil para estudiar los efectos de los compuestos quimiopreventivos [6], [7].
modelos de ratón inducibles CRC, por otra parte, se basan comúnmente en el uso de diversos compuestos cancerígenos, tales como azoximetano (AOM), 1,2-dimetilhidrazina (DMH) y otros [2]. Los tumores establecidos inducidos químicamente comparten muchas de las características histopatológicas de no CCR hereditario humano [2], [8]. desarrollo de tumores en estos modelos se ha informado de que en el intervalo de 30 semanas. En particular, la combinación del compuesto cancerígeno con la inflamación crónica, tal como en el caso del sulfato de OMA /dextrano sódico modelo (DSS), ha demostrado para acortar el tiempo de latencia observado en el modelo clásico a alrededor de 10 semanas y para orientar la inducción de tumores principalmente al colon distal [8], [9]. Estas ventajas, así como su alta potencia, el modo sencillo de aplicación, amplia gama de susceptibilidad, y la eficiencia de costes relativa, han hecho de este modelo muy común en la investigación CRC, y una excelente herramienta de investigación para estudiar los eventos tempranos cancerígenas y para evaluar el potencial terapéutico enfoques [2], [8]. Sin embargo, en este modelo los tumores se desarrollan bajo las influencias ambientales de la inflamación crónica, una condición que imita la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) -asociado CRC pero no el mucho más común esporádica CRC humano. Es importante destacar que todos los CRC
in- vivo y modelos mencionados anteriormente sufren de una incapacidad inherente para controlar el número de tumores y la cinética de crecimiento.
Varios modelos murinos CRC ortotópico se han descrito, la mayoría de los cuales requieren un operativo enfoque para la inyección o implantación de las células cancerosas en el colon o capas cecales [10], [11]. La complejidad del procedimiento quirúrgico, trauma resultante, la inflamación y la mortalidad relacionada con el procedimiento, limitar gravemente el valor de estos sistemas para el estudio de las respuestas inmunes anti-tumorales innata y adaptativa.
En los seres humanos, el examen endoscópico de la colon es el método más importante para el descubrimiento y seguimiento de la atención de la CRC. Recientemente,
in vivo
endoscopia murino se ha desarrollado permite una alta resolución de imagen del colon en ratones vivos, y que permite a los investigadores visualizar directamente y cambios en la puntuación de tejidos patológicos en el colon [12], [13] y en el comercio intra órganos Kin-abdominal [14]. Por otra parte las intervenciones tales como biopsias repetibles de lesiones de colon en ratones vivos durante el período de seguimiento de un experimento y su posterior análisis proteómicos han introducido nuevas herramientas poderosas para el CDN de investigación [15].
Se presenta aquí por primera vez una adaptación del sistema de colonoscopia murino y su empleo para el establecimiento de un nuevo modelo ortotópico murino de CRC. Este enfoque ofrece una solución fácil y directa a las limitaciones técnicas asociadas a los modelos existentes de CRC.
