Extracto
El G-receptor acoplado a proteína (GPCR), cisteína (C) -X-C Receptor 4 (CXCR4), juega un papel importante en la metástasis del cáncer de próstata. CXCR4 es generalmente considerado como un receptor de membrana de plasma en el que transmite señales que soportan la transformación, la progresión y la eventual metástasis. Debido al papel central de CXCR4 en la tumorigénesis, la terapéutica enfoques, tales como antagonistas y anticuerpos monoclonales se han centrado en receptores que existen en la membrana plasmática. Un concepto emergente para los receptores acoplados a proteína G es que pueden localizarse en y asociado con el núcleo en el que conservan la función y median la señalización nuclear. En esto, hemos demostrado que CXCR4 asociado con el núcleo de los tejidos malignos de cáncer de próstata. Del mismo modo, se detectó expresión de CXCR4 en las fracciones nucleares entre varias líneas celulares de cáncer de próstata, en comparación con las células epiteliales normales de la próstata. Nuestros estudios identifican un grupo nuclear de CXCR4 y que definen una vía de transporte nuclear de CXCR4. Nos revelan una supuesta secuencia de localización nuclear (NLS), 'RPRK', dentro de CXCR4 que contribuyó a la localización nuclear. Además, CXCR4 nuclear interactuó con Transportinβ1 y Transportinβ1 de unión a CXCR4 promueve su translocación nuclear. Es importante destacar que, G estudios
inmunoprecipitación αi y la movilización de calcio indicaron que CXCR4 nuclear era funcional y participaron en la señalización de la proteína G, revelando que la piscina nuclear de CXCR4 función retenido. Teniendo en cuenta la sugerencia de que funcional, CXCR4 nuclear puede ser un mecanismo que subyace a la recurrencia del cáncer de próstata, el aumento de la capacidad metastásica y más pobre pronóstico después de tumores han sido tratados con la terapia que se dirige a la membrana plasmática CXCR4, estos estudios se dirige a un nuevo mecanismo de señalización nuclear para CXCR4, una novela mecanismo de orientación clínica, y demostrar una piscina nuclear activa que proporciona nueva información importante para iluminar lo que ha habido informes clínicos principalmente de CXCR4 nuclear
Visto:.-Don Salu-Hewage AS, Chan SY, McAndrews KM, Chetram MA, Dawson MR, Bethea DA, et al. (2013) Cisteína (C) -X-C receptor 4 se somete a Transportin 1-dependiente de localización nuclear y sigue siendo funcional en el núcleo de las células metastásicas del cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (2): e57194. doi: 10.1371 /journal.pone.0057194
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: noviembre 20, 2012; Aceptado 18 de enero de 2013; Publicado: 28 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Don-Salu-Hewage et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado, en parte, por los Institutos nacionales de Salud subvenciones 2R25GM060414, P201MD002285 (CVH), F31CA153908 (MAC), 2G12RR003062-22 (CVH) y la colaboración de la AAAS Mujeres Investigación Internacional (WIRC) para instituciones de las minorías de la porción (MSI), un Consejo Nacional de Ciencia Apoyo de la Fundación (CVH). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es la segunda causa principal del aumento de la incidencia de cáncer y muertes relacionadas con el cáncer entre los hombres en los Estados Unidos [1], [2]. A pesar del tratamiento, las altas tasas de mortalidad en el CaP se atribuyen a la metástasis, que es el principal obstáculo en el tratamiento del CaP [3]. Varias moléculas y mecanismos contribuyen a la metástasis de células de cáncer. Por ejemplo, las citoquinas quimioatrayentes (quimiocinas) mejora el potencial metastásico de CaP mediante la unión y la activación de una familia de receptores acoplados a proteína G (GPCR) [4], [5], [6], [7] que inician señales para mejorar célula adhesión, invasión y movimiento, y, posteriormente, la supervivencia del tumor en el nuevo sitio de la metástasis. GPCRs constituyen la mayor familia de membrana plasmática transmembrana (PM) receptores [8]. En la señalización de GPCR convencional, los receptores están localizados en el PM e influyen en la actividad de las enzimas localizadas-PM, canales de iones, y /o segundos mensajeros. Su activación por un ligando apropiado desencadena la señalización a través de la proteína G alfa (G
α) y /o subunidades beta-gamma (G
βγ) [9], lo que lleva a resultados dependientes del contexto, que puede positivamente y /o regular negativamente la actividad de las moléculas efectoras en cascadas de señalización dentro de la célula [10], [11]. Además, GPCRs activados también desencadenar una serie de interacciones moleculares que permiten la regulación de la retroalimentación de acoplamiento de proteína G y la endocitosis del receptor para atenuar las señales de los receptores [12] [13], [14], [15], [16], [17, ], [18]. Müller
et al
. inicialmente descrito la implicación de los receptores de quimiocinas GPCR en la metástasis del cáncer [19] y Akashi
et al.
informó que la quimiocina GPCR, CXCR4, fue altamente expresado en el CaP maligno humano en comparación con la próstata normal [20]. Numerosos estudios han documentado la participación de CXCR4 en las principales etapas de la metástasis del CP: (i) de señalización; [21], [22]; (Ii) la invasión y la migración [23]; y (iii) el establecimiento de una red vascular [24]. Por lo tanto, varios agentes terapéuticos para la metástasis de células de cáncer se han diseñado para antagonizar CXCR4 mediada por la señalización de [25], [26]. En la señalización CXCR4 convencional, estromal derivada de células factor de 1 alfa (SDF1α) es el ligando exclusivo para CXCR4 [27], que conduce a la activación de las vías hace que este receptor favorable a la tumorigénesis: (i) G-receptor acoplado a proteína (GPCR) de señalización ; (Ii) PI3K /AKT; (Iii) MAPK; (Iv) JAK /STAT; (V) la quinasa Src y (vi) HER2 [28], [29], [30].
Curiosamente, los GPCRs se han detectado en los orgánulos subcelulares distintas de su ubicación clásica PM [31]. Estos orgánulos incluyen el aparato de Golgi [32], el retículo endoplasmático [33], el citoesqueleto [34] y el núcleo /membrana nuclear [35]. Hanyaloglu y von Zastrow postularon que el reciclaje por defecto de los GPCR por endosomas puede contribuir a mejorar la re-entrega de GPCRs a la PM, o para orgánulos alternativos dentro de la célula, sin destruir su capacidad de señalización [36]. Sin embargo, estos receptores GPCR localizadas alternativamente-revelan un nuevo nivel de complejidad que puede ser importante en la modulación de su función. Un número creciente de GPCRs se han observado en el núcleo o la membrana nuclear, tales como los receptores lisofosfatıdico de ácido, los receptores de glutamato metabotrópicos, receptores de factor activador de plaquetas, la angiotensina 2 receptores de tipo I, receptores de prostaglandinas, receptores de endotelina, liberadora de gonadotropina tipo hormona I receptor [ ,,,0],37] y
β-adrenérgicos
[38], [39], [40], [41], [42], [43], [44]. GPCRs nucleares se han sugerido para regular una serie de procesos fisiológicos, incluyendo la proliferación celular, la supervivencia, las respuestas inflamatorias, la tumorigénesis, la síntesis de ADN y la transcripción [43], [45], [46] [47], [48], [49, ], [50]. GPCRs nuclear puede ser constitutivamente activo o activado por ligandos internos, recién sintetizadas que están enlazados para la secreción de [51]. Posteriormente, las vías de señalización de segundo mensajero clásicos, como la proteína inducida por la adenilato ciclasa quinasa A (PKA) de activación [38], la liberación de fosfolipasa inducida de calcio intranuclear, Protein diacyglycerol inducida quinasa C (PKC) [39], [52], ERK1 /2, quinasas p38 MAP y la proteína quinasa B (PKB) [49], [50] han demostrado ser activado por GPCRs nucleares.
localización nuclear de las proteínas es dictada por la importación nuclear y la exportación a través nuclear complejos de poro [53]. Las proteínas pequeñas (& lt; 30-50 kDa) puede pasar a través de los poros nucleares por difusión gratuita; Sin embargo, la mayoría de las proteínas de carga requieren el transporte activo a entrar en el núcleo [54]. Las proteínas más grandes utilizan mecanismos de transporte activo, que requieren la asistencia de las proteínas de transporte [55], [56], [57]. Muchas proteínas dirigidas al núcleo contienen una señal de localización nuclear clásica (NLS) que es reconocida por un receptor de importación heterodimérico compuesto de alfa y beta importin importin. Muchos de estos receptores reconocen directamente proteínas de carga y dirigirse a ellos directamente al poro nuclear [58]. En el caso de esta gran familia, las señales de orientación dentro de las proteínas de carga a menudo no están bien definidos [59]. Cada proteína que localiza al núcleo debe poseer una NLS funcional o se requiere para unirse a las proteínas de carga que poseen una NLS (s). alfa Importin reconoce la NLS en la proteína de carga mientras que el beta importin dirige el complejo de importación para que los poros nucleares [58], [60]. Importin beta es parte de una familia más grande de receptores de transporte a menudo se denomina importins /exportinas [59].
Mientras que una NLS putativa ha sido identificada en CXCR4 [61], la función de esta señal de direccionamiento nuclear en el contexto de CXCR4 no se ha examinado. Una vía de transporte importin dependiente de distinta ha sido implicado en el transporte de C-C del receptor de quimiocinas de tipo 2 (CCR2) [62]. Favre
et al
. encontrado que una ingeniería, CCR2 marcada con HA asociado con un miembro de la familia de los receptores de importin transporte nuclear, Transportinβ1 (TRN1), en una línea celular CCR2-null [62]. se requiere una interacción de CCR2 con TRN1 para detectar CCR2 en las fracciones nucleares, lo que sugiere que CCR2 transportada al núcleo a través de TRN1 [62]. TRN1 ha sido implicado en GPCR internalización y la desensibilización [63]. Por otra parte, TRN1 sirve como receptor para proteínas NLS-NLS-nulos en sustratos que contienen carga [64], por lo que es una proteína esencial para la importación a través del complejo de poro nuclear [65]. Tomados en conjunto, estos estudios sugieren que tanto la maquinaria de importación nuclear clásica y TRN1 son candidatos que juegan un papel en CXCR4 translocación nuclear [66].
expresión de la proteína nuclear de CXCR4 se ha observado en hepatocelular maligno, colorrectal, de células renales y carcinomas nasofaríngeos [67], [68], [69], [70]. Estos estudios, sin embargo, se informaron como observaciones clínicas, y no investigaron los mecanismos de CXCR4 localización o cualquier función biológica asociada con el receptor nuclear. Estos datos son coherentes con los informes de que han demostrado GPCRs funcionales asociados con el núcleo, y contribuir aún más a las intervenciones terapéuticas de cáncer en curso contra CXCR4. Es importante destacar que una CXCR4 nuclear funcional puede contribuir a la PCa recaída a pesar de antagonistas actuales y anticuerpos monoclonales contra CXCR4 con destino a PM y no puede ser diseñado para cruzar el PM, que sería necesaria para antagonizar CXCR4 activo en el núcleo. Por otra parte, la identificación de las vías de transporte necesario para la localización nuclear de CXCR4 puede revelar objetivos adicionales para el desarrollo terapéutico para impedir la metástasis del cáncer de próstata y mejorar la supervivencia de los pacientes.
Materiales y Métodos
Cultivo de células, anticuerpos y Reactivo Condiciones
PC3, DU145, 22Rv1 líneas celulares de cáncer de próstata humano (PCA), línea celular de próstata humano RWPE1 y la línea celular de riñón embrionario humano 293T se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC). PC3, las células DU145, 22Rv1 y 293T se mantuvieron en completa medios RPMI: RPMI 1640 que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), aminoácidos no esenciales al 1% y 1% de antibiótico-antimicótico a 37 ° C en 5% de CO
2. células RWPE1 se mantuvieron en medio libre de suero de queratinocitos (KSFM) que contiene 50 mg /ml de gentamicina, 0,05 mg /ml de extracto de pituitaria bovina (BPE), y 5 ng /factor de crecimiento epidérmico ml (Invitrogen) a 37 ° C en 5% CO
2. Todas las células se mantuvieron a 60% a 80% de confluencia. células PC3 se aislado originalmente de una metástasis vertebral de próstata, mientras que se obtuvieron las células DU145 de metástasis cerebral de próstata. 22Rv1 células eran de una línea de células epiteliales de carcinoma de próstata humano procedentes de un xenotrasplante de que se propagó en serie en ratones, y se aislaron células RWPE1 de epitelio de próstata humano normal. suministros de cultivo celular y sulfato de kanamicina (61-176-RG) eran de MediaTech; SDF1α (300-28A) era de PeproTech. Los siguientes reactivos y anticuerpos humanos eran de Señalización Celular: 10 × tampón de lisis celular (9803), IgG de ratón anti-conejo (5127), anti-CD44 (156-3C11), anti-GFP (2956S) y anti-G
αi (5290). Anti-CXCR4 (MAB172) era de R & amp; D Systems. Anti-Topoisomerase1 (SC-271285), anti-Lamin A /C (SC-20681), Fusin (H-118) -CXCR4 (SC-9046), Fusin (4G10) -CXCR4 (SC-53534), anti-fibronectina IgG2B (SC-271098), anti-GFP (sc-9996), /G Plus-agarosa cuentas de proteína A (SC-2003), anti-Karyopherinβ2 (SC-166127), Karyopherinβ2 siRNA (h) (SC-35737) y DAPI (SC-3598) eran de Santa Cruz Biotech. NE-PER nuclear y citoplasmática Kit de Extracción (78833), inhibidor de proteasa Cocktail Kit (78410) y detener TM Fosfato de cóctel inhibidor (78420) eran de Thermo Scientific. Anti-αTubulin (T5168), anti-βActin (A5441) de Triton X-100 (T8532) y yoduro de propidio (P4170) fueron de Sigma-Aldrich. array tejido espectro de la enfermedad de la próstata (PR8011) se adquirió de Biomax. reactivo de transfección JetPRIME® Pólipo (114-07) era de VWR International. Nonidet P-40 Sustituto (M158) era de BioExpress y FluoForte Kit de ensayo de calcio (ENZ-51016) fue de Enzo Life Sciences
Caracterización de CXCR4 IgG2B (R & amp; D systems). Anticuerpo
La especificidad del anticuerpo monoclonal de ratón anti-CXCR4 humano (R & amp; D Systems) a la proteína de CXCR4 se determina por inmunoprecipitación y análisis de transferencia Western usando PC3 CXCR4-positivas y 293T CXCR4 nulo lisados de células enteras. Brevemente, las células PC3 y 293T (5 × 10
6) se cultivaron en placas de 100 mm en medio completo durante la noche, seguido de incubación en medio RPMI solamente (privación de suero) durante 24 hrs. Las células se lavaron con 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se cosecha en la señalización de tampón de lisis 1 × Cell. concentraciones iguales de proteína se estimaron mediante el ensayo de Bradford (BioRad) y cantidades iguales fueron evaluados por Western blot con el anticuerpo monoclonal de ratón CXCR4 IgG2B o 1 mg de sobrenadante fue inmunoprecipitado (IP) con anticuerpo monoclonal de ratón CXCR4 IgG2B o fibronectina-IgG2B monoclonal de ratón anticuerpo durante la noche a 4 ° C (Santa Cruz; 1 g por 250 g de proteína), seguido por incubación con /G Plus-perlas de agarosa de proteína a durante 2 horas a 4 ° C. perlas de agarosa unida a proteínas se separaron a partir de lisados de una serie de 3 lavados con 1 x PBS y (temperatura máxima velocidad /2 min /habitación [RT]) centrifugación. Granos en tampón Lammelli fueron separados por 10% SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) y se sondaron para CXCR4-IgG2B (1:1000). Para confirmar que las células PC3 expresadas fibronectina, 25 g de lisado de células enteras fueron cosechadas para el análisis de transferencia Western. Beta-actina se utilizó como control de carga.
La inmunohistoquímica (IHC)
análisis
IHC se realizó en una matriz de tejido espectro de la enfermedad de la próstata (Biomax) que oscila de normal a los tejidos metastásicos de alto grado. La matriz constaba de 80 núcleos de tejido totales incluyendo adenocarcinoma, metastásico, hiperplasia, inflamación crónica, el tejido normal adyacente y el tejido normal. Cada núcleo individual tenía un diámetro de 1,5 mm y un espesor de 0,5 micras. Brevemente, las muestras, incluidas en parafina fijadas con formalina se recuperaron en lavados de xileno, etanol, y la solución de recuperación de antígeno, pH 6,0, (Biocare Médica) a 125 ° C durante 30 segundos. Las muestras se neutralizaron en peróxido de hidrógeno 0,3% durante 15 min a temperatura ambiente (RT), se lavó con 1 x PBS en una cámara humidificada y se bloquearon con solución de bloqueo (5% de suero normal de cabra /solución salina tamponada con Tris /Tween-20; TBST) por 30 min. CXCR4 se detectó con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano CXCR4 (R & amp; D Systems; 1:1000) en solución de bloqueo durante la noche a 4 ° C, seguido por una afinidad de biotina de cabra purificado anti-IgG de ratón (H + L) anticuerpo secundario ( vector Laboratories; 1:1000), en solución de bloqueo durante 30 min a RT. Las muestras se lavaron a fondo entre las incubaciones, desarrollado en diaminobenzidina (Vector Laboratories) durante 3 min a RT, y de contraste con hematoxilina de Meyer utilizando técnicas estándar. Una muestra de tejido de control negativo se preparó incubando en cabra purificado por afinidad con biotina anti-ratón IgG (H + L) de anticuerpo, solamente, como se describe anteriormente. Los especímenes fueron analizados y fotografiados por el Dr. Wang Dezhi [71] en el Centro de Core Laboratorio de Enfermedades Metabólicas Óseas, Escuela de Medicina de la UAB, Birmingham, Alabama. La distribución de células positivas para CXCR4 se registró para retratar el difusa o naturaleza focal de las células positivas como esporádicos (células positivas & lt; 5%); focales (células positivas & gt; 11% pero inferior al 50%); o difuso (células positivas & gt; 50%). de acuerdo con la densidad media de células positivas para CXCR4 (DAB manchada), para ver la diferencia obvia en la fuerza de la expresión de CXCR4
Histomophometry Medición de la intensidad de la tinción de CXCR4 en Los tejidos de cáncer de próstata
La densidad media de células positivas (DAB manchado) se midió mediante el uso de software de análisis de imagen BIOQUANT® (RtmBometrics) y un microscopio Olympus BX51 con una cámara Q-Imaging. El software analiza un grupo promedio de píxeles y devuelve un valor de datos basado en el valor de color de los píxeles en muestras teñidas. Tres campos aleatorios de tejidos de la próstata se seleccionaron con un aumento de (400X) para cada sección en función del tamaño del tejido. En cada área al azar, se seleccionaron las células (un grupo de píxeles) que se tiñeron positivamente (marrón) con el anticuerpo CXCR4 por la herramienta de umbral del software. La fuente de luz espécimen se sabe que afectan a la medición de densidad; Por lo tanto, se midieron todas las secciones que utiliza la misma corrección de fondo suministrado por Bioquant.
Fraccionamiento subcelular
CaP y las células epiteliales normales de la próstata (1 × 10
6) se privaron de suero durante 3 hrs (22Rv1 y RWPE1) o 24 horas (PC3 y DU145), antes de tratar con SDF1α (100 ng /l) durante 30 min. fraccionamientos subcelulares se realizaron según las instrucciones del fabricante (Thermo Scientific). Brevemente, las células se lisaron en una serie de tampones y etapas de centrifugación para obtener una fracción no nuclear y un pellet nuclear intacta, seguido de nuevo de lisis para aislar proteínas nucleares. Cuarenta a cien microgramos de fracciones nucleares y no nucleares se separaron mediante electroforesis SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Se detectó la expresión de CXCR4 o proteína de fusión GFP-CXCR4 con un anticuerpo monoclonal de ratón GFP (Santa Cruz; 1:500) o anticuerpo anti-CXCR4 humana (I + amp; D Systems; 1:1000). Anti-topoisomerasa I (Santa Cruz; 1:1000) y anti-CD44 (Señalización Celular; 1:1000) anticuerpos se utilizaron para asegurar la integridad de las fracciones y, como controles de carga. películas de rayos X se escanearon y se utilizó Cantidad Un programa de software para el análisis de densitometría.
inmunocitoquímica indirecta (CPI) para CXCR4
Las células (3 × 10
5) se sembraron sobre vidrio cubreobjetos (Fisher), privadas de suero como se describe, antes de los tratamientos con SDF1α (100 ng /l). Las células fueron fijadas con helado de 100% de metanol durante 5 min a -20 ° C y se lavaron con 1 x PBS. Las proteínas no específicas se bloquearon en solución de bloqueo (3% normal de burro suero /1% BSA /0,1% Triton X-100 en 1 x PBS) durante 30 min a TA, antes de la incubación con CXCR4 (amp I +; D Systems, 1: 100), Lamin a /C (Santa Cruz, 1:100), o anticuerpo monoclonal de ratón GFP (Santa Cruz, 1:100) en solución de bloqueo a 4 ° C durante la noche. detección secundaria estaba con burro conjugado con Cy3 anti-IgG de ratón conjugado con FITC o IgG anti-conejo (Jackson Immuno Research, 1:1000) en solución de bloqueo a TA durante 1 h, seguido de tres lavados en 1 × PBS. En algunos casos, se detectaron núcleos con yoduro de propidio (1 mg /l) o DAPI (1:250) en 1 x PBS antes de su montaje en Aqua-Polymount (Polyscience, Inc). Las imágenes fueron tomadas en el Instituto de Tecnología de Georgia, Atlanta, GA con un 63x Plan-Apocromático 63x /1,40 objetivo aceite DIC en un Zeiss LSM-510 UV microscopio confocal a una excitación de 488 nm para FITC y 543 nm para Cy3 o la Universidad Clark Atlanta, Atlanta, GA con el software Axiovision 4.8.2 en un microscopio de fluorescencia Zeiss Axio Imager.z1 a 40 aumentos a una excitación de 470 nm para FITC, 358 nm para DAPI y 551 nm para Cy3.
Mutagénesis
R146A y R148A mutaciones puntuales dentro de la NLS, y la supresión de la NLS, dentro de la proteína de fusión GFP-CXCR4 se generaron utilizando el Quik Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene); pEGFPN1-CXCR4 sirve como la plantilla [72]. Los cebadores directo e inverso de R146A, R148A y las NLS eliminados eran (Tecnologías de ADN integrado): (i) R146A: FWD5'-CACGCCACCAACAGTCAGGCACCAAGGAAGCTGTTGGCTG-3 ', 5'-REV CAGCCAACAGCTTCCTTGGTGCCTGACTGTTGGTGGCGTG-3'; (Ii) R148A: FWD5`-CCAACAGTCAGAGGCCAGCGAAGCTGTTGGCTGAAA-3`, REV-5 `TTTCAGCCAACAGCTTCGCTGGCCTCTGACTGTTGG-3`; y (iii) eliminación NLS: FWD5'-CGCCACCAACAGTCAGCTGTTGGCTGAAAAGG-3 'y REV5'-CCTTTTCAGCCAACAGCTGACTGTTGGTGGCG-3'. Los plásmidos resultantes fueron pEGFPN1-CXCR4R146A, pEGFPN1-CXCR4R148A y pEGFPN1-CXCR4ΔNLS. Positivo CXCR4 clones mutantes se seleccionaron con kanamicina y se purificaron adicionalmente por maxi-prep (Omega Bio-tek). La exactitud de las mutaciones se confirmó mediante secuenciación de ADN en un ABI 3130 XL Analizador de Gene secuenciador en la Escuela de Medicina Morehouse, Atlanta, GA.
transitoria transfecciones
Las transfecciones transitorias se realizaron con 2 g de concentrado ADN y transfección jetPRIME® pólipo, según las instrucciones de los fabricantes. Brevemente, las células PC3 se incubaron con los complejos de ADN-jetPRIME® en 15% de FBS /RPMI durante 4 horas y el medio se reemplazó con 15% de SFB en medio RPMI durante 18 horas adicionales, antes de la privación de suero (24 horas). Las células fueron cosechadas por respectivos experimentos.
Expresión de Transportinβ1 (TRN1)
células privadas de suero (5 × 10
6) fueron tratados con SDF1α durante 30 minutos antes de la recolección 60 g de lisados de células enteras para el análisis de transferencia de Western. Expresión de TRN1 se detectó con un anticuerpo monoclonal de ratón (Santa Cruz; 1:1000); se utilizó α-tubulina o β-actina como control de carga
inmunoprecipitación
Un miligramo de PC3 lisados de células enteras se inmunoprecipitaron para CXCR4. (Santa Cruz; 1 g por 250 g de proteína) durante la noche a 4 ° C, seguido de incubación con perlas de proteína a /G Plus-agarosa (Santa Cruz) durante 2 horas a 4 ° C. perlas de agarosa CXCR4-bound fueron separados de lisado por una serie de 3 lavados con PBS y centrifugación a velocidad máxima durante 1 min a 4 ° C. Las perlas se procesaron para análisis de transferencia Western para TRN1 (Santa Cruz; 1:1000) y posteriormente se volvieron a sondar para CXCR4 con anticuerpo anti-CXCR4 conejo (Santa Cruz, 1:500) seguido de incubación con IgG de ratón anti-conejo (Cell Signaling) secundario anticuerpo. Treinta microgramos del sobrenadante obtenido después de la incubación con perlas de agarosa también se separaron por 10% SDS-PAGE, y se procesa para el análisis de Western blot para CXCR4 como se describe en la caracterización de anticuerpos CXCR4.
ARN corto de interferencia Transfección
transfección transitoria de TRN1 siRNA específico (Santa Cruz) se realizó en células PC3 sembradas en placas sobre cubreobjetos de vidrio utilizando JetPRIME®. Brevemente, las células (2 × 10
5) se sembraron en 35 mm, placas de 6 pocillos y se transfectaron con 50 nM TRN1-siRNA (Santa Cruz) en 15% de FBS /RPMI medios a 37 ° C en 5% de CO
2 durante 24 horas. Posteriormente, las células transfectadas se privaron de suero durante 24 horas, antes del análisis de inmunocitoquímica.
La inmunoprecipitación de G
αi
células privadas de suero (5 × 10
6) eran tratado con SDF1α por 30 min antes de la cosecha para la inmunoprecipitación. Brevemente, las células se lavaron en 1 x PBS y se rasparon suavemente en tampón de lisis NP-40 (1 x PBS pH 7,4, 0,1% Triton x 100, 0,1% de NP40 y 1 × inhibidor de cóctel). Después de 30 min de incubación en hielo, el lisado se centrifugó a 600 RCF /5 min /4 ° C). El sobrenadante se decantó con cuidado y el sedimento nuclear se volvió a suspender en tampón de lisis, 10 veces el volumen del sedimento de núcleos, y se sonicó en hielo durante 3 seg. El lisado se centrifugó a 600 RCF /5 min /4 ° C, y se inmunoprecipitó 1 mg de sobrenadante para CXCR4 (monoclonal de ratón, Santa Cruz) durante la noche a 4 ° C, seguido de incubación con /G Plus-agarosa cuentas de Proteína A ( Santa Cruz) durante 2 horas a 4 ° C. perlas de agarosa CXCR4 unido se separaron del lisado por una serie de 3 lavados con tampón de lisis NP40 y centrifugación (5000 pm /2 min /RT). El lavado final fue con 1 × PBS. Las perlas se procesaron para análisis de transferencia Western y las membranas se probaron para G
αi (Señalización Celular; 1:1000). Posteriormente, las manchas de transferencia se volvieron a sondar para CXCR4 con anticuerpo de conejo anti-CXCR4 (Santa Cruz, 1:500) seguido de incubación con IgG de ratón anti-conejo (Cell Signaling) anticuerpo secundario. Topoisomerase1 (Santa Cruz) y anti-CD44 (Señalización Celular) se utilizaron para evaluar la pureza de lisados núcleos.
Intranucleares Calcio (Ca
2 +) Movilización
PC3 suero de hambre
las células (2,5 × 10
5) se recogieron para obtener núcleos intactos en tampón de lisis NP-40 como se describió anteriormente, antes de realizar el ensayo según las instrucciones del fabricante (Enzo Life Sciences). Brevemente, núcleos aislados no tratadas se resuspendieron en 100 l de solución de FluoForte colorante de carga (Enzo Life Sciences) durante 45 min a 37 ° C y 15 min a TA, luego se centrifugó a 600 RCF /5 min /RT. Soluciones de AMD3100 (100 ng /l) y la toxina pertussis (PTX) (200 ng /ml) se prepararon en el calcio libre, fenol libre RPMI. muestras de núcleos se resuspendieron en 100 l de AMD3100 y PTX, se dividió en alícuotas en placas de color negro con paredes, de fondo transparente de 96 pocillos, y se incubaron durante 1 hr. A continuación, el SDF1α se añadió a las muestras en placas, (dilución final de 100 ng /l) y se incubó durante 30 min a TA. la movilización del calcio intranucleares se determinó por la intensidad (aumento) de fluorescente (FluoForte) -bound Ca
2 + en los medios de comunicación. Los resultados se midieron en un lector de microplacas a excitación 490 nm y emisión 525 nm. Cada muestra se preparó por triplicado por experimento, y lleva a cabo al menos tres veces.
Análisis estadístico
En su caso, los datos se analizaron mediante la prueba t de Student pareado una o ANOVA utilizando GraphPad Prism (GraphPad ) software. Los valores de p inferior a 0,05 se consideraron significativos.
Resultados
CXCR4 se expresa en el Núcleo de tejidos de próstata
análisis en el dominio anterior de CXCR4 sugiere que el CXCR4 contiene una señal de direccionamiento nuclear entre los aminoácidos 90 a 170 [73]. Un análisis bioinformático utilizando el PSORT II NLS software de predicción (http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/) reveló una secuencia de localización nuclear putativa, 'RPRK' [72], [74], [75], [76] entre los aminoácidos 146-149 dentro de CXCR4 (Tabla 1). Además, un HomoloGene /búsqueda de base de datos del NCBI para la NLS dentro de CXCR4 reveló que 'RPRK' se ha conservado entre las especies, incluyendo pollo, ratón, chimpancé y otros (Tabla 2). Además, CXCR4 se ha detectado en el núcleo de varios tejidos de cáncer [68], [70]. Basándose en estos datos, hemos probado si la proteína CXCR4 podría ser detectado en el núcleo de los tejidos de la próstata. El uso de un microarray de tejido de próstata que van de normal a las lesiones metastásicas de alto grado, se detectó inmunorreactividad positiva para CXCR4 en muestras de próstata. inmunorreactividad positiva se detectó como esporádicos (células CXCR4 positivos & lt; 5%), focales (CXCR4 células positivas & gt; 11%, pero menos de 50%), o difuso (células CXCR4 positivas & gt; 50%), en comparación con el total medio densidad de células positivas para CXCR4 (DAB manchado). Las muestras con puntuaciones inmunohistoquímicas de tinción negativa, débil o moderada, con esporádicas a las distribuciones focales, se consideró que la expresión "bajo", mientras que no se consideran distribuciones difusas de tinción para tener la expresión "alto" para CXCR4. Intensidad de la tinción fue esporádica de focal en el núcleo de tejidos de la próstata de bajo grado (Fig. 1A), mientras que los tejidos malignos de alto grado (Fig. 1A), muestran un aumento de la intensidad de la tinción y la expresión difusa de CXCR4 en todo el tejido en comparación con bajo grado. En ambos tumores de grado bajo y alto, una fracción de CXCR4 claramente co-localizada con el núcleo. Intensidad de la tinción de CXCR4 era débil, o incluso nulo, en tejidos normales (fig. 1A).
Un
, una matriz de tejido de la próstata humana, que van de normal a cáncer de próstata de alto grado, se evaluó por IHC para la expresión CXCR4 utilizando métodos estándar. Las muestras se evaluaron con un aumento de 40X, usando una cámara Q-obtención de imágenes de Olympus BX51 Microscopio con BIOQUANT® Image Analysis Software (RtmBometrics). tejidos normales de la próstata demostraron tinción ligeramente débil o indetectable marrón para CXCR4 (células positivas & lt; 5%), y no la expresión de CXCR4 en el núcleo. tejido representativo de bajo grado de próstata (2 grado, estadio II, T
2 N
0M
0, adenocarcinoma) demostró tinción aleatoria /focal positiva para CXCR4 en el núcleo (células positivas & gt; 11%, pero menos de 50%), lo que indica una baja expresión de CXCR4. tejido representativo de alto grado metastásico de próstata (grado 4, en estadio IV, T
4 N
1 M
1, adenocarcinoma) demostró difusa /tinción intensa (células positivas & gt; 50%), lo que indica una alta expresión de CXCR4 en el núcleo. La barra de escala representa 50 micras.
B Opiniones, se evaluó anticuerpo monoclonal de ratón CXCR4 IgG2B de especificidad a la proteína CXCR4 por Western blot en PC3 (CXCR4 positiva) o 293T (nulo CXCR4) líneas celulares.
C
, se evaluó anticuerpo CXCR4 para la especificidad a la proteína de CXCR4 por inmunoprecipitación para CXCR4 y análisis de transferencia Western para CXCR4.
D
, se evaluó anticuerpo CXCR4 IgG2B de la especificidad a la proteína de CXCR4 por inmunoprecipitación con anticuerpo monoclonal de ratón fibronectina IgG2B (control de isotipo no relacionado) y análisis de transferencia Western para CXCR4; expresión de la proteína fibronectina se confirmó por análisis de transferencia de Western. Beta-actina se utilizó como control de carga.
Nos han informado de que las células PC3 fueron positivas y células 293T eran nulas, respectivamente, para la proteína CXCR4 [21]. Para asegurar la especificidad de CXCR4 anticuerpo monoclonal (MAB172IgG2b) utilizado para detectar su correspondiente proteína en el núcleo de tejidos de la próstata, se volvieron a analizar PC3 y 293T de CXCR4 con anticuerpo CXCR4 (MAB172IgG2b) por análisis de transferencia Western (Fig. 1B). Al igual que en nuestros estudios anteriores, CXCR4 se detectó en PC3 pero no en 293T lisados de células enteras (Fig. 1B). El análisis posterior de los lisados celulares por inmunoprecipitación con MAB172 IgG2b seguidos por análisis de transferencia de Western con MAB172 IgG2b detecta CXCR4 sólo en PC3 lisados (Fig. 1C). Para confirmar aún más la especificidad de MAB172IgG2b al CXCR4, lisados de células PC3 se sometieron a inmunoprecipitación con fibronectina IgG2b, un control de isotipo, seguido por análisis de transferencia Western con MAB172 IgG2b (Fig. 1D). Fibronectina no fue detectada por IP con CXCR4, pero no se detectó por Western blot con un anticuerpo de fibronectina (Fig. 1D).
CXCR4 está presente en las fracciones nucleares de células del cáncer de próstata
Se utilizó bioquímica fraccionamiento para confirmar la localización nuclear de CXCR4 detectado en nuestra tinción de tejidos. de tres experimentos independientes. *, P & lt; 0,05. Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Sun
et al
. Wang
et al
. Lee
et al
. También se agradece a los Dres.