Extracto
El cáncer de pulmón es uno de los tipos más comunes de cáncer y causa 1,38 millones de muertes al año, a partir de 2008 en todo el mundo. La identificación de los agentes contra el cáncer de pulmón naturales se ha convertido en muy importante. ácido Gambogenic (GNA) es uno de los compuestos activos de Gamboge, una medicina tradicional que se utilizó como un purgante drástico, emético, o vermífugo para el tratamiento de la tenia. Recientemente, cada vez más pruebas ha indicado que GNA ejerce efectos antitumorales prometedores; Sin embargo, el mecanismo subyacente sigue siendo poco clara. En el presente trabajo, hemos encontrado que GNA podría inducir la formación de vacuolas, que estaba vinculado con la autofagia en las células HeLa y A549. Estudios posteriores revelaron que GNA desencadena el inicio de la autofagia en base a los resultados de la tinción MDC, la tinción AO, la acumulación de LC3 II, la activación de Beclin 1 y la fosforilación de p70S6K. Sin embargo, la degradación de p62 fue interrumpido y GFP libre no podría ser liberado en las células tratadas GNA, lo que indica un bloqueo en el flujo de la autofagia. Estudios posteriores demostraron que GNA bloquea la fusión entre autofagosomas y lisosomas mediante la inhibición de la acidificación en los lisosomas. Este autofagia disfuncional juega un papel pro-muerte en las células tratadas con GNA mediante la activación de p53, Bax y la caspasa-3 escindida, mientras que la disminución de Bcl-2. Beclin 1 desmontables disminuyó en gran medida la muerte celular GNA inducida y los efectos sobre p53, Bax, caspasa-3 y Bcl-2 escindido. Se obtuvieron resultados similares usando un modelo de xenoinjerto. Nuestros resultados muestran, por primera vez, que GNA puede causar la autofagia aberrante para inducir la muerte celular y puede sugerir la posible aplicación de GNA como una herramienta o drogas viable en terapias contra el cáncer
Visto:. Mei W, Dong C , Hui C, Bin L, Fenggen Y, Jingjing S, et al. (2014) Las células Ácido Gambogenic Muertes del cáncer de pulmón a través aberrante autofagia. PLoS ONE 9 (1): e83604. doi: 10.1371 /journal.pone.0083604
Editor: Eric Asselin, Universidad de Quebec a Trois-Rivières, Canada |
Recibido: 18 Junio, 2013; Aceptado: 5 Noviembre 2013; Publicado: 10 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Mei et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, Nº 81173600 (Q.-L. Li); la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de la provincia de Anhui, China, Nº 11040606M190 (Q.-L. Li) y el Proyecto Clave en el Nacional de Ciencia & amp; Tecnología Programa Pilar 2009ZX09103-399 (Q.-L. Li, Co-PI). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón ha sido uno de los tipos más comunes de cáncer desde hace varias décadas y cuentas para el 15-20% de todas las muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo [1] - [2]. Para el 2008, se reportaron un estimado de 1,61 millones de nuevos casos por año en todo el mundo. El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte en el mundo desarrollado y el tipo de cáncer más común en China [3]. La resección quirúrgica es el método principal de tratamiento para el cáncer de pulmón. Sin embargo, quimioterapia /radioterapia sigue siendo el tratamiento eficaz para los pacientes con cáncer avanzado de pulmón no microcítico (CPNM) o cáncer de pulmón de células pequeñas [4]. En consecuencia, se necesitan con urgencia nuevas estrategias terapéuticas y fármacos para el tratamiento de cáncer de pulmón.
La autofagia es un proceso de auto-digestiva fisiológica que degrada componentes citoplasmáticos para sostener el metabolismo celular durante la privación de nutrientes y /o el estrés metabólico. Durante la autofagia, macromoléculas, proteínas de larga vida y orgánulos dañados (tales como el retículo endoplasmático y las mitocondrias) están rodeados por autofagosomas. Los autofagosomas entonces se fusionan con los lisosomas, donde el contenido secuestrados sufren degradación y el reciclaje por hidrolasas residentes. La autofagia es importante en todas las células para la eliminación de proteínas de larga vida u orgánulos dañados. Esta capacidad hace que la autofagia para ser un candidato prometedor para un mecanismo de supervivencia en respuesta a varias tensiones [5]. Sin embargo, varios estudios recientes han sugerido que la autofagia también funciona como un mecanismo de pro-muerte causada por la terapia anti-tumor [6] - [9]. De hecho, se considera la muerte celular autofágica a la muerte celular programada de tipo II, mientras que la apoptosis se programa el tipo de muerte celular I [10]. Estos dos tipos de muerte celular se han descrito como formas distintas de la muerte celular; Sin embargo, muchos estudios demuestran la diafonía entre los dos tipos. Por ejemplo, p53, que es un potente inductor de la apoptosis, también puede inducir la autofagia mediante el aumento de la expresión de
dram
, un gen diana p53 directo [11]. Beclin 1 /Atg 6 es parte de un tipo complejo quinasa PI3 III que se requiere para la formación de las vesículas autofágicas. Interferencia con Beclin 1 puede prevenir la inducción de la autofagia. La interrupción de la interacción entre el dominio BH3 de Beclin 1y Bcl-2 conduce a un aumento de la autofagia [12] - [13].
ácido Gambogenic (GNA, C38H46O8, MW 631,32) (Figura 1A) es una de las principales componentes activos de Gamboge, una resina de exudados del árbol Garcinia hanburyi [14]. Gutagamba es una medicina tradicional que se ha utilizado como un purgante drástico, emético, y vermífugo para el tratamiento de la tenia. Gamboge se ha utilizado en el tratamiento del cáncer, incluyendo cáncer de mama, cáncer de pulmón, sarcoma linfático y carcinoma cutaneum [15], en una clínica en China y ha mostrado efectos interesantes [16]. Recientemente, la acumulación de pruebas ha demostrado que el principal componente activo GNA tiene un espectro más amplio de efectos antitumorales y menor toxicidad [17] - [19]. Los efectos moleculares y bioquímicas de GNA incluyen la inducción de la apoptosis en varias líneas celulares de cáncer y modelos animales de carcinogénesis [20] - [24]. Yu et al. han encontrado que GNA puede causar la detención G1 GSK3b dependiente en células de cáncer de pulmón y sugerido que GNA puede inducir la muerte celular a través de la autofagia en lugar de la apoptosis [25]. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a los efectos de GNA siguen sin estar claros. Los presentes estudios revelan el mecanismo molecular y el papel de la autofagia en la muerte de células tumorales inducida por GNA.
A, La estructura química de GNA. B, GNA inhibe el crecimiento e inhibe la muerte celular en las células cancerosas. células A549 y HeLa fueron tratadas con varias concentraciones de GNA para los períodos de tiempo indicados, y la proliferación celular se analizó mediante el ensayo de MTT. C, células no tratadas (control) o células tratadas con GNA 3 M durante 24 horas se observaron directamente bajo un microscopio de contraste de fase (izquierda) y se cuantificó la vacuolización de células (derecha); Se observaron al menos 600 células. Medias ± SEM, n = 3.
Materiales y Métodos
Los ratones fueron mantenidos en un ambiente libre de patógenos específicos. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité asesor de bienestar animal de la Universidad de Ciencia y Tecnología de China (número de permiso: 2010-11). Se tomaron las medidas adecuadas para reducir al mínimo el dolor y el malestar en el cumplimiento de las normativas nacionales.
1. Los reactivos y anticuerpos
Gambogenic ácido (GNA) (Figura 1A), aislado de Gutagamba, fue suministrada por el laboratorio del Prof. Wang Xiaoshan. La pureza GNA fue del 99%, que se determinó por HPLC-DAD. MTT, monodansylcadaverine (MDC), yoduro de propidio (PI), anexina V, naranja de acridina y Hoechst 33342 se adquirieron de Sigma. La rapamicina y trehalosa fueron regalos de tipo Prof. Wang Guanghui. MitoTracker Red, LysoTracker rojo y verde LysoSensor DND-189 se obtuvieron de Invitrogen. anticuerpos LC3 se adquirieron de Novus (NB100-2220), anticuerpos p62 eran de Biomol (PW9860), p70S6K (1494-1), p-p70S6K (3204-1) y p-p38 (1229-1) anticuerpos eran de Epitomics. anticuerpo GAPDH se adquirió de Chemicon (MAB374). GFP (sc-9996), caspasa-3 (sc-7148), p53 (sc-6243), Bax (sc-7480), Beclin 1 se compraron anticuerpos (SC-11427), y Bcl-2 (SC-7382) de Santa Cruz Biotechnology. Los reactivos se disolvieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS), a excepción de GNA y rapamicina, que se prepararon en DMSO.
2. Cultivo de células
El adenocarcinoma de pulmón A549 línea celular humana se adquirió en el Banco de Células de Shanghai Instituto de Biología Celular. La línea celular de carcinoma epitelial humano HeLa y células GFP-LC3 /HeLa establecidos fueron suministradas por el Prof. Wang Guanghui [26]. Para el establecimiento de una línea celular estable que expresa LC3 fusionado-EGFP, células HeLa fueron transfectadas con EGFP-LC3, y los clones individuales que expresan de forma estable GFP-LC3 fueron seleccionados utilizando 0,2 mg /ml G418. Se seleccionó un clon de expresión moderada resistentes a G418 para experimentos adicionales. SPC-A-1, H460, GIC-82 y 16-HBE fueron suministrados por el profesor Guang Zhou-Biao [25]. Las células se cultivaron en Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM) (Sigma) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS) (Invitrogen), 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C bajo 5% de CO
2.
3. Viabilidad de la célula de ensayo
ensayo de MTT.
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10
4 células en 100 l de medio por pocillo en 24 h antes de la experimentar. Luego, las células fueron incubadas con varias concentraciones de GNA a 37 ° C durante la duración de tiempo indicado. solución de MTT se añadió al medio de cultivo (500 mg /ml de concentración final) a las 4 h antes del final del tratamiento. La reacción se detuvo mediante la adición de 10% SDS acidificado (100 mu l) a cada pocillo. El valor de la absorbancia (A) a 490 nm se midió usando un lector de microplacas automático (Bio-Tek 800uv Elx, Bio-Tek Instrument Inc, Winooski, VT, EE.UU.). Se expresó la viabilidad celular como (Amuestra - Ablanco) /(Acontrol - Ablanco) x 100%, donde A es la absorbancia. Para las células tratadas con reactivos, se utilizaron células tratadas con vehículo como control. La pieza en bruto representado MTT añadido al medio.
PI o Anexina V /PI ensayo de citometría de flujo.
Las células fueron tratadas con las concentraciones indicadas de GNA durante 24 horas, se recogieron por tratamiento con tripsina, y luego se lavó dos veces con PBS, se incubaron con PI solo o junto con anexina V-isotiocianato de fluoresceína para 10 min de la luz y evaluadas por citometría de flujo (Becton & amp; Dickinson, EE.UU.). El porcentaje de células muertas se determina en función de la permeabilidad de la membrana plasmática a PI.
ensayo de tinción con azul tripán.
Las células (2 × 10
5 células por pocillo) se sembraron en 24 -Bueno placas de fondo plano. Después de cultivo durante 24 horas, se añadió 3 GNA M durante los períodos de tiempo indicados. Después las células se separan del sustrato por tripsinización y se tiñeron con solución de azul de tripano (0,4% en PBS). El número de células muertas se contó con un hemocitómetro bajo un microscopio óptico (Olympus, Japón). Al menos 400 células se contaron para cada muestra, y el experimento se repitió tres veces.
4. Autophagic marcador tinción
GFP-LC3 /células HeLa que habían sido tratados con 3 M de GNA para los períodos de tiempo indicados se incubaron con monodansylcadaverine 10 M o 75 nM LysoTracker roja durante 15 minutos. Después de lavar dos veces con PBS, las células se examinaron por microscopía de fluorescencia (Olympus, Japón).
5. La cuantificación de los orgánulos vesiculares ácidos con naranja de acridina
Después del tratamiento con los reactivos indicados, las células se tiñeron con naranja de acridina a una concentración final de 1 mg /ml durante 15 minutos lejos de la luz, a continuación, se observa bajo un microscopio de fluorescencia o cosechados por tripsinización y se analizaron mediante citometría de flujo.
6. Microscopía electrónica de transmisión
Las células se recogieron por tripsinización y el tejido tumoral fue resecado, después se lavó dos veces con PBS y se fijaron con 2% de paraformaldehído /2% de glutaraldehído en tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,4), seguido de 1% OSO
4. Después de la deshidratación, las secciones delgadas se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo para su observación al microscopio electrónico JEOL TEM-100SX (JEOL, Japón).
7. El análisis por inmunotransferencia
Las células o el tejido tumoral se lavaron en solución salina tamponada con fosfato fría (PBS) a 4 ° C, a continuación, se prepararon las proteínas, separadas por 12% SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Millipore) . La membrana se incubó durante 1 h en PBS-Tween 20 (0,05%) que contiene 5% de leche sin grasa. Los anticuerpos primarios se detectaron usando oveja anti-IgG de ratón-HRP o anti-IgG de conejo-HRP secundaria de anticuerpos (Amersham Pharmacia Biotech). Las proteínas se visualizaron utilizando un kit de detección ECL (Amersham Pharmacia Biotech). Un anticuerpo anti-GAPDH (deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato; Chemicon). Se utiliza para garantizar la igualdad de la carga de proteínas
Para volver a la sonda de la membrana con otro anticuerpo primario, la membrana se incubó primero con Stripping Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6,8, β-mercaptoetanol 0,1 mM, y SDS 20 mM) durante 30 min a 50 ° C, después se sometió a análisis de transferencia de Western siguiendo el protocolo estándar.
8. RNA de interferencia
oligonucleótidos de doble cadena de orientación 5'-CCACUCUGUGAGGAAUGCACAGAUA-3 'del ARNm humano Beclin 1 se sintetizó mediante Shanghai GenePharma (Shanghai, China), y un oligonucleótido irrelevante sirvieron como control negativo. La transfección se realizó usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, el siRNA y Lipofectamine 2000 (Invitrogen) se mezclaron en medio Opti-MEM (Invitrogen) y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente para permitir la formación del complejo. Entonces, las células se lavaron con medio Opti-MEM (Invitrogen), y se añadió la mezcla. A las 12 h después de la transfección, el medio de cultivo se reemplazó con medio completo fresco. Las células se recogieron 72 horas después de la transfección y se analizaron más.
9. Modelo de xenoinjerto de ratón
ratones desnudos BALB /cA (30-40 días de edad y un peso de 18 a 20 g) se dividieron en grupos que contienen seis ratones por grupo. Se inyectaron células A549 s.c. (2 × 10
6 células por ratón) en la pata trasera derecha de los ratones. Después se establecieron los tumores (~ 50 mm
3), los ratones fueron i.v. inyectada con o sin 16 mg /kg dos veces a la semana GNA durante tres semanas. A las 24 horas después de la última inyección i.v. inyección, los tumores fueron aislados para microscopía electrónica de transmisión y análisis de Western Blot.
10. Evaluación de pH en los lisosomas
Después del tratamiento de las células A549 con GNA 3 M durante los períodos de tiempo indicados, las células fueron incubadas con 1 mM LysoSensor verde DND-189 durante 15 minutos. Las células se lavaron dos veces con PBS, a continuación, examinó por microscopía de fluorescencia (Olympus, Japón).
Resultados
1. GNA inhibe el crecimiento e induce la muerte celular en células de cáncer de
El efecto de GNA sobre el crecimiento celular se investigó usando un ensayo de MTT en varias líneas celulares de cáncer humano. Examinamos primero el efecto de la GNA en la viabilidad celular de A549 y células HeLa. Como se muestra en la Figura 1, GNA inhibió el crecimiento en A549 y células HeLa de una manera de la concentración y dependiente del tiempo (Figura 1B). Para confirmar los efectos de la GNA en las células de cáncer de pulmón, el ensayo de MTT se repitió en varias otras líneas celulares de cáncer de pulmón (H460, SPA-C-1, Glc-82 y la línea celular epitelial bronquial normal de 16-HBE). H460, SPA-C-1 y Glc-82 eran todos sensibles a GNA, mientras que 16-HBE era menos sensible a GNA (Figura S1A). Estos resultados indican que GNA puede matar con eficacia las células de cáncer de pulmón con baja toxicidad.
Curiosamente, cuando se realizó un experimento de cinética de microscopía óptica, se encontró que las células tratadas con GNA mostraron una acumulación progresiva de vacuolas intracitoplasmáticas que eran similares a los que a menudo se observa en células que experimentan la autofagia (Figura 1C). Mientras tanto, se observó un aumento del porcentaje de células con vacuolas grandes visibles en las células tratadas con GNA en comparación con las células control (Figura 1C), consistente con un mecanismo relacionado con la autofagia.
2. GNA aumentar marcadores autofágicas en A549 y células HeLa
Se realizó una serie de experimentos para determinar si la autofagia es inducida por GNA. En primer lugar, se utilizó monodansylcadaverine (MDC), un compuesto conocido lysosomotropic para etiquetar los endosomas ácidos, los lisosomas, y autofagosomas [27]. Como se muestra en la Figura 2A, las células A549 GNA tratados mostraron un aumento dramático en el número de vesículas marcadas con MDC, lo que indica que GNA podría inducir la formación de orgánulos vesiculares ácidos (AVO), que es una característica de la autofagia. Para cuantificar estos objetos AVO, naranja de acridina tinción vital se realizó y analizó por FACS. Se encontró que objetos AVO acridina naranja-positivo aumenta en las células A549 tratadas con GNA en relación con las células control (Figura 2B, 2C); rapamicina se utilizó como control positivo.
A, Imágenes representativas de tinción MDC. las células A549 se trataron con 3 GNA mu M durante 24 horas, después se tiñeron con 10 monodansylcadaverine mu M (MDC) y se observaron bajo un microscopio de contraste de fase. B y C, acridina naranja tinción. Las células se expusieron a las concentraciones indicadas de GNA durante 24 horas, después se tiñeron con 1 g /ml de naranja de acridina (B, C) y observadas con un microscopio de contraste de fase (B) o analizadas por citometría de flujo (C). Las células que fueron tratados con 50 mg /ml de rapamicina se utilizaron como control positivo. Los resultados mostrados son representativos de al menos 2 experimentos independientes. D, imágenes de microscopía electrónica representativos de células A549 tratadas con GNA. Las células fueron tratadas con 3 GNA M durante los períodos de tiempo indicados y se analizaron por microscopía electrónica. Las flechas indican las vacuolas en contacto con vesículas que fueron densamente llenas de estructuras multilamelares.
La presencia de autofagosomas, que muestran estructuras de doble membrana de la vesícula, se considera que es el sello distintivo de la autofagia. Hemos examinado si esta estructura formada en las células A549 tratadas con GNA bajo un microscopio electrónico (EM). Como se muestra en la Figura 2D, las células tratadas con GNA muestran una mayor formación de autofagosomas en relación con las células control.
3. GNA desencadena la formación de los marcadores de autofagia en células HeLa y A549
Para confirmar la inducción GNA mediada por la autofagia, se analizó la expresión de marcadores de autofagia, incluyendo LC3. Durante la autofagia, LC3 se convierte de forma libre (LC3-1) de una forma más pequeña proteolíticamente procesados (LC3-II). GFP-LC3 /células HeLa, que expresan de forma estable GFP-LC3, se trataron con las concentraciones indicadas de GNA para las 24 horas; estas células GNA-tratadas mostraron un aumento dramático en la distribución punctuate de GFP-LC3 de una manera dependiente de la concentración, mientras que las células no tratadas muestran una apariencia GFP-LC3 difusa. La cuantificación indicó que el número de células que contenía al menos 5 GFP-LC3 marcan puntos también aumentó en un dependiente de la concentración manera (Figura 3A). análisis de transferencia Western de las células A549 tratadas con GNA mostró un notable aumento en el nivel de LC3-II de una manera de la concentración y dependiente del tiempo (Figura 3B). Se obtuvieron resultados similares en H460, SPA-C-1 y líneas de células Glc-82 de cáncer de pulmón, mientras que la línea celular de pulmón normal 16-HBE era menos sensible a GNA (Figura S1B).
A, los efectos de GNA sobre la distribución de puntúa GFP-LC3. GFP-LC3 /células HeLa se trataron con varias concentraciones de GNA o 50 g /ml de rapamicina durante 24 horas, luego detectados por microscopía de fluorescencia. El porcentaje de células con al menos 5 GFP-LC3 puntúan puntos se calculó; No se observaron al menos 600 células, medios ± SEM, n = 3, ** significa p & lt; 0,01, ANOVA de una vía. B, Efectos de la GNA en la proteína LC3. las células A549 se trataron con diversas concentraciones de GNA durante 24 horas o GNA 3 M para los periodos indicados de tiempo, después se analizaron por transferencia Western utilizando anticuerpos anti-LC3. proteína GAPDH se utilizó como control de carga. El gráfico de barras muestra la intensidad de la banda de LC3-II en relación con los de GAPDH. Media ± SEM, n = 3, * significa p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, ANOVA de una vía. C, Efectos de la GNA en proteínas Beclin1. las células A549 se trataron con 3 M GNA para los períodos de tiempo indicados, a continuación, se analizaron por transferencia de Western usando anticuerpos anti-Beclin1. proteína GAPDH se utilizó como control de carga. El gráfico de barras muestra las intensidades de banda de 1 Beclin relación con los de GAPDH. Media ± SEM, n = 3, * significa p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, ANOVA de una vía. D, los efectos de GNA sobre la fosforilación p70s6k. las células A549 se trataron con 3 M GNA para los períodos de tiempo indicados, después se analizaron por transferencia de Western usando anticuerpos anti-p-p70S6K anti-p70S6K y. proteína GAPDH se utilizó como control de carga. El gráfico de barras muestra la intensidad de la banda de p-p70s6k relación con los de GAPDH. La media ± SEM, n = 3, * significa p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, ANOVA de una vía
Los niveles de Beclin 1, un producto génico ATG que es esencial para la autofagia [. ,,,0],28], el aumento claramente con el tiempo en las células A549 tratadas con GNA (Figura 3C). La actividad mTOR reducida Ser /Thr quinasa mTOR actúa como un guardián de puerta en el proceso de la autofagia, y se ha asociado con niveles elevados de la autofagia. P70S6K es un sustrato de mTOR y su fosforilación es dependiente de la actividad de mTOR. Se encontró que p70S6K fosforilación disminuyó claramente en el tiempo después del tratamiento GNA (Figura 3D), lo que indica la actividad de mTOR reducida. En conjunto, estos resultados sugieren fuertemente que GNA desencadena el inicio de marcadores autofágicas en A549 y células HeLa.
4. GNA inhibe la fusión entre autofagosomas y autolisosomas
Debido a GNA desencadena el inicio de marcadores autofágicos, nos preguntamos si GNA podría desencadenar flujo de autofagia. Para abordar esta cuestión, se evaluó si los cambios ocurridos en GFP-LC3, que también ha sido utilizado para controlar el flujo de autofagia. Cuando GFP-LC3 se entrega a un lisosoma, la porción LC3 de la quimera es sensible a la degradación, mientras que la proteína GFP es relativamente resistente a la hidrólisis. Por lo tanto, la medición de los niveles de GFP escindido por Western Blot puede controlar el flujo de la autofagia. Como se muestra en la figura 4A, el nivel de GFP libre cambió ligeramente tras el tratamiento GNA, mientras que GFP-LC3-II claramente aumentó con el tiempo. Muy diferentes resultados se observaron tras el tratamiento con trehalosa (un inductor de la autofagia normal), que se utilizó como control positivo. Hemos supervisado aún más el nivel de p62 endógeno /SQSTM1, un sustrato de la autofagia-lisosoma que está asociada con la degradación de proteínas autofagia-lisosomal. La acumulación de p62 se considera que es un marcador para la inhibición de la autofagia o la interrupción de la degradación de la autofagia. GNA bloqueó la degradación de p62 de una manera de la concentración y dependiente del tiempo (Figura 4B), lo que sugiere que GNA afecta la degradación autofagia. Se obtuvieron resultados similares en H460, SPA-C-1 y líneas de células Glc-82 de cáncer de pulmón, mientras que la línea celular de pulmón normal 16-HBE era menos sensible a GNA (Figura S1B).
A, Efecto de GNA en el flujo de la autofagia. células GFP-LC3 /HeLa se cultivaron en ausencia (control) o presencia de 3 mM de GNA para los períodos de tiempo indicados, y el nivel de GFP escindido se analizó mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-GFP; trehalosa 100 mM se utilizó como control positivo. proteína GAPDH se utilizó como control de carga. El gráfico de barras muestra la intensidad de la banda de GFP-LC3-II o GFP escindido relación con los de GAPDH. Media ± SEM, n = 3, * significa p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, ANOVA de una vía. B, la dosis y los efectos dependientes del tiempo de GNA en la degradación de p62. las células A549 se trataron con diversas concentraciones de GNA durante 24 horas o 3 GNA mu M para los períodos de tiempo indicados, y los niveles de proteína p62 se analizaron mediante transferencia Western. proteína GAPDH se utilizó como control de carga. El gráfico de barras muestra la intensidad de la banda de p62 en relación con los de GAPDH. Media ± SEM, n = 3, ** p & lt; 0,01, ANOVA de una vía. C, la inhibición de la fusión entre autofagosomas y lisosomas tras el tratamiento con GNA. GFP-LC3 /células HeLa se trata con 3 M GNA para los períodos de tiempo indicados y posteriormente se tiñeron con 75 nM LysoTracker Red (LTR) de 15 min. se muestran imágenes de microscopía de fluorescencia representativas. D, la inhibición de la acidificación lisosoma tras el tratamiento con GNA. A549 células fueron tratadas con 3 GNA M durante los períodos de tiempo indicados o 500 mM de bafilomicina A1 durante 8 horas y posteriormente se tiñeron con 1 mM LysoSensor verde NOM-189 durante 15 minutos. se muestran imágenes de microscopía de fluorescencia representativas.
En conjunto, estos resultados sugieren fuertemente que GNA puede interrumpir la degradación de la autofagia en una etapa tardía.
A continuación preguntamos ¿qué proceso se ve afectado por GNA. Se examinó el efecto de GNA en la colocalización de autofagosomas y lisosomas. Como se muestra en la Figura 4C, numerosas pequeñas, intensamente teñidas puntos GFP-LC3 (autofagosomas) y LysoTracker Red (LTR) puntos teñidas (lisosomas) se colocalized dentro de las 6 horas después del tratamiento GNA. Sin embargo, esta colocalización se interrumpió a las 12 y 24 horas después del tratamiento GNA; los pequeños, intensamente teñidas puntos GPF-LC3 parecían acumularse y se convirtieron en grandes regiones, intensamente teñidos, lo que sugiere que la fusión entre autofagosomas y lisosomas fue bloqueado. Estudios anteriores han demostrado que algunos fármacos, tales como CQ y bafilomicina A1, pueden elevar el pH de los lisosomas para inhibir la fusión con autofagosomas. Se analizó si GNA tiene efectos similares. Se evaluó el efecto de la GNA en la acidificación lisosoma mediante tinción con verde LysoSensor NOM-189, una sonda fluorescente acidotropic que puede ser atrapado en orgánulos ácidos. Bafilomicina A1 se utilizó como control positivo. Como se muestra en la Figura 4D, el etiquetado lisosoma se interrumpió el plazo de 12 horas después del tratamiento GNA y era mucho más obviamente afectados a las 24 y 36 horas (similares a los efectos de bafilomicina A1), lo que indica la inhibición de la acidificación lisosoma. Esta observación podría explicar la inhibición GNA mediada de la fusión entre autofagosomas y lisosomas. Por lo tanto, aunque GNA desencadena la formación de autofagosomas, GNA también bloquea la progresión del proceso de autofagia mediante la supresión de fusión entre los autofagosomas y lisosomas, inhibiendo de este modo la degradación de los contenidos.
5. La caída de Beclin 1 disminuye GNA inducida por la muerte de células de cáncer
Los datos anteriores indican que GNA puede inducir la muerte celular a través de apoptosis. Para determinar si la muerte celular causada por GNA se correlaciona con la autofagia disfuncional, que más empleada pequeños ARN de interferencia (siRNA) para reducir la expresión de Beclin 1, un gen esencial para la autofagia. La transfección de los oligonucleótidos de ARN contra Beclin1 (Beclin 1 siRNA) en células A549 suprimió con éxito el nivel de proteína de Beclin endógena 1 en comparación con las células transfectadas con ARNsi de control, indicando que el siRNA Beclin 1 es eficiente (Figura 5A). Después del tratamiento 24 o 36 horas con 3 GNA mu M, las células Beclin 1 desmontables muestran significativamente menos muerte celular en comparación con las células control (Figura 5B), lo que sugiere que la muerte celular inducida por GNA se relaciona con la autofagia disfuncional.
A, oligonucleótidos de ARN contra Beclin 1 (Beclin 1 siRNA) reprimen eficazmente Beclin 1 de expresión. las células A549 fueron transfectadas con siRNAs contra Beclin 1 o un control negativo, y el nivel de proteína de Beclin1 se analizó por Western Blot. proteína GAPDH se utilizó como control de carga. El gráfico de barras muestra la intensidad de la banda de Beclin1 relación con los de GAPDH. Media ± SEM, n = 3, ** p & lt; 0,01, ANOVA de una vía. B, las células A549 fueron transfectadas con siRNAs contra Beclin 1 o un control negativo. Las células se trataron con 3 GNA M durante los períodos de tiempo indicados, se tiñeron con Hoechst 33342 2 M y se observa bajo un microscopio de fluorescencia; el porcentaje de células muertas se cuantificó por tinción con azul tripán. La media ± SEM, n = 3, * significa p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, ANOVA de una vía
6.. GNA induce cambios en los niveles de las proteínas relacionadas con la apoptosis
A continuación, se determinó la vía por la cual disfuncional autofagia inducida por la muerte celular se produce tras el tratamiento GNA. Cada vez más pruebas ha indicado que la diafonía entre la autofagia y apoptosis es especialmente complicado por el hecho de que estos procesos comparten muchas moléculas reguladoras comunes, tales como p53 y Bcl-2 miembros de la familia [29] - [30]. GNA causó un aumento en los niveles de proteína de Bax y escinde la caspasa-3 y una disminución de los niveles de Bcl-2 y LC3-II con el tiempo, lo que sugiere que el tratamiento GNA activa Bax. Debido a Bax es uno de los objetivos de abajo más prominentes de p53, se evaluó el efecto de la GNA en p53. Como se muestra en la Figura 6A, GNA causó un notable aumento en el nivel de p53. Debido a que la p38 MAPK contribuye a la activación de p53, también monitoreamos los niveles de p38. GNA causó un notable aumento en el nivel de p38 fosforilada (Figura 6A). Además, la citometría de flujo análisis utilizando anexina V /yoduro de propidio tinción indicó que el tratamiento GNA aumentó claramente la fracción de células muertas y células apoptóticas tarde en comparación con NC. Por lo tanto, concluimos que GNA puede inducir la apoptosis en las células A549, al menos parcialmente a través de esta vía.
A, las células A549 fueron transfectadas con siRNAs contra Beclin 1 o un control negativo. Las células se trataron a continuación con 3 M GNA para los períodos de tiempo indicados. El nivel de proteína relativa fue analizada por Western Blot. proteína GAPDH se utilizó como control de carga. El gráfico de barras muestra la intensidad de la banda de proteína indicada en relación con los de GAPDH. Media ± SEM, n = 3, * significa p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, ANOVA de una vía. B, las células A549 fueron transfectadas con siRNAs contra Beclin 1 o un control negativo. Las células se trataron a continuación con 3 M GNA para los períodos de tiempo indicados, y las células se tiñeron con yoduro de anexina V /propidio y se sometieron a análisis de citometría de flujo. El porcentaje en el cuadrante superior izquierdo indica la proporción de células marcadas con yoduro de propidio (células muertas), mientras que el porcentaje en el cuadrante superior derecho indica la población de células marcadas tanto por la anexina V y yoduro de propidio (finales de células apoptóticas y muertas).
7. GNA inhibe la autofagia en vivo
GNA ha demostrado su eficacia en tumores que crecen en ratones desnudos. Nuestro laboratorio ha demostrado previamente que los volúmenes tumorales relativos (RTV) en ratones tratados con 16 y 32 mg /kg GNA fueron 12,16 ± 7,39 y 7,65 ± 2,84, respectivamente, mientras que el RTV en controles negativos tratados con vehículo fue 26,36 ± 14,10; las proporciones de crecimiento relativo del tumor (T /C,%) fueron 46,1% y 29,0%. Para determinar el mecanismo por el cual GNA perjudica el crecimiento del tumor
in vivo
, establecimos un modelo de xenoinjerto de tumor de pulmón de ratón. Como se muestra en la Figura 7, GNA indujo la acumulación de vesículas autofágicas (figura 7A), el aumento de los niveles de LC3-II (Figura 7B) y bloqueó la degradación de p62 (figura 7B) en los tumores. Estos resultados sugieren fuertemente que el mecanismo por el que actúa GNA
in vivo
está también relacionada con la autofagia.
Se inyectaron por vía subcutánea células A549 (2 × 10
6 /ratón) en 30-40 días de edad BALB /cA ratones desnudos masculinos. Después se habían formado tumores establecidos (~ 50 mm
3), los ratones fueron i.v. inyectada con o sin 16 mg /kg dos veces a la semana GNA durante tres semanas.