Resultados
Establecimiento de modelo ortotópico murino de CRC utilizando el sistema de colonoscopia murino
Pequeño endoscopia animal se considera hoy en día como la herramienta estándar de oro para la vigilancia de las enfermedades inflamatorias del colon y CRC. Con el fin de adaptar este sistema a los efectos de la implantación de las células tumorales ortotópico de CRC en el sub-mucosa colónica especialmente hemos diseñado una aguja hipodérmica que puede pasar a través del canal de trabajo vaina endoscópica del sistema miniendoscopic Karl Storz Coloview. Las agujas hipodérmicas fueron hechas a medida de acuerdo a nuestra especificación por Cadence Inc. U.S.A., y están hechos de acero inoxidable largo y flexible de 8 pulgadas flexibles, con diámetros exteriores calibre 30, y un bisel corto a un ángel de 45 grados (Figura S1). Esta aguja hipodérmica confiere varias ventajas de diseño; el acero flexible junto con las dimensiones de la aguja a aliviar la maniobra de inyección y permitir el paso suave a través del canal de trabajo y el bloqueo Luer, que se atornilla sobre el mismo para evitar fugas de aire. Por otra parte, el bisel romo permite la inyección en la submucosa con un menor riesgo de perforación o derrame del material inyectado al lumen. Examinamos primero la distribución tisular de los reactivos inyectados y se evaluó el volumen de inyección adecuado mediante la inyección de tinta de marcado de tinta India en la capa sub-mucosa colónica. Un volumen de inyección de 50 l dio la mejor combinación de fuga mínima y dispersión focal de la tinta por debajo de la capa epitelial (Figura 1A). Enrojecimiento de la luz del colon mediante la aplicación de solución salina a través de la vaina examen del endoscopio confirmó la localización de la tinta inyectada debajo de la capa epitelial (Película S1). El análisis histológico confirmó que la tinta de la India es retenida dentro de la lámina propia del colon incluso 5 días después de su inyección ortotópica (Figura S2A). Es importante destacar que, el análisis histológico de ratones inyectados con estéril de Dulbecco salina tamponada con fosfato sin calcio y sin magnesio (PBS
- /-) reveló una arquitectura colónica normal y saludable en el lugar de la inyección, confirmando que este método es mínimamente invasiva (Figura S2B)
(a) la colonoscopia imagen presentación de la inyección submucosa del colon de tinte India-tinta de ratón C57BL /6 para la evaluación del volumen de inyección adecuado y su distribución en la lámina propia del colon. (B) colonoscopia imágenes representativas que indican el desarrollo progresivo del tumor CRC dentro de la misma C57BL 6 del ratón /después de la implantación ortotópica de 1 × 10
5 células MC38 CRC a partir del día 5, a través de los días 12 al día 19. (C-D) imagen representativa de espécimen de histología teñidas con hematoxilina y eosina (H & amp; e) y aislado de sitio de la inyección del colon en el día 14 después de la inyección de 1 x 10
5 células MC38 CRC. Aumentos: C- [x40], D - [x100]. Nota la zona límite entre el tumor y la mucosa normal adyacente y la proyección del tumor a través de la capa epitelial en el lumen. (E) la imagen representativo que muestra H & amp; E tinción de la muestra de histología de murino-CRC tumor generada 5 días después de la implantación ortotópica de las células tumorales MC38 CRC en ratones C57BL /6 (ampliación x40). (F) imagen que muestra GFP etiquetados células tumorales microscópicas fluorescentes y su difusión a través de la capa epitelial hacia el lumen (ampliación x100). Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
El tumor de colon murino MC-38 es un adenocarcinoma de grado III, que fue inducida químicamente en un C57BL hembra 6 del ratón /y utilizado desde entonces como un tumor de ratón trasplantables modelo [16]. Para probar la viabilidad del método de la implantación del tumor ortotópico, inyectamos 1 × 10
5 células tumorales MC38 CRC en el colon sub-mucosa de ratones C57BL /6 singénicos. colonoscopia repetitivo de ratones receptores reveló el rápido desarrollo progresivo del tumor irrumpir en la luz intestinal específicamente en el sitio de inyección. clasificación endoscópica de acuerdo con el tamaño del tumor con relación a la circunferencia del colon, según lo establecido por Becker et al [12], reveló el crecimiento progresivo del tumor de grado 1 en el día 5 de grado 4 por día 12 y alcanzando grado 5, que ocupa casi la totalidad del colon circunferencia, sólo día 19 (Figura 1B, y de la película S2). Hematoxilina y eosina (H & amp; E) tinción de secciones de histología reveló una arquitectura típica de CRC de los tumores con mucosa normal adyacente y la proyección del tumor a través de la capa epitelial en el lumen (Figura 1C, D). El análisis histológico del tejido del colon aislado de ratones sometidos a la implantación ortotópica de 1 x 10
5 células CRC MC38 que expresan GFP confirmó el establecimiento de un tumor pequeño dentro de la lámina propia y la penetración de tumor derivado GFP
+ células a través de la capa epitelial ya para el día 5 (Figura 1E, F). Usando este método, también hemos sido capaces de inducir de manera eficiente la formación de tumores CRC humanos mediante la implantación de los humanos CRC líneas celulares SW620, SW480, LS174T y HT-29 en ratones desnudos o NOD /SCID receptores inmunodeficientes (Figura S3 A). evaluación patológica de los tumores humanos CRC ortotópica establecidos utilizando este modelo han confirmado una alta similitud con CRC tumores aislados de pacientes humanos (Figura S3B). En concreto, CRC tumores humanos formados por la implantación ortotópico de células LS174T y HT29 mostraron histológico internacionales características del diferenciadas adenocarcinoma de colon tales como estructuras glandulares alineados con el epitelio neoplásico que contienen células caliciformes y material necrótico luminal, mientras que las células CRC humanos del SW620 formaron una morfología típicos de los tumores de mal a carcinoma indiferenciado con los patrones anidados y difusas y la falta de formación tubular (Figura S3 B). Curiosamente, se formaron las líneas celulares de CRC humanos tanto HT29 y LS174T de un adenocarcinoma primario de colon, mientras que el SW620 se estableció a partir de una metástasis de los ganglios linfáticos.
