Extracto
Virus del Papiloma Humano (VPH) es el agente etiológico de cáncer de cuello uterino. Sin embargo, la infección por HPV no es suficiente para causar cáncer cervical, porque la mayoría de las mujeres infectadas desarrollan displasias epiteliales transitorias que regresión espontánea. La progresión a cáncer invasivo se ha atribuido a diversos factores del huésped tales como el estado inmunológico o hormonal, como no hay alteraciones genéticas recurrentes se han identificado en los cánceres cervicales. Por lo tanto, la cuestión es presionar y de las bases biológicas de la progresión del cáncer de cuello de útero ha quedado sin resolver, lo que dificulta el desarrollo de nuevas terapias y pruebas pronósticas. Aquí nos muestran que al menos el 20% de los cánceres cervicales albergan mutaciones adquiridas en somáticos en el
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supresor tumoral. Aproximadamente la mitad de los tumores con mutaciones albergado sustituciones de un solo nucleótido o microdeleciones identificables por secuenciación del exón, mientras que el otro medio albergaba monoallelic más grande o deleciones bialélicos detectables por la sonda de amplificación multiplex ligadura (MLPA). mutaciones bialélicos se identificaron en la mayoría de líneas celulares de cáncer de cuello uterino; HeLa, la primera línea celular humana, alberga una deleción homocigótica 25 kb que se produjo
in vivo
.
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inactivación en los tumores primarios se asoció con la progresión acelerada de la enfermedad. La mediana de supervivencia fue sólo 13 meses en los pacientes con
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tumores deficientes, pero & gt; 100 meses para los pacientes con
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tumores de tipo -wild (
P = 0,015
, prueba de log rank; razón de riesgo = 0,25; IC del 95% = 0,083 a la 0.77).
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es, pues, un importante supresor de tumores de cuello uterino, lo que demuestra que las alteraciones genéticas adquiridas en coche progresión de displasias inducidas por el VPH a los cánceres invasivos y letales. Por otra parte,
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estado puede ser explotado clínicamente para predecir la recurrencia de la enfermedad
Visto:. Wingo SN, Gallardo TD, Akbay EA, Liang M-C, Contreras CM, Boren T, et al. (2009) somática
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mutaciones Promover la progresión del cáncer de cuello uterino. PLoS ONE 4 (4): e5137. doi: 10.1371 /journal.pone.0005137
Editor Syed A. Aziz, Health Canada, Canada |
Recibido: 20 Febrero, 2009; Aceptado: March 10, 2009; Publicado: April 2, 2009
Derechos de Autor © 2009 Wingo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado a través de Sidney Kimmel traslacional Science Awards a DHC, KKW, NB y NES, un F31 beca NIH NRSA de CMC, un Premio joven Investigador del Centro de cáncer Simmons Integral Sociedad Americana del cáncer /UT Southwestern de DHC, y el Centro Nacional de Recursos de investigación (K26RR024196) (DHC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer cervical es uno de los cánceres más comunes en todo el mundo, con más de 500.000 nuevos casos y 250.000 muertes cada año. En el mundo en desarrollo, el cáncer de cuello uterino es la principal causa de muerte por cáncer en las mujeres [1]. La infección de células epiteliales cervicales con un agente de virus del papiloma humano transmisible (HPV) -es necesario para el desarrollo de cáncer cervical, como secuencias de ADN de VPH son detectables en & gt; 99% de los tumores cervicales [2], [3]. La infección con "alto riesgo" subtipos de HPV inicia la progresión del tumor, mediante la anulación de control del ciclo celular y la apoptosis a través de puntos de control de las oncoproteínas virales E6 y E7, que inactivan p53 y Rb vías supresores de tumores, respectivamente [2]. Esto conduce a la formación de displasias de cuello uterino invasivo (
In situ
) conocido como Alto grado de lesiones escamosas intraepiteliales o HSIL) [3], [4], [5]. Sin embargo, estas displasias inducidos por HPV son asintomáticos y más retroceden, lo que demuestra que el VPH no es suficiente para resultar en cáncer de cuello uterino [2]. La progresión de la displasia cervical para los cánceres cervicales invasivos y letales se ha atribuido a diversos factores tales como inmunológico, hormonal, y el estado nutricional, o la coinfección con otros agentes de transmisión sexual, pero los datos de apoyo han sido equívocos [2]. mutagénesis de inserción por el VPH es otro mecanismo de promoción tumoral propuesta, pero los estudios recientes no han apoyado esta hipótesis [6]. No hay recurrentes alteraciones comunes, genéticos que cooperan con HPV para promover la progresión del cáncer cervical se han identificado desde Harald Zur Hausen identificó primero HPV como el agente transmisible causal de cáncer cervical hace más de treinta años [7]. Por lo tanto, la pregunta presionando sobre la base biológica de la progresión del cáncer de cuello de útero ha quedado sin resolver.
