Extracto
Antecedentes
proteína secretada ácida y rica en cisteína (SPARC), una de calcio vinculante glicoproteína matricellular, está implicada en la progresión de muchos tipos de cáncer. En este estudio, se determinó la expresión y función de SPARC en el cáncer de ovario.
Métodos
cDNA microarray análisis se realizó para comparar los perfiles de expresión génica de la altamente invasiva y los subclones derivados de poco invasivas la línea de ovario humano SKOV3 célula cancerosa. La inmunohistoquímica (IHC) tinción se realizó para investigar la expresión de SPARC en un total de 140 muestras de tejido de ovario. En ensayos funcionales, se investigaron los efectos de SPARC caída en el comportamiento biológico de las células de cáncer de ovario. También se investigaron los mecanismos de SPARC en la proliferación del cáncer de ovario, la apoptosis y la invasión.
Resultados
SPARC se sobreexpresa en el subclon altamente invasiva en comparación con el subclón poco invasiva. La expresión de alto SPARC se asoció con la etapa alta, baja diferenciación, metástasis en los ganglios linfáticos y el mal pronóstico del cáncer de ovario. Desmontables de expresión SPARC suprimió significativamente la proliferación de células de cáncer de ovario, la apoptosis celular inducida y la invasión de células inhibida y la metástasis.
Conclusión
SPARC se sobreexpresa en subclón altamente invasiva y tejidos de cáncer de ovario y juega un papel importante en el crecimiento del cáncer de ovario, la apoptosis y la metástasis
Visto:. Chen J, Wang M, Xi B, Xue J, El D, Zhang J, et al. (2012) SPARC es un regulador clave de la proliferación, la apoptosis y la invasión en el cáncer de ovario humano. PLoS ONE 7 (8): e42413. doi: 10.1371 /journal.pone.0042413
Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Marzo, 2012; Aceptado: July 5, 2012; Publicado: 3 Agosto 2012
Copyright: © Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por una subvención-en-ayudas a la investigación científica (2012TS088) de la Universidad de Shandong. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es el segundo cáncer ginecológico más común y una de las principales causas de muerte por cáncer en las mujeres [1]. Alto porcentaje de pacientes con cáncer de ovario se diagnostica en una etapa avanzada. A pesar de los avances sustanciales se han hecho en la investigación del cáncer de ovario, la supervivencia a razón de incidencia sigue siendo pobre y tasa de curación sigue siendo muy baja [2]. La recidiva del tumor y la metástasis se consideran las principales razones de los malos resultados y las muertes de cáncer clínicos [3]. Por lo tanto, estudiar el mecanismo de la invasión tumoral y la metástasis proporcionará más conocimientos sobre el desarrollo y progresión del cáncer de ovario.
SPARC (proteína secretada ácida y rica en cisteína), también denominado osteonectina, BM-40, y 43 proteína K, es una glicoproteína matricellular de unión a calcio, cuya función es la de modular las interacciones célula-matriz y función de las células sin participar en el andamiaje estructural de la matriz extracelular [4]. Aunque existe una creciente evidencia de un papel importante para SPARC en una variedad de cánceres, no existe un modelo unificador, lo que explica todas las facetas de su función y su contribución al desarrollo y progresión del cáncer [5]. SPARC se expresa diferencialmente en los tumores y su estroma circundante en varios tipos de cáncer en comparación con el tejido normal. Por ejemplo, se ha informado de niveles más altos de expresión de SPARC en el cáncer de mama [6], [7], carcinoma hepatocelular [8], [9], cáncer de próstata [10], el cáncer colorrectal [11], [12], y de ovario cáncer [13], [14]. Sin embargo, una correlación opuesta También se ha demostrado, lo que sugiere que SPARC puede ser capaz de inhibir la tumorigénesis o la progresión del tumor en el cáncer de mama [15], [16], carcinoma hepatocelular [17], cáncer de próstata [18], el cáncer colorrectal [19] , [20], y el cáncer de ovario [21]. Por lo tanto, la función de SPARC en méritos de cáncer de mayor investigación.
En el presente estudio, se realizó un análisis de cDNA microarray para investigar el perfil de expresión génica diferencial del subclon altamente invasiva S1 y el bajo subclón invasiva S21, ambos que se deriva de la línea celular de cáncer de ovario humano SKOV3. Se encontró que muchos genes se expresaron diferencialmente en estos dos tipos de subclones. En particular, SPARC se encontró que se sobreexpresa significativamente en el subclon altamente invasiva S1 en comparación con el de la baja subclón invasiva S21. Para aclarar la relación entre SPARC y la progresión del cáncer de ovario, la expresión de SPARC en muestras de tejido ovárico humano se midieron mediante técnicas de inmunohistoquímica (IHC). En ensayo de función, por la interferencia de ARN lentivirus mediada, que disminuyó la expresión de SPARC en subclón altamente invasiva S1 y HO8910PM para determinar el efecto de SPARC en ovario proliferación de células cancerosas, la apoptosis, la invasión y la metástasis.
Materiales y líneas celulares métodos
líneas celulares
SKOV3, NIH3T3 y HO8910PM (una línea celular de cáncer de ovario altamente metastásico [22]) se obtuvieron de Shanghai Instituto de Ciencias Biológicas de la Academia china de Ciencias. El subclón altamente invasiva (S1) y el bajo subclón invasiva (S21) se derivaron de la línea de SKOV3 humano de ovario de células de cáncer [23]. Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 para SKOV3 o DMEM para NIH3T3 y HO8910PM suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y antibióticos (Gibco BRL, Rockville, MD).
Análisis Microarray
ARN total fue extraído de la subclón altamente invasiva (S1) y el subclón invasiva bajo (S21) utilizando RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA). la calidad del ARN se evaluó por espectrofotometría y electroforesis en gel desnaturalizante. El ARN se amplifica y se etiqueta con el kit de marcaje de Agilent rápido AMP y se hibridó con microarrays de todo el genoma de Agilent oligo. Las láminas fueron escaneados utilizando el escáner de microarrays de ADN de Agilent. Los datos se procesaron utilizando Agilent extracción de características de software (versión 10.5.1.1) y analizados mediante el software Agilent GeneSpring GX (versión 11.0). Los experimentos se realizaron por triplicado.
Las muestras de tejido
Las muestras de tejido se obtuvieron con el consentimiento informado por escrito de 80 mujeres con cáncer de ovario epitelial (con 29 cystadenocarcinoma serosa, 25 cystadenocarcinoma mucinoso y carcinoma endometrioide 26 ), a partir de 35 mujeres con tumor ovárico benigno, y desde el 25 de tejido de ovario normal de control en el Departamento de Ginecología y Obstetricia, hospital Provincial de Shandong entre 2005 y 2007. Todos los pacientes con cáncer de ovario se organizaron de vista clínico, según el sistema de clasificación de FIGO [con 38 tumores en etapas bajas (FIGO etapas I y II) y 42 tumores de la etapa alta (FIGO estadios III y IV)]. Ninguno de los pacientes con cáncer de ovario recibido radiación o quimioterapia preoperatoria. El estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Ética Médica de la Universidad de Shandong.
La inmunohistoquímica (IHC)
De acuerdo con los procedimientos complejos estreptavidina-biotina-peroxidasa estándar, IHC se realizó en fijado en formol e parafina -embedded secciones (5 m de espesor) y diapositivas de células se fijaron en paraformaldehído al 4%. En resumen, después de desparafinado, la rehidratación y la recuperación de antígenos, las secciones se incubaron con anticuerpo SPARC anti-humana (AF941, R & amp; D Systems y BS-1133R, BIOS) con la dilución 15 g /ml para AF941 y 10 g /ml para trabajar bs-1133R a 4 ° C durante la noche. El anticuerpo secundario fue peroxidasa de rábano picante conjugado IgG anti-cabra para AF941 e IgG anti-conejo de bs-1133R. Un control negativo se obtuvo mediante la sustitución del anticuerpo primario con inmunoglobulina de conejo normal (IgG). Expresión positiva de la proteína SPARC se definió como la presencia de gránulos de color marrón en el citoplasma o estroma.
(A) Diagrama de dispersión que muestra los valores de veces de cambio en comparación con los valores de p para la visualización de la expresión diferencial entre el altamente invasiva y de bajo invasivo clones. Las líneas verticales representan 1,5 veces arriba y abajo de la regulación, respectivamente. La línea horizontal representa un valor de p de 0,05. Los puntos rojos en la trama representan los genes expresados diferencialmente con significación estadística. (B, C, D) expresión SPARC medida por Western blot (B), Q-RT-PCR (C), y la inmunohistoquímica (D) (aumento x 200). * P & lt;. 0.05
La inmunohistoquímica (IHC) Análisis
Se utilizó un sistema de puntuación semicuantitativo basándose en la intensidad de la tinción y la distribución de células positivas para evaluar la expresión SPARC [24]. La intensidad de la tinción SPARC positivo varió de 0 a 3 (negativo = 0, débil = 1, moderada = 2, o fuerte = 3) y el porcentaje de células teñidas positivamente se puntuó como 0 (0%), 1 (1-25 %), 2 (26 a 50%), 3 (51 a 75%), y 4 (76 a 100%). La suma de la intensidad y el porcentaje de puntuación se utilizó como las puntuaciones finales de tinción (0 a 7). La suma índices (-), (+), (++), y (+++) indicaron marcador final tinción de 0, 1-3, 4-5, y 6-7, respectivamente. Para el análisis estadístico, sum-índices (-) y (+) se definieron como una baja expresión de SPARC, mientras que los índices de suma-(++) y (+++) fueron definidos como alta expresión de SPARC. Cada sección se puntuó de forma independiente por dos patólogos. Si se produce una inconsistencia, un tercer patólogo fue consultado para lograr el consenso.
Péptido ensayo de bloqueo
Con el fin de probar la especificidad de anticuerpos anti-SPARC, el anticuerpo se incubó durante la noche a 4 ° C con SPARC humano recombinante (941-SP, R & amp; D Systems). a continuación, se realizó inmunohistoquímica como se describe anteriormente, pero el bloqueado anti-SPARC se utilizó como anticuerpo primario.
(A) humano normal tejido ovárico usando AF941 anticuerpo, (B) el tumor ovárico benigno usando AF941 anticuerpo, (C) alta diferenciación del carcinoma de ovario usando AF941 anticuerpo, (D) medio de diferenciación del carcinoma de ovario usando AF941 anticuerpo, (E) bajo la diferenciación del carcinoma de ovario usando AF941 anticuerpo, (F) de tejido ovárico humano normal utilizando bs-1133R de anticuerpos, (G) benignos bs-1133R usando anticuerpos tumorales de ovario, (H) de alta diferenciación del carcinoma de ovario usando bs-1133R de anticuerpos, (I) la diferenciación media del carcinoma de ovario usando bs-1133R de anticuerpos, (J) bajo la diferenciación del carcinoma de ovario usando el anticuerpo bs-1133R ( aumento x 200). Las flechas negras indican citoplasma de las células teñidas, las flechas rojas indican estroma manchada.
Real-time RT-PCR cuantitativa (Q-RT-PCR)
ARN total fue extraído utilizando el reactivo Trizol ( Invitrogen) y revirtió transcrito. El análisis cuantitativo de PCR en tiempo real se realizó utilizando ABI PRISM 7500 Sistema de PCR en tiempo real (Applied Biosystems). Cada pocillo (volumen de reacción de 20 l) contenía 10 l de energía SYBR Green PCR master mix (Applied Biosystems), 1 l de cada cebador (5 mol /l) y la plantilla de cDNA 1μl (50 ng /l). Los cebadores (tabla 1) fueron diseñados por el software cebador 5 y sintetizadas por Takara Biotecnología (Dalian) Co., Ltd.
Western Blot
Las células se lisaron en tampón RIPA que contenía PMSF 1 mM. Cincuenta microgramos de proteína por carril se resolvió por SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de PVDF y se bloqueó con 5% de BSA. Las membranas se incubaron primero con el anticuerpo primario contra SPARC, PCNA, ciclina D1, P53, P21, Bax y Bcl-2 en 1:1000 diluciones durante la noche, y después se incubaron con anticuerpo secundario de rábano picante conjugado con peroxidasa anti-cabra o anti-ratón IgG durante 1 hora a temperatura ambiente, las transferencias se desarrollaron usando el método ECL. intensidad de las bandas se analizó utilizando Gel-Pro Software Analyzer (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD).
ARN de interferencia
libre inactivar vector lentiviral (GeneChem, Shanghai, China) que contiene una reportero GFP dirigido por CMV y un promotor U6 aguas arriba de los sitios de clonación (edad I y EcoR I) se utilizó para la clonación de pequeños ARN de horquilla (shRNAs). La secuencia diana para SPARC era 5'AACAAGACCTTCGACTCTTCC-3 '; la secuencia de control negativo fue 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 '. Las células subclone altamente invasivas (S1 y HO8910PM) se cultivaron en placas de cultivo tisular de seis pocillos y se infectaron con lentivirus a una multiplicidad de infección (MOI) de 100 por 24 h. A continuación, el medio se reemplazó con medio completo fresco. Después de 4 días, se observaron las células bajo microscopio de fluorescencia para confirmar que más de 80% de las células fueron positivas para GFP.
celulares Ensayos de proliferación
La proliferación celular se determinó por usando el ensayo MTT y el ensayo de agar blando de anclaje independiente de formación de colonias. Para el ensayo MTT, se añadió 20 l de MTT (5 mg /ml en PBS) directamente en cada pocillo de placa de 96 pocillos y se incubó a 37 ° C durante 4 h. Después se retiró de los medios y se añadieron 200 l de DMSO para disolver los cristales de formazán. La densidad óptica a 570 nm se leyó con un lector de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Para el ensayo de formación de colonias en agar blando, 500 l 2 × DMEM suplementado con 20% FBS se mezcló con 500 l 1,2 Sea% plaga agar y se solidificó en cada pocillo de una placa de 24 pocillos para formar una base capa de agar. Para la parte superior capa de agar, 25 l células (5 × 10
3 /ml) se mezclaron con 500 l 2 x 500 l DMEM y un 0,7% de agar Mar plaga y ha añadido en la parte superior de la capa de agar base. Después de crecer durante 14 días, la formación de colonias se monitorizó con microscopía. Un grupo de diez o más células se definió como una colonia.
Anexina V-PI Los ensayos para la apoptosis
Las células se recogieron y se lavó dos veces con PBS, se suspendieron en 200 l tampón de unión y 10 l se añadieron anexina V-FITC durante 20 minutos en la oscuridad, y el tampón a partir de entonces, 300 l de unión y 5 l de yoduro de propidio (PI) para cada muestra. Se determinaron las células apoptóticas usando un citómetro de flujo (Becton Dickinson) con CellQuest (Becton Dickinson) software.
Análisis de Ciclo Cell Distribution
se cosecharon
Las células, se lavaron con PBS enfriado con hielo, y teñido con 50 mg /ml PI y 250 mg /ml de ARNasa durante 30 minutos. El porcentaje de células en cada fase del ciclo celular se determinó con un ModFit LT2.0 ADN ensayo programado por ordenador (Becton Dickinson) usando un citómetro de flujo.
Cell Invasion Ensayo y Migración Ensayo
ensayo de invasión se realizó como se describe anteriormente [25]. Cada Transwell (BD Biosciences, Bedford, MA) se revistió con 50 l 1:03 dilución de Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA). Las células (0,2 × 10
6) se resuspendieron en medio libre de suero de 200 l y se sembraron en la cámara superior. El medio acondicionado de cultivo de células NIH3T3 se filtró y se añadió a la cámara inferior como un factor quimiotáctico. Después de 12 h, las células restantes en la superficie superior no invasora se eliminaron, y se fijaron las células en la superficie inferior, se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E), y se contaron. ensayo de migración celular también se realizó utilizando Transwells sin recubrimiento Matrigel. Cada experimento se realizó al menos por triplicado. Invadiendo y el número de células de migración de cámaras de Boyden fueron contadas y los datos se expresaron como media ± SE.
(A) normal tejido ovárico humano, (B) benigno tumor de ovario, (C) de alta diferenciación de carcinoma de ovario, (D) medio de diferenciación del carcinoma de ovario, (E) bajo la diferenciación del carcinoma de ovario (aumento x 200). análisis (F) de Kaplan-Meier de la supervivencia global de los pacientes cuyos tumores tenían una expresión de alto o de bajo SPARC.
xenoinjertos de tumores en ratones desnudos
Balb /c-nu /nu 5 semanas de edad, los ratones hembra desnudos fueron adquiridos desde el Centro Nacional de recursos para roedores de laboratorio animal de China. Cinco ratones desnudos fueron inyectados por vía subcutánea con 5,0 x 10
6 células, y se inyectaron diez ratones desnudos a través de la cola de venas con las mismas células una vez a la semana durante 3 semanas consecutivas. Los ratones se mantuvieron en una instalación para animales estéril y monitoreados para el crecimiento tumoral. Los volúmenes de los tumores se controlaron a los tiempos indicados y se calculan de acuerdo con la fórmula: 0,5 x longitud x anchura
2. Después de 3 meses, los ratones fueron sacrificados y el tumor de pulmón y se diseccionaron y se examinaron histológicamente. Se hicieron secciones de parafina de los tejidos pulmonares, se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E) y se observaron con un microscopio. Los valores medios se expresaron como media ± SE. Este experimento con animales fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Shandong y en cumplimiento con todas las directrices reguladoras.
(A) expresión de la proteína SPARC en las células infectadas por lentivirus-medida por Western blot. (B) la expresión de SPARC mRNA en las células infectadas por lentivirus-medido por Q-RT-PCR. expresión de la proteína (C) SPARC en las células de lentivirus infectadas como se mide por tinción IHC (aumento x 200). * P & lt;. 0,05 frente al control
Análisis de citometría de flujo
Las células se recogieron en la fase de registro y se ajustaron a una densidad de 1~5 × 10
6 /ml con PBS , y después se tiñeron con 20 l de isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con anticuerpos monoclonales durante 30 min a 25 ° C. Todos los anticuerpos anti-β1 incluyendo integrina, β3 anti-integrina y anti-E-cadherina se compraron de BD Biosciences Pharmingen (San Jose, CA, EE.UU.). Finalmente, las células teñidas se analizaron mediante un citómetro de flujo. El análisis de datos se realizó utilizando el programa WinMDI. La prueba se realizó por cuadruplicado.
MMPs Ensayo de actividad por zimografía
El ensayo de actividad de metaloproteinasas de la matriz se realizó en 10% de gel de SDS-PAGE que contiene 0,1 mg /ml de gelatina. 20 g de muestra de proteína se cargó en cada carril de gel SDS-PAGE. Después de la electroforesis, el gel se lavó dos veces con 2,5% Triton X-100 durante 1 h a temperatura ambiente para eliminar SDS y se incubó a 37 ° C durante una noche en tampón de reacción (50 mmo1 /L Tris-HCl pH 7,4, 8,775 g de NaCl y 1.ll g de CaCl
2). Después de la tinción con azul brillante, la actividad de las MMP Coomassie fue identificado como zonas claras contra el fondo azul.
Análisis estadístico
Los datos fueron analizados mediante IHC prueba de chi-cuadrado. Los resultados de los datos de biología molecular celular y se expresaron como la media ± SE. Para la comparación de medias entre los dos grupos, se utilizó una prueba t de dos colas y para la comparación de medias entre los tres grupos, se utilizó un modelo lineal. Curva de supervivencia se calculó utilizando el método de Kaplan-Meier y la prueba de log-rank. El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS versión 13.0. Valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Los genes expresados diferencialmente en el altamente invasiva subclón S1 y S21 baja invasiva subclón
Para descubrir nuevos biomarcadores para invasivo. cáncer de ovario, se realizó un análisis de microarrays para identificar el perfil de expresión génica diferencial del subclon altamente invasiva S1 y S21 baja subclón invasivo. Estos dos subclones se deriva de la línea celular de cáncer de ovario humano SKOV3 parental y tenía un historial genético similar; Por lo tanto, son adecuados para el análisis comparativo. Los datos de microarrays se analizaron mediante el ratio de expresión de corte asignado de 1,5 veces el cambio y
P-valores
≤0.05. Los análisis identificaron 1.596 genes expresados diferencialmente (Tabla S1 y la Figura 1a). Entre estos genes, SPARC fue notablemente hasta reguladas en el subclon altamente invasiva en comparación con el subclón poco invasiva (13,8 veces,
P = 0,023
). En tiempo real Q-RT-PCR, transferencia Western y los resultados de IHC confirmó la sobreexpresión de SPARC en el subclon altamente invasiva (Figura 1BCD).
(A) La proliferación celular como se examinó por el ensayo de MTT. crecimiento independiente (B) Anchorage, medido por el ensayo de formación de colonias en agar blando. (C) las distribuciones del ciclo celular, medida por citometría de flujo. (D) la apoptosis de la célula tal como se mide mediante ensayos de V-PI Anexina. (E) La migración celular y la invasión de ensayo utilizando cámaras de Boyden. * P & lt;. 0,05 frente al control
Expresiones de SPARC en los tejidos de ovario humano
El uso de ambos dos anticuerpos anti-SPARC en los tejidos ováricos normales, expresiones SPARC se baja y se centró principalmente en torno a la vasculatures en el estroma (Figura 2A y 2F), y en los tumores ováricos benignos, la expresión de SPARC también era baja y principalmente centrado no sólo en el estroma, pero también en el citoplasma de las células tumorales (Figura 2B y 2G), finalmente en los carcinomas más de ovario, la inmunorreactividad era alta, y la expresión de alto SPARC se encuentra no sólo en el estroma, pero también en el citoplasma de las células de cáncer de ovario (Figura 2CDE y 2HIJ). Por otra parte, la expresión de alto SPARC se asocia con una baja diferenciación, la etapa alta y estado de los ganglios linfáticos positivos de los carcinomas de ovario (Tabla 2 y 3). Los resultados de experimentos de bloqueo de péptidos demostraron la especificidad del anticuerpo primario (Figura 3ABCDE). Para evaluar el valor pronóstico de SPARC en cáncer de ovario, se realizó un análisis de supervivencia utilizando el método de Kaplan-Meier. El resultado mostró que los pacientes con alta expresión de SPARC tenían un pronóstico mucho peor que aquellos con baja expresión de SPARC (rango,
p = 0,004 log
; Figura 3F) Fotografía de xenoinjertos
(A). disecados de ratones desnudos después de 3 meses de la inoculación subcutánea (n = 5). (B) Desmontables de SPARC inhibió el crecimiento del tumor in vivo. (C) la expresión de SPARC en el tumor formado por células infectadas SPARC shRNA medido por tinción IHC (aumento x 200). (D) la expresión de SPARC en el tumor formado por células infectadas de control shRNA medido por tinción IHC (aumento x 200). (E) Fotografía de metástasis de pulmón en el microscopio después de 3 meses de la inoculación a través de vena de la cola (n = 10). * P & lt;. 0,05 frente al control
Desmontables de SPARC expresión por Lentivirus mediada por ARN de interferencia
Para investigar el papel de SPARC en el cáncer de ovario, se construyó vector lentiviral con SPARC y shRNA las células infectadas subclon altamente invasivos (S1 y HO8910PM). Se obtuvieron los datos similares en las células S1 y HO8910PM siguientes infecciones por virus de SPARC shRNA. Después de la infección viral, más de 80% de células eran positivas para GFP, lo que indica una alta eficiencia de entrega shRNA. En tiempo real Q-RT-PCR, Western Blot y IHC confirmó la baja regulación de la expresión de SPARC por su shRNA tanto a nivel de ARNm y proteínas, como se muestra en la Figura 4.
(A) Los genes diana aguas abajo de SPARC, medido por q-RT-PCR. (B) P53, P21, la expresión de la proteína ciclina D1, PCNA, Bcl-2 y Bax en las células infectadas por lentivirus-medida por transferencia de Western. expresión de la proteína (C) E-cardherin en las células infectadas por lentivirus, medido por tinción IHC (aumento x 200). actividades (D) MMPs miden por zimografía. * P & lt; 0,05 frente al control
desmontables de SPARC expresión suprimidos células del cáncer ovárico proliferación
A continuación, se investigó el efecto de la caída de SPARC sobre la proliferación de las células subclon altamente invasivos (. S1 y HO8910PM). resultados de MTT demostraron que SPARC caída redujo significativamente la proliferación celular de células S1 y HO8910PM (Figura 5A). En ensayo de formación de colonias en agar suave, las células S1 y HO8910PM infectadas con virus SPARC shRNA mostraron una reducción significativa en la formación de colonias (Figura 5B). No se encontraron diferencias significativas entre las células infectadas por el virus de control shRNA y células no infectadas.
Desmontables de SPARC expresión inducida detención del ciclo celular en la fase G1 /G0
Para entender el mecanismo por el cual el la proliferación de células de cáncer de ovario fue inhibida por desmontables expresión de SPARC, se utilizó citometría de flujo para identificar las fases específicas del ciclo celular. Como se muestra en la Figura 5C, S1 y células infectadas con HO8910PM SPARC shRNA contenida 20~30% más células en la fase G1 o G0 (G1 /G0) (
P Hotel & lt; 0,05) en comparación con el control shRNA infectados Células. Estos datos indicaron que desmontables de expresión de SPARC inhibe la proliferación de células de cáncer de ovario mediante el bloqueo de la progresión de la fase G1 /G0 a la fase S durante el ciclo celular.
Desmontables de SPARC expresión inducida cáncer de ovario Cell apoptosis
Como se muestra en la figura 5D, el porcentaje de células apoptóticas infectadas con SPARC shRNA era mucho más alta que en el grupo control shRNA (P & lt; 0,05). No se encontraron diferencias significativas entre las células infectadas por el virus de control shRNA y células no infectadas. Estos datos indicaron que desmontables de expresión de SPARC indujo apoptosis de las células de cáncer de ovario.
desmontables expresión de SPARC inhibido Cáncer ovárico Las células migración y la invasión
Además, examinó el efecto de SPARC caída en la migración y la invasión de las células subclon altamente invasivos (S1 y HO8910PM). Como se muestra en la Figura 5E, desmontables de SPARC inhibida de ovario células de cáncer de invasión y la migración. Se obtuvieron los datos similares en las células S1 y HO8910PM siguientes infecciones por virus de SPARC shRNA. El invasor promedio o la migración de recuento celular de las células infectadas SPARC shRNA fue mucho menor que la de las células infectadas de control de ARNhc. No se encontró diferencia significativa entre las células infectadas control de shRNA y las células no infectadas.
Desmontables de SPARC expresión inhibe el crecimiento tumoral y la metástasis de pulmón en ratones desnudos
La formación de tumores se realizó en S1 subclón infectado por virus de SPARC shRNA en ratones desnudos. Las células se inocularon por vía subcutánea en ratones desnudos y el crecimiento del tumor se midió después de 3 meses. Como se muestra en la figura 6A y B, desmontables de SPARC mostró una disminución en el tamaño de los tumores se comparan con su contraparte control. No hubo diferencia significativa entre las células infectadas de control shRNA y células no infectadas en la formación de tumores de ratones desnudos. Los tumores se diseccionaron, fijado por formalina y embebido por parafina, a continuación, se hicieron experimentos de IHC, el tumor formado por células infectadas SPARC shRNA mostró expresión SPARC inferior (figura 6C), mientras que el tumor formado por las células infectadas de control shRNA mostró una mayor expresión de SPARC ( Figura 6D). Por otra parte, la figura 6E muestra la metástasis de pulmón en el microscopio después de la inyección de las células de control infectadas shRNA y células no infectadas a través de las venas de la cola de ratones desnudos. Alrededor del 50% de las metástasis pulmonares se encontraron después de 3 meses en los ratones desnudos inyectados con células infectadas control de shRNA y células no infectadas, mientras que no se encontró metástasis pulmonar después de la inyección con células infectadas SPARC shRNA en ratones desnudos.
El los genes diana de SPARC en que afecta a la proliferación de células cáncer de ovario, la apoptosis y la invasión
para comprender el mecanismo de SPARC en la proliferación del cáncer de ovario, la apoptosis y la invasión, en tiempo real RT-PCR cuantitativa se utilizó para detectar las diferentes expresiones de E-cadherina, β-catenina, alfa-catenina, β3 integrina β1 de integrina, la ILK, FAK, P53, P21, ciclina D1, PCNA, Bcl-2, Bax, u-PA, uPAR, PAI-1, MMP2, MMP9, TIMP1 y TIMP2 entre SPARC shRNA infectaron células subclone S1 y control de shRNA infectaron células subclone S1. Como se muestra en la Figura 7A, la ciclina D1, PCNA, Bcl-2, MMP2 y MMP9 fueron significativamente las reguladas en las células infectadas SPARC shRNA. Además, se encontraron altos niveles de expresión de E-cadherina, P53, P21 y Bax en las células infectadas SPARC shRNA. No hubo diferencias significativas en la expresión de β-catenina, α-catenina, β3 integrina β1 integrina, CIC, FAK, u-PA, PAI-1, uPAR, TIMP1 y TIMP2 entre las células infectadas SPARC shRNA y de control de las células infectadas shRNA . Los resultados de citometría de flujo (Tabla 4) y Western Blot (Figura 7B) confirmaron que la E-cadherina P53, P21 y Bax fueron reguladas y ciclina D1, PCNA y Bcl-2 se redujeron regulado en las células infectadas SPARC shRNA. experimentos de IHC revelaron que la expresión de E-cadherina aumentó en el citomembrana de las células infectadas SPARC shRNA (Figura 7C). Los resultados mostraron que Zymography las actividades de MMP se redujeron significativamente en SPARC shRNA células infectadas (Figura 7D).
Discusión
En este estudio, el uso de todo el genoma de perfiles de transcripción, se identificó que SPARC se sobreexpresa en el subclon SKOV3 altamente invasiva en comparación con el subclón poco invasiva. Un análisis más detallado de la expresión de SPARC en 140 tejidos de ovario humano reveló que SPARC se sobreexpresa en tumores malignos de ovario y se asocia con características clínico pobres. Estos resultados sugieren que SPARC puede jugar un papel importante en el desarrollo de cáncer de ovario. Con el anticuerpo AON-5031, se observaron resultados similares en 8 tejidos normales de ovario y 24 cánceres de ovario invasivos humanos [13], y 14 tejidos ováricos normales y 48 cánceres de ovario [14]. Todos ellos encontraron que SPARC fue hasta reguladas en el estroma reactivo asociado con el cáncer de ovario invasivo. En nuestro estudio, con el AF941 anticuerpo y BS-1133R, se encontró que la inmunorreactividad de SPARC se acentuó no sólo en el estroma, pero también en el citoplasma de las células de cáncer de ovario. Por el contrario, con el LF-54 anticuerpo, otro estudio indicó que la expresión de SPARC es el regulado en el cáncer de ovario; exógena SPARC inhibe la proliferación e induce la apoptosis en células de cáncer de ovario [21]. Sin embargo, en nuestro estudio, por la interferencia de ARN lentivirus mediada, encontramos que desmontables de expresión SPARC suprime la proliferación celular, la apoptosis celular inducida, y la invasión de células inhibida y la metástasis en células de cáncer de ovario. Resultados similares se han encontrado en las células de cáncer gástrico [26], las células de glioma [27] y células de melanoma [28], por la interferencia de ARN. En nuestra investigación, se encontró que SPARC no sólo fue secretada por el estroma, sino también secretada por las células de cáncer de ovario y puede ejercer efectos importantes intracelular después de estas células. Desmontables de SPARC puede inhibir el crecimiento de células de cáncer de ovario y la invasión. Se encontró que SPARC difundido desde el estroma a dominios de cáncer. En este proceso, SPARC puede jugar un papel en la promoción de la invasión y la metástasis de cáncer de ovario. Los resultados inconsistentes sobre la expresión de SPARC en los tejidos ováricos pueden ser debido a los diferentes anticuerpos SPARC utilizados en estas investigaciones. En conclusión, las funciones de SPARC en el cáncer de ovario necesitan más estudios.
En este estudio, utilizando el ensayo MTT y el ensayo de formación de colonias en agar blando, llegamos a la conclusión de que desmontables de SPARC suprime la proliferación de células de cáncer de ovario. Citómetro de flujo mostraron que desmontables de SPARC redujo el número de células en la fase S, mientras que el aumento del número de células en /de fase G0 G1, lo que indica la detención de G1 /G0. Para comprender el mecanismo de SPARC en la proliferación de cáncer de ovario, detectamos las diferentes expresiones de ciclina D1, PCNA, p53 y p21 entre las células infectadas y SPARC shRNA de control de las células infectadas shRNA.
La ciclina D1, un miembro de las ciclinas G1 y PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular) se utilizan comúnmente para evaluar la proliferación de células tumorales [29], [30]. P53, un gen supresor de tumores, y P21 (inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina), un mediador clave de la p53, pueden inducir la detención del ciclo celular en el punto de control G1-S [31], [32].