A fin de evaluar la cinética de crecimiento de los tumores de CRC que usa este método inyectamos ratones C57BL /6 con cantidades distintas de células MC38 (células 10E3, 10E4 y 10E5) y seguimos a la circunferencia del colon y el grado de desarrollo de los tumores establecidos a través del tiempo mediante colonoscopia (Figura 2A). Los resultados gráficamente resumen en la Figura 2B muestran que la cinética de crecimiento del tumor fue en correlación directa con la cantidad de células inyectadas que alcanzan la circunferencia de colon de 21% (+/- 4,22), 54,1% (+/- 7,0), y 80% (+ /-7.2) 3 semanas después de la inyección de 10
3, 10
4 y 10
5 células MC38, respectivamente. El análisis estadístico comparando cada punto de tiempo (1,2 y 3 semanas) para los diferentes grupos (10E3, 10E4 y células 10E5) confirmó diferencias significativas (al menos p & lt; 0,05) en todos los puntos de tiempo para porcentaje de la circunferencia del colon, así como para el grado del tumor. Excepcional fue la comparación del grado tumoral entre el 10E4 & amp;. 10E5 grupos en la semana 3 como la mayoría de los tumores en estos grupos ya eran de grado 5, que incluye todos los tumores por encima del 50% de la circunferencia del colon
(A) Representante imágenes colonoscopia que demuestran la correlación entre la cantidad de células tumorales MC38 inyectados y el tamaño de los establecidos CRC tumorales 3 semanas después de la implantación de células tumorales ortotópico. (B) Los gráficos que resumen la cinética de crecimiento, porcentaje circunferencia y grado de desarrollo de tumor de colon en correlación con la cantidad de células MC38 CRC inyectados. Tenga en cuenta el rápido establecimiento de tumores de grado 5 ya 2 semanas después de la implantación de sólo 1 × 10
5 células MC38-CRC. Cada grupo estaba formado por 5 ratones.
En conjunto, se estableció aquí un nuevo método para la implantación eficiente de ortotópico CRC tumores utilizando la endoscopia murino de una manera rápida y invasiva mínima, con una cantidad limitada de células requerido para inyección, y con un control absoluto sobre la incidencia, la ubicación y la cinética de crecimiento del tumor.
ortotópico la implantación de las células tumorales CRC-manipuladas genéticamente
Uno de los beneficios de la implantación de cáncer más modelos de tumores espontáneos en desarrollo es la capacidad de modificar genéticamente el tumor establecido. Como prueba de principio, inyectamos ratones Balb /c con 1 × 10
5 células CT26 CRC murinos, que previamente habían sido manipuladas genéticamente para expresar luciferasa. Whole bioluminiscencia cuerpo de imágenes ópticas (Biospace de fotones de imágenes) reveló la existencia de un tumor CRC específicamente alrededor del sitio de la inyección que podría estar más lejos semi-cuantificado de acuerdo con su luminiscencia emitida (Figura 3A). En particular, este enfoque puede ser útil para la evaluación de las cargas tumorales sin la necesidad de sacrificar los ratones. Una ventaja adicional genuino del modelo de implantación endoscópica es la capacidad de implantar varios tumores todavía distintas adyacentes en el mismo ratón, que fueron modificadas genéticamente para sobreexpresar o silenciar genes de interés, lo que permite su comparación directa en un medio de acogida idénticos. El uso de un sistema reportero lentiviral, transduced dos genes reporteros fluorescentes distintos en la línea celular MC38 para establecer el MC38-GFP y líneas MC38-RFP (Figura 3B panel superior izquierdo). La inyección de las células MC38-GFP y adyacente a ellos las células MC38-RFP dieron como resultado la co-formación de dos tumores genéticamente idénticos que varían sólo por su ubicación y la expresión de los genes indicadores insertados (Figura 3B inferior izquierda del panel y el panel de la derecha) .
(A) un código de colores imagen representativa de toda la bioluminiscencia cuerpo de imágenes ópticas de los ratones BALB /c 2 semanas después de la inyección submucosa de PBS
- /- (botón izquierdo del ratón) o 1 × 10
5 células tumorales CT26 que expresan luciferasa CRC y 10 minutos después de la inyección intraperitoneal de D-luciferina. Tenga en cuenta la emisión de luminiscencia específicamente de la zona de las células tumorales inyectadas CRC (ratón derecha). (B) Parte superior izquierda del panel - imagen estéreo-microscopio fluorescente superpuesta sobre una imagen gráfica foto de receptor C57BL /6 de colon de ratón 3 semanas después de su inyección ortotópico con células MC38 CRC que fueron genéticamente manipulados por el sistema reportero lentiviral expresar RFP, x10 aumentos. Abajo a la izquierda del panel - imagen de la colonoscopia de colon C57BL /6 de ratón ortotópico después de la implantación de las células tumorales MC38 2 CRC adyacentes; MC38-RFP (flecha roja) y MC38-GFP (flecha verde). Panel derecho - imagen estéreo-microscopio fluorescente superpone una imagen fotográfica gráfica del destinatario ratón C57BL /6 se abrió de colon 2 semanas después de la inyección de lado a lado ortotópico de MC38-RFP (distal) y las células tumorales MC38-GFP (proximales) CRC en, x10 aumentos. Nota la inducción de 2 CRC tumores adyacentes que difieren sólo por la expresión del gen reportero transducidas. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
Discusión
este reporte se describe un novedoso modelo ortotópico murino CRC en base a la adaptación del sistema miniendoscopy disponible en el mercado que confiere muchas ventajas en comparación con conocidos modelos CRC murino. Es un fácil de emplear, mínimamente invasiva, y procedimiento altamente reproducible que se puede utilizar en los ratones de cualquier fondo genético. En este modelo los dos CRC-tumores murinos y humanos pueden ser inducidos. El modelo permite también un control preciso de la incidencia de tumores y la ubicación dentro del colon. Además, este método permite el control absoluto sobre la cinética de crecimiento del tumor; puede ser muy rápida grado alcanzar los 5 en 2 semanas después de la implantación de sólo 1 × 10
5 células tumorales, o se puede reducir la velocidad mediante la inyección de bajo número de células. Es importante destacar que este enfoque evita daños colaterales y la inflamación visto en muchos de los otros modelos actualmente empleadas. Además, permite únicamente la inducción de tumores CRC-manipuladas genéticamente y la comparación de varios tumores distintos de lado a lado establecidos en el mismo ratón evitando la variabilidad inter-animal.
implantación subcutánea ectópica de líneas de células tumorales se utiliza ampliamente como una herramienta de investigación, especialmente para la evaluación de las intervenciones terapéuticas citostáticos [17]. Sin embargo, la implantación ectópica no tiene en cuenta la complejidad de la composición característica única del microambiente nativo. De hecho, ha sido bien establecido que el estroma huésped incongruente puede afectar la tumorigenicidad y la regulación del ciclo celular en comparación con la implantación en el lecho de tejido nativo [18], [19]. La ventaja de elegir un enfoque ortotópico es de particular importancia para el medio intestinal, que es el hogar de entidades celulares y moleculares únicas inmunológicas que reside en la interacción continua con la microbiota y la exposición constitutiva a antígenos de la dieta.
Rendimiento de más de 200 implantaciones CRC ortotópico que utilizan este método se ha asegurado de que este modelo es bien tolerado y altamente reproducible. Sin embargo, una posible complicación del procedimiento es la perforación del colon y, potencialmente, la fuga de aire y células de la cavidad peritoneal. Actualmente, en nuestras manos, esta complicación es poco común, constituyendo menos del 5 por ciento de todos los procedimientos. La mortalidad durante el procedimiento es extremadamente raro y puede ocurrir debido a la anestesia o perforación. la incidencia de tumores en ratones supervivientes (95%) es 100%, siempre que culminó en un desarrollo de tumores único específicamente en el sitio de inyección. Es de destacar que el uso de un endoscopio rígido permite el acceso sólo a la media distal del colon y, por tanto, restringe la implantación ortotópica por este enfoque a esta área.
CRC sigue siendo la segunda causa principal de mortalidad por cáncer en muchos países industrializados. Los experimentos realizados en animales pequeños han demostrado ser esenciales para la comprensión de la fisiopatología de la enfermedad, así como para la evaluación preclínica de nuevas modalidades terapéuticas. Sin embargo, los modelos murinos de CRC están limitados en su similitud con las enfermedades humanas. Esto es especialmente cierto en relación con la formación de metástasis tumorales CRC. Una desventaja notable de modelos murinos de CRC es la falta general de fenotipo invasivo y metastásico [2]. En el modelo /DSS AOM se describieron cuerdas infiltrantes de células epiteliales para romper la muscularis mucosa y alcanzar también el sistema linfático sub-mucosa, aunque con muy poca frecuencia [20]. Del mismo modo, rara vez testigos de la invasión local de tumores derivados de células, pero nunca detectar metástasis distales usando nuestro enfoque. La cinética de crecimiento relativamente rápidos asociados con nuestro modelo, que coacciona a principios del sacrificio de los ratones implantados que cuidan un CRC tumor de grado 5, es probable que cada vez una desventaja para la inducción de un tumor metastásico. De hecho, incluso la implantación ortotópica de células CRC humanos, se sabe que son agresivamente metastásico, no inducir un tumor metastásico. El obstáculo común compartida por los modelos murinos de CRC para establecer un tumor metastásico puede implicar que el medio intestinal murino no es de apoyo de la formación de metástasis. Sin embargo, esto puede ser convertirse en un sistema modelo deseado para aquellos que deseen investigar el posible papel de los genes malignos. En apoyo de esto, nuestro sistema puede ser utilizado para inducir la formación de tumores manipuladas genéticamente en la que los sobre-expresa o silenciar genes de interés.
Creemos que este nuevo modelo ortotópico CRC representa un avance técnico importante para los
in vivo
estudio de CRC, y pueden ser utilizados sobre todo para investigar nuevas modalidades terapéuticas, la genética del tumor y los mecanismos de crecimiento, y sus interacciones en el contexto del microambiente intestinal nativa.
Métodos
Ética Declaración
Todos los estudios con animales fueron aprobados por el centro Médico Sourasky comité de ética de Tel Aviv por estudios en animales y se ajustaban a los más altos estándares internacionales de cuidado humano de animales en la investigación biomédica. Número de aprobación del comité -. 037_b3428_8
Animales
8-10 semanas de edad, machos C57BL /6, Balb C y ratones desnudos atímicos se obtuvieron a partir de Harlan Biotech (Rehovot, Israel). Los ratones SCID de 8-10 semanas de edad, machos NOD fueron amablemente proporcionados por el prof. Tsvee Lapidot (Instituto de Ciencia Weizmann, Rehovot, Israel).
ratones desnudos atímicos fueron irradiados sub-lethaly (450 rad) antes de la implantación ortotópica de líneas celulares de CRC humanos para eliminar inmuno-rechazo. Los animales tuvieron libre acceso a comida y agua, fueron alojados en habitaciones de temperatura y humedad controladas, y se mantuvieron en un ciclo de 12 horas de luz /oscuridad.
Colo-rectal células tumorales
murino 6 células tumorales C57BL /CRC (MC38) fueron amablemente proporcionados por el Dr. Avi Eisenthal (Tel Aviv Sourasky Medical Center). células murinas transfectadas luciferasa stably- CRC tumorales (CT26) fueron amablemente proporcionados por el Prof. Lea Eisenbach (Instituto de Ciencia Weizmann en Rehovot, Israel). Los humanos tumorales CRC líneas celulares SW620, SW480 y LS174T fueron amablemente proporcionados por el prof. Zelig Eshhar (Instituto de Ciencia Weizmann, Rehovot, Israel). La línea celular humana CRC HT-29 fue el generoso regalo del Dr. Isabel Zvibel (Tel-Aviv Sourasky Medical Center, Tel-Aviv, Israel). Todas las líneas celulares se mantuvieron en 5% de CO
2 a 37 ° C en alto DMEM glucosa medio suplementado con: 10% de suero bovino fetal, 1% de penicilina solución de antibiótico estreptomicina, solución de L-glutamina 1%, y 1% de sodio solución de piruvato.
Generación de células tumorales MC38 CRC expresan GFP o RFP
p>
sistema endoscópico murino
Se empleó un sistema de video endoscópica ratón alta resolución ( '' sistema Coloview '') descrito anteriormente para los procedimientos endoscópicos murino [12] - [14] que consta de un endoscopio miniatura (alcance 1,9 mm de diámetro exterior), una fuente de luz de xenón, una cámara de triple de chip, y una bomba de aire para lograr la inflación regulada del intestino de ratón (Karl Storz, Tuttlingen, Alemania). El procedimiento endoscópico fue visto en un monitor de color y grabado digitalmente en la cinta.
ortotópico colon sub-mucosa implantación de células CRC
Los ratones fueron anestesiados utilizando ketamina /xilazina. inyecciones sub-mucosa se llevaron a cabo utilizando acero inoxidable flexible de acero; 8 pulgadas de largo, 30 de ancho y 45 grados de bisel agujas hipodérmicas por encargo según nuestra especificación (Cadence Inc. U.S.A.). La aguja se inserta a través de bloqueo Luer (Söllner, GmbH) atornillada en el canal de trabajo del ámbito de aplicación para evitar fugas de aire. Posteriormente, el ámbito de aplicación se inserta en el colon de ratón y siguiendo su inflación la aguja fue llevado a través del canal de trabajo a la parte delantera del ámbito de aplicación. El procedimiento de implante de células CRC fue realizado por dos personas coordinadas; una persona navegaba la colonoscopia, mientras que la otra persona estaba operando la maniobra de inyección. La inyección se realiza bajo observación por una penetración sub-mucosa muy suave con el lado abierto del bisel partida en un ángulo plano. A continuación, se inyectó un volumen de 50 microlitros CRC células tumorales en el sub-mucosa del colon.
in vivo de imágenes
Para seguir la implantación del tumor CT26 CRC luciferasa que expresan y crecimiento en ratones BALB /c, 50 l D-luciferina (30 mg /ml) fue ip inyecta 10 minutos antes y posteriormente los ratones se insertan en la cámara oscura cerrada de todo el cuerpo enfriado cámara CCD sistema de fotones Imager (Biospace Lab, Francia) . Para
in vivo visualización Red de GFP y RFP tumores positivos sistema de microscopía estereoscópica fluorescente Leica MZ16F se utilizó (Leica Microsystems, Alemania).
Histología
Los tejidos se fijaron en 4% paraformaldehído durante la noche a 4 ° C, se incluyeron en parafina, se seccionaron en serie (15 micras), y se tiñeron con hematoxilina y eosina (Sigma).
se observaron
Diapositivas utilizando el microscopio Olympus BX51, y la adquisición de imágenes se realizó con el Olympus DP70 cámara y el software DP-Manager.
CRC cinética del crecimiento tumoral
C57BL /6 ratones fueron ortotópica sub-mucosa inyectados con 10
3, 10
4, o 10 células
5 MC38. circunferencia del colon del tumor y la etapa de desarrollo fueron controlados en el tiempo mediante colonoscopia cada semana durante 3 semanas después de la implantación de células. clasificación endoscópica se realiza de acuerdo con el tamaño del tumor con relación a la circunferencia del colon según lo establecido por Becker et al [12]. En pocas palabras, el tamaño del tumor se clasificó de la siguiente manera: Grado 1 (solo tumor detectable), grado 2 (tumor que cubre hasta 1/8 de la circunferencia del colon), Grado 3 (tumor que cubre hasta 1/4 de la circunferencia del colon), Grado 4 (tumor que cubre hasta 1/2 de la circunferencia del colon) y Grado 5 (tumor que cubre más de 1/2 de la circunferencia del colon).
Análisis estadístico
los resultados fueron analizados por ANOVA de una sola vía y análisis post con pruebas de comparación múltiple de Bonferroni.
Apoyo a la Información
Figura S1.
especialmente diseñada agujas hipodérmicas usadas para inyectar de forma ortotópica las células tumorales en la sub-mucosa del colon. Las agujas hipodérmicas están hechos de acero inoxidable flexible de 8 pulgadas de largo, con un diámetro exterior de calibre 30, y un bisel corto a un ángel de 45 grados. Tenga en cuenta que la aguja se inserta a través de la cerradura de Luer que se atornilla posteriormente en el canal de trabajo del endoscopio para evitar fugas de aire
doi:. 10.1371 /journal.pone.0028858.s001
(TIF)
figura S2.
inyecciones sub-mucosos de PBS
- /- y tinta china. Imágenes representativas de las muestras histológicas teñidas con hematoxilina y eosina (H & amp; E) y aislado del lugar de la inyección del colon en el día 5 después de la inyección de 50 l de (A) tinta china (ampliación x40), (B) de tinta de la India (x100 aumentos), (C) PBS
- /-, tenga en cuenta la arquitectura normal y saludable del colon. Los datos son representativos de tres experimentos independientes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0028858.s002 gratis (TIF)
Figura S3. inducción
ortotópico de CRC tumores humanos en ratones inmunodeficientes. (A) Imágenes representativas de las muestras histológicas teñidas con hematoxilina y eosina (H & amp; E) y aislados en el día 35 después de la inyección ortotópico (2 × 10
5 células cada una) de las líneas celulares de CRC humanos: SW620, SW480, LS174T y HT29 en ratones desnudos irradiados NOD /SCID o sub-letalmente. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. (B) Comparación de histo-patológicas entre CRC tumores humanos establecidos por la implantación ortotópica de SW620, HT29 y LS174T en ratones inmunodeficientes y adenocarcinoma colorrectal humano
doi:. 10.1371 /journal.pone.0028858.s003
(TIF)
película S1.
endoscópica imágenes en vivo de la inyección submucosa de tinte tinta china. Representante imágenes de vídeo endoscópica que muestre el procedimiento de inyección de contraste entre la India y tinta en el colon sub-mucosa de ratones C57BL /6 utilizando el sistema de colonoscopia ratón. Tenga en cuenta la distribución focal sub-epitelial del medio de contraste inyectado y su restante tras el lavado del colon
doi:. 10.1371 /journal.pone.0028858.s004 gratis (WMV)
película S2.
endoscópica imágenes en vivo del crecimiento progresivo localizada de un CRC-tumoral después de su implantación ortotópico. imágenes de vídeo endoscópica que muestra la implantación ortotópica de células CRC-tumorales y el crecimiento progresivo del tumor como resultado, específicamente en el sitio de inyección y en diferentes puntos de tiempo dentro de la misma destinatario
doi:. 10.1371 /journal.pone.0028858.s005 gratis (WMV)
Reconocimientos
Nos gustaría agradecer profundamente Elinor Elmaliah para la asistencia de cultivo de tejidos, Michael Kaplan para la ganadería, Elias Shezen para el trabajo histológico, e Ido Kilemnik (Medi CEO -Tate, Israel) por su generosa contribución en el diseño de las agujas hipodérmicas. También nos gustaría agradecer al Prof. Lea Eisenbach y el Prof. Zelig Eshhar (Instituto de Ciencia Weizmann, Rehovot, Israel) por la línea de células CT26-luciferasa murino CRC y el SW480, SW620 & amp; CRC líneas celulares humanas LS174T, respectivamente.