mutaciones germinales en el resultado
LKB1
gen supresor de tumores (también conocido como
STK11
) en Síndrome de Peutz-Jeghers (PJS), una enfermedad hereditaria que se caracteriza por pólipos gastrointestinales benignas y un elevado (& gt; 15 ×) riesgo de cánceres epiteliales malignos en varios sitios anatómicos [8]. El
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gen ha demostrado recientemente que someterse a mutación somática en & gt; 30% de no pequeñas de cáncer de pulmón de células [9], [10], lo que sugiere que
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pueden desempeñar un tumor amplio papel supresor. Esto, combinado con nuestros hallazgos recientes que
la Lkb1
inactivación en el útero de ratón o epidermis promueve endometrial agresivo y carcinomas de células escamosas [11], [12] nos llevó a explorar el papel de
Hoteles en LKB1 la progresión del cáncer de cuello uterino.
resultados
somáticamente-Adquirida
LKB1
las mutaciones son comunes en el cáncer cervical al otro lado histológicos subtipos
la secuenciación del
LKB1
génica en tumores de cuello uterino primarios identificados adquiridos en somáticos (no la línea germinal mutaciones) en 8/86 muestras (9%) (Tabla 1, Tabla S1, Figura 1A). Además de otros resultados se presentan a continuación, varias observaciones argumentan que estas mutaciones son como un inactivador grupo,
bona fide
causante de cáncer mutaciones. En primer lugar, 4/8 tumores albergaban mutaciones sin sentido, deleciones o inserciones que resulta en la terminación del marco de lectura y prematura. Los cuatro tumores restantes albergaban mutaciones en el dominio quinasa en residuos conservados en las especies de vertebrados, y dos de estos tumores albergaban una mutación conocida PJS (p.Arg304Trp) que abroga la actividad quinasa LKB1 [13], [14], [15]. Por último, sólo 1/9 variantes de codificación eran de origen de la línea germinal, en comparación con 7/7 variantes no codificantes, una diferencia que es estadísticamente significativa (p = 0,0014, prueba exacta de Fisher) en particular desde la línea germinal de codificación única variante
c.2077C & gt; G gratis (p.Phe354Leu) es un conocido no patológica neutra variante presente en individuos normales [16]. La secuenciación también identificó una homocigotos
dominio mutación LKB1
quinasa en la línea celular de cáncer de cuello uterino C4I (Figura 1B, el cuadro S1).
(A) cromatogramas representativos de los tumores primarios. línea celular (B) C4I. paneles inferiores, muestras de ADN de control de cada paciente (para C4I, ADN de leucocitos periféricos humanos). secuencias de tipo salvaje se muestran a continuación. Cromatogramas representan cadena hacia adelante, excepto el caso#41, donde se muestra complemento inverso para ilustrar más claramente la eliminación. Las mutaciones son heterocigotos excepto donde se indique. (C)
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deleciones en tumores cervicales primarias por MLPA. Barras = intensidad de señal relativa por sonda. Dieciséis sondas (negros) corresponden a
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locus en el cromosoma 19. Los identificadores de sonda mostrada a continuación. Sondas 0.9M5 'y' 0.6M5 son ~900 y 600 kb 5 'del locus (telomérica), mientras que 10M3' es ~10000 kb 3 '(centromérica); restante 13 sondas corresponden a
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no codificantes exones de codificación /. Las barras blancas corresponden a las sondas seleccionadas al azar de otros cromosomas.
A pesar de un pequeño (26 pb)
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eliminación que representa una pérdida completa de la función se identificó mediante secuenciación (Tabla S1, Figura 1A), se habría perdido eliminaciones más grandes. A la pantalla de forma sistemática para supresiones, se empleó la amplificación multiplex ligadura dependientes de la sonda (MLPA) para los 10
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exones y tres sondas que flanquean. Mientras que las muestras normales de control de ADN humano (n = 3) mostraron consistentemente intensidad de las señales equivalentes para todas las sondas, MLPA identificó distinta
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deleciones en 10/86 tumores (Tabla S1, Figura 1C). En cinco tumores, deleciones parecían ser homocigotos ya que las señales de las sondas contiguas se redujeron en & gt; 50% (Figura 1C, los casos 60 y 22); señal residual en estos casos probablemente refleja la contaminación del estroma. De los tumores con deleciones heterocigóticos aparentes, también contenía una mutación significativa identificada por secuenciación (Caso 41, que alberga una deleción de 26 pb, el cuadro S1). Estos resultados son consistentes con estudios humanos y de ratón que muestra que a pesar de la pérdida del segundo alelo puede acelerar la progresión del tumor, la mutación de un solo
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alelo es por sí mismo tumorigénico (es decir,
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puede ser haploinsufficient ) [9], [17]. Sin embargo, también es posible que algunas mutaciones no eran detectados, o que la contaminación del estroma llevaron a una subestimación de la homocigosis. En resumen, biológicamente significativa
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mutaciones incluyendo deleciones caracterizan al menos el 20% (17/86) de los cánceres cervicales invasivos. Sólo un caso en nuestro estudio (caso 20, que albergaba un somáticamente adquiridas
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mutación) fue diagnosticado como mínimo adenocarcinoma-desviación (MDA), una rara variante, muy bien diferenciado de adenocarcinoma de cuello uterino asociado con Síndrome de Peutz-Jeghers [18]. Por lo tanto,
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mutaciones en los cánceres de cuello uterino fueron no se limita a este subtipo histológico raro pero estaban presentes en todos los principales subtipos histológicos de cáncer de cuello uterino-adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas y carcinoma adenoescamosa (Figura 2, Tabla S1) [ ,,,0],4]
(A) Histología de los casos representativos con
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mutaciones (SCC = carcinoma de células escamosas; adeno = adenocarcinoma; AdenoSq = carcinoma adenoescamosa; MDA = mínimo adenocarcinoma de desviación).. Barra de escala = 20 micras. (B) Distribución relativa de los tres principales subtipos histológicos entre los
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-mutant (rojo) vs
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tipo -wild (negro) de los casos totales (= 100%) muestra que el histológico espectro es prácticamente idéntico en
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nula frente a tumores de tipo salvaje.
Las supresiones de
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líneas celulares de cáncer de cuello caracterizan a la mayoría
Los tumores primarios son clonalmente diversa y contienen un número variable de células, tales como fibroblastos y linfocitos que pueden oscurecer estos y otros análisis. Para superar esta limitación y adquirir más conocimientos sobre el papel de
LKB1
en el cáncer de cuello uterino, se analizó un panel de siete líneas celulares de cáncer de cuello uterino (HeLa, HT3, SiHa, MS751, CaSki, C33A, y C4I). Sorprendentemente, cinco de estas siete líneas de células albergadas
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supresiones, al igual que el derivado de HeLa HeLaS3 (Figura 3A). Sólo el CaSki (Figura 3A) y C33A (no mostrado) líneas celulares no mostraron
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deleciones. La mayoría (4/7) albergaba deleciones homocigóticas, mientras que la línea de una célula con una deleción heterocigota (C4I) también albergaba una mutación puntual (Figura 1B, Tabla S1) la racionalización de la pérdida de la heterocigosidad para esta mutación en C4I. El análisis Southern confirmó la pérdida de
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secuencias (Figura 3B) y como se esperaba, la proteína LKB1 fue indetectable en las líneas celulares que albergan deleciones homocigóticas (Figura 3C). Este homocigosis frecuente de
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mutaciones en líneas celulares subraya aún más la importancia patogénica de
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pérdida en el cáncer de cuello uterino. Aunque el número de líneas disponibles y por lo tanto analizada fue pequeña, es notable que la mayoría de las líneas celulares de cáncer de cuello uterino albergaba bialleleic definitiva
LKB1
mutaciones. También es posible que el establecimiento de cultivos primarios de tumores cervicales está sesgada hacia los
LKB1
tumores deficientes
(A) MLPA.; véase la Figura 1 para los detalles de la sonda. HeLa, MS751, SiHa, y HT3 (y HeLa subclón HeLaS3) contienen deleciones homocigóticas distintivos. C4I alberga una deleción monoallelic, como se evidencia por las sondas contiguas con las señales de media intensidad. (B) Análisis Southern de ADN de control, por encima de las líneas celulares, C33 (sin eliminación por MLPA) y HPV16 /E6E7-inmortalizado células endocervicales de un paciente normal (Endo = End1 /E6E7; ATCC#CRL-2615). (C) Análisis de Western. proteína LKB1 es indetectable en las líneas que albergan deleciones homocigóticas y disminuyó un ~ 50% en C4I, en consonancia con la pérdida monoallelic.
La ausencia de la proteína LKB1 en HeLa y HeLaS3 se ha señalado anteriormente [19]. La
LKB1
gen está asociado con una isla CpG prominente, y la falta de proteína LKB1 y mRNA en células HeLa se había atribuido previamente a la hipermetilación del promotor [20]. Sin embargo, no se encontraron pruebas de
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hipermetilación mediante PCR específica de metilación en cualquier línea celular o muestras de tumores primarios. Por el contrario, nuestros datos muestran que HeLa y otras líneas celulares de cáncer cervical no expresan
LKB1
debido a deleciones homocigóticas, en lugar de como resultado de silenciamiento epigenético. De acuerdo con estudios previos realizados en HeLa [19] y otras líneas celulares [9], la expresión forzada de tipo salvaje LKB1 condujo a la detención del ciclo celular y la inhibición del crecimiento, lo que demuestra que
LKB1
pérdida en estas líneas celulares es funcionalmente significativa (datos no mostrados).
para definir supresión de interrupción, las reacciones de PCR que producen amplicones pequeños (100-200 pb) fueron diseñados para abarcar el locus (Figura 4A, B). Anotando (+/-) de amplificación de cada producto seguido de reacciones de PCR adicionales para los intervalos progresivamente más estrechos en base a los resultados de la exploración inicial nos permitió asignar los puntos de ruptura dentro de unos kb (Figura 4C). Cada una de las cuatro líneas celulares albergaban una deleción distinta (~20-110 kb) eliminar porciones de
LKB1
y otros a lo sumo un locus de acompañamiento (
SBNO página 2).
(A)
LKB1
locus (19p13.3 cromosoma). (B) 140 kb región (Ensembl50; 1050000 a 1190000) que abarca
LKB1
e inmediatamente flanquean los loci; intervalos = 10 kb. (C) La eliminación de puntos de interrupción de las líneas celulares que albergan deleciones homocigóticas. En MS751, secuencias suprimidas son discontinuas, como se muestra, de acuerdo con un reordenamiento más complejo. Flechas = cebadores de PCR para HeLa PCR específico (400 pb). (D) HeLa PCR específica (400 bp) confirma la presencia de la deleción en HeLaS3. (E) HeLa intragenic
Se produjo LKB1
eliminación
in vivo
. bloques de archivos se quitó el corazón para la preparación de ADN. Los carriles son los siguientes: (-) control = control sin molde; = tumor suprarrenal depósito metastásico; no tumoral = adrenal normal (el mismo bloque de tejido); (+) = Control de ADN línea de células HeLa.
Clonación molecular de la HeLa
LKB1
Supresión Junction y
En Vivo
Origen de la supresión
para clonar través de la unión HeLa, cebadores que flanquean el 5 'y 3' los puntos de interrupción mapeadas por la estrategia de exploración de PCR anterior fueron diseñados para amplificar un producto de punto de interrupción específica. Un fragmento de unión de 2,8 kb se clonó y se secuenció, lo que confirma la presencia de una deleción (24.662 pb, Figura S1, Figura 4C). Ambos puntos de corte se encuentran dentro de las repeticiones Alu (Figura S1), lo que sugiere que entre Alu recombinación homóloga produce la eliminación. Para crear un ensayo de PCR eficiente para esta supresión, cebadores que flanquean inmediatamente las secuencias Alu repetitivas en cada punto de interrupción fueron diseñados (400 pb) (Figura S1).
HeLaS3, un derivado clonal de células HeLa reportado por primera vez en 1955 [21 ], albergado la idéntica
LKB1
eliminación (Figura 4D), estableciendo 1955 como
terminus ante quem
para el origen de la eliminación. Sin embargo, se mantuvo formalmente posible que el
surgió
in vitro
tras el establecimiento de HeLa de un adenocarcinoma cervical primaria en 1951 [22] LKB1
eliminación. Para resolver esta cuestión, el tumor de ADN de HeLa fue aislado a partir de un bloque de tejido incluido en parafina archivado preparado en el curso de la autopsia del paciente en el Hospital Johns Hopkins en 1951. Un producto de PCR de 400 pb HeLa-específica se amplificó a partir del tumor (Figura 4E ), que establece que el
ocurrieron LKB1
eliminación
in vivo
.
la aparición de la
LKB1
HeLa supresión, mientras que el paciente estaba vivo sugirieron que
LKB1
inactivación podría haber contribuido al crecimiento notoriamente agresivo de su tumor tanto
in vivo
y
in vitro gratis (véase más adelante y discusión). Para explorar la posibilidad de que
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mutaciones influyen en curso de la enfermedad, las curvas de supervivencia libre de progresión se generaron para pacientes cuyos tumores albergaba
LKB1
mutaciones identificadas por secuenciación o MLPA (homocigotos o heterocigotos) y los pacientes cuyo Los tumores eran de tipo salvaje para
LKB1
. Sorprendentemente, la supervivencia media fue de sólo 13 meses para los pacientes con
LKB1
tumores deficientes, pero & gt; 100 meses para los pacientes con
LKB1
tumores de tipo -wild (Figura 5) (P = 0,015 , log-rank test; razón de riesgo = 0,25; IC del 95% = 0,083 a la 0.77).
LKB1
tumores deficientes no eran más avanzada en el momento de la puesta en escena, por ejemplo, el 28% de
LKB1
tumores de tipo fueron inicialmente -wild Etapa I (confinada al útero), frente a 43 % para
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tumores deficientes, ni de calidad más alta (es decir, más pobremente diferenciado). Por lo tanto,
LKB1
mutaciones en tumores cervicales confieren un mayor riesgo estadio por estadio de recidiva, lo que sugiere que los ensayos de
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estado serán de utilidad clínica en la identificación de pacientes con mayor riesgo de enfermedad progresión.
curvas
de Kaplan-Meier muestran el porcentaje de pacientes con progresión de la enfermedad con el tiempo. Las curvas se comparan los pacientes cuyos tumores eran homocigotos o heterocigotos para las mutaciones /deleciones (
LKB1
) frente a los pacientes sin mutaciones /deleciones (WT). Los pacientes con & gt; 1 visita de seguimiento se incluyeron en el análisis. valor de p por prueba de log-rank.
Discusión
Nuestro estudio es el primero en demostrar que las mutaciones genéticas recurrentes ocurren en el cáncer de cuello uterino. En un estudio anterior que examinó esta cuestión no identificó
LKB1
mutaciones en los cánceres de cuello uterino esporádicos, pero sólo se analizaron los adenocarcinomas de desviación mínimos, ya que el objetivo del estudio era determinar
frecuencias de mutación en LKB1
tumores malignos ginecológicos conocidos por estar asociados con PJS. Sin embargo, este estudio anterior, realizado antes de la llegada de la MLPA, identificado LOH del
LKB1
región 19p13.3 en 3/8 de los casos, lo que sugiere que
LKB1
deleciones pueden haber estado presentes [ ,,,0],23]. Otro estudio en el que 26 tumores de cuello uterino se analizaron mediante análisis de polimorfismo conformacional de cadena simple identificado
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mutaciones en un solo caso [24]. Sin embargo, este estudio también subestimó enormemente la frecuencia de
LKB1
mutaciones en el cáncer de pulmón, ahora se sabe que ocurren en & gt; 20% de los casos. El advenimiento de la MLPA ahora facilita la identificación definitiva de
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supresiones, que representan el ~ 50% de las mutaciones en el pulmón y el cáncer de cuello de útero (este y otros estudios) [9]. Otro factor potencialmente oscureciendo secuencia de análisis previo es el inusualmente alto contenido de GC
LKB1
exonic regiones. En nuestra experiencia, el software automatizado de llamadas de base daba a un alto porcentaje de mutaciones, lo que exige la inspección directa de los cromatogramas.
El descubrimiento de un homocigotos
LKB1
eliminación en HeLa es notable debido a la importancia histórica de esta línea celular para la investigación biomédica. HeLa se derivó en 1951 de un adenocarcinoma cervical. Como se aisló la primera línea celular humana inmortalizada y se perpetúa éxito
in vitro
, HeLa se aceleró en gran medida el progreso de la investigación biomédica en la segunda mitad de la 20
siglo XX [25]. Las células HeLa fueron inusuales en el crecimiento tan rápidamente en la cultura, pero el tumor primario también fue agresivo. El tumor primario fue confinado al cuello del útero en el momento del diagnóstico, pero metástasis temprana y ampliamente pesar de la terapia agresiva que incluye el tratamiento de radiación, lo que lleva a la muerte del paciente tan sólo seis meses después del diagnóstico inicial [26], [27], [28] . Nuestros resultados sugieren que la eliminación homocigótica hemos documentado dentro de
LKB1
contribuyó a este crecimiento fenotipo agresivo, la racionalización de algunas de las características inusuales del tumor primario y la línea celular HeLa. En consonancia con esta idea, la expresión forzada de
LKB1
ADNc en HeLa y otras líneas de células HeLa con deficiencia induce la detención del crecimiento (datos no publicados, véase también [9], [19]).
Este también es el primer informe que
LKB1
mutaciones confieren un peor pronóstico para el cáncer humano en particular. Sin embargo, esta observación está en línea con modelos de ratones genéticamente modificados de
LKB1
deficiencia que han encontrado consistentemente que la pérdida de la Lkb1 promueve el crecimiento invasivo /metastático. En
K-ras
ha impulsado modelos de ratón de cáncer de pulmón,
la Lkb1
inactivación proporcionan la cooperación más fuerte en términos de latencia tumoral y la frecuencia de metástasis (en comparación con los supresores tumorales clásicos tales como
Opiniones y p53
Ink4a /Arf
). También es notable que
la Lkb1
pérdida en el pulmón se asoció con un amplio espectro histológico (carcinomas de células escamosas a adenocarcinomas), recordando que
LKB1
inactivación caracteriza carcinomas cervicales de diversos subtipos histológicos [9 ]. Del mismo modo, los ratones con inactivación selectiva de los
Hoteles en la Lkb1 epitelio endometrial se desarrollan altamente invasivos (sin embargo, paradójicamente extremadamente bien diferenciadas) adenocarcinomas de endometrio [11]. Tomados en conjunto, estos y otros resultados [12], [29] argumentan que LKB1 suprime la invasión y metástasis y sugieren que los ensayos basados en LKB1 pueden resultar útiles para el pronóstico en una variedad de tipos de cáncer. Será de interés para determinar si
LKB1
mutaciones también son útiles para el pronóstico en otros tipos de cáncer [9].
El hecho de que el 99% de los cánceres cervicales contienen ADN del VPH [2] como es el caso de la mayoría de las líneas celulares de cáncer de cuello uterino en el que hemos demostrado homocigotos
LKB1
supresiones (por ejemplo, HeLa alberga el VPH-18 integrada secuencias) [30] sugieren que
LKB1
y HPV cooperar de alguna manera . la infección por VPH promueve la formación de
las lesiones in situ
, que nos lleva a proponer que las mutaciones en los genes adicionales incluyendo
¿Cuáles son LKB1 requiere para convertir
In situ
displasias de los carcinomas invasivos, una idea consistente con los diversos modelos animales descritos anteriormente. Se requieren estudios adicionales, es decir con modelos animales genéticamente modificados para comprender la base biológica de la interacción entre el VPH y LKB1. La base biológica y bioquímica de la carcinogénesis mediada por LKB1 aún no se ha aclarado completamente. Regulación deficiente de la vía de AMPK-mTOR probablemente contribuye a la función de LKB1 como un supresor de tumor, pero probablemente no tiene en cuenta del todo por su papel en la mediación de la invasión [31]. No obstante, una regulación deficiente de mTOR en tumores LKB1 deficiente puede presentar oportunidades para la terapia dirigida (por ejemplo, mediante el uso de metformina o análogos de rapamicina) en mujeres cuyos tumores de cuello uterino han confirmado
LKB1
mutaciones /deleciones, una idea que merece mayor investigación en el futuro
.
la base biológica de la progresión de las lesiones precancerosas inducidas por el VPH ha sido sin definir. Este estudio presenta la primera evidencia definitiva de que se repiten las mutaciones en los genes del hospedador discretas se producen en el cáncer cervical invasivo. Aunque otros factores probable influencia progresión, este estudio demuestra que un proceso probable que sea estocástico-a saber, la adquisición de discreta genéticos mutaciones unidades de progresión de la displasia cervical a carcinomas letales invasivos y que estas mutaciones tienen el potencial de servir pronosticadores como útiles.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio se realizó de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. El estudio fue aprobado por el Consejo de los hospitales UT Southwestern y Johns Hopkins de Revisión Institucional.
muestras de pacientes y líneas celulares
Los pacientes fueron un subgrupo de pacientes diagnosticadas con cáncer cervical primaria de UT Southwestern Los hospitales universitarios entre 2000-2007, y que siempre el consentimiento informado. diagnósticos histopatológicos fueron hechas por criterios estándar [4]. cantidades suficientes de tejido del tumor primario tenían que estar disponibles para permitir el aislamiento de ADN para la secuenciación y MLPA; de lo contrario no hubo criterios de exclusión. Para la mayoría de los pacientes, el control de ADN se preparó a partir de sangre; para un pequeño número de pacientes en los que la sangre no estaba disponible, el ADN se preparó a partir de tejidos de control incluidos en parafina. El estadio tumoral se determinó según los criterios de la FIGO. Los datos para el análisis de progresión de la enfermedad según los criterios RECIST se obtuvieron de las visitas de seguimiento. Se recomienda que los pacientes tienen las visitas de seguimiento cada 3 meses durante 2 años, y luego cada 6 meses durante 3 años, y posteriormente cada año. Para la supervivencia libre de progresión, el tiempo de finalización de la terapia primaria hasta la recurrencia o la muerte fue registrada. Los datos de los pacientes sin recurrencia del tumor fueron censurados en el momento de la última visita de seguimiento. Para el estudio tumoral HeLa, un bloque de parafina se obtuvo de los archivos de la Johns Hopkins Hospital. Las líneas celulares fueron comprados de la ATCC.
secuenciación de ADN
El ADN se preparó utilizando Qiagen columnas de ADN genómico. A dos pasos "nido realce /" estrategia de PCR se empleó en la reacción impulso generado un fragmento más grande se utiliza como molde para la reacción nido. Los productos de nidos se secuenciaron bidireccionalmente en 3730 ABI secuenciadores XL con ABI Big Dye Terminator química 3.1. Base de llamada se realizó con el sistema de agente (Paracel). trazados de secuencia se inspeccionaron visualmente para confirmar la detección de la variante exacta por el software de base de llamada. secuencias de los cebadores de PCR /están disponibles bajo petición condiciones. variantes de codificación se confirmaron en repetidas reacciones de PCR para excluir artefactos de PCR. De Genbank NM_000455 fue utilizado como el cDNA de referencia para las posiciones de nucleótidos.
Multiplex Ligadura dependiente sonda de amplificación (MLPA) y Sur /Análisis Western
MLPA se realizó tal como se describe [9]. Para el análisis de Southern, 10 g de ADN genómico fue
XbaI
-digested antes de la electroforesis en gel, se transfirió a una membrana, y se hibridaron con sondas radiomarcados (1-2 kb) generados por PCR y confirmados por fines de secuenciación. La membrana se hibridó con la sonda A, se sometió a autorradiografía, despojado en ebullición 0,1% SDS, y rehibridó a la sonda B. Para el análisis Western, extractos de proteína se prepararon a partir de células adherentes mediante homogeneización en tampón de lisis + inhibidores de proteasa en hielo, se sometió a SDS -PAGE y immunoblotted con un anticuerpo LKB1 (# 3047, señalización Cell Technology) según las recomendaciones del fabricante.
Tejido tinción inmunohistoquímica y
parafina bloque de 5 micras secciones se deparaffinized /hidratado en una serie de etanol . Las preparaciones fueron teñidas con H & amp; E y mucicarmín por protocolos estándar. Por inmunohistoquímica, los portaobjetos se someten a recuperación del antígeno en ebullición en citrato sódico 10 mM; anticuerpo p63 (# MS1081, LabVision) se utilizó a 1:400 con el sistema de detección Immpress (Vector).
PCR escaneo para definir deleciones y HeLa-PCR específicos
cebadores de PCR (produciendo 100 -200 pb) amplicones que abarca el LKB1
región fueron diseñados utilizando Primer3. Los pares de cebadores que producen productos de tamaño correcto cuando se utilizó ADN humano normal como molde se usaron para mapear supresiones al anotar presencia /ausencia de amplificación con línea celular de ADN como molde. Reacciones adicionales para dar los productos correspondientes progresivamente a intervalos más pequeños fueron diseñados según sea necesario. Primer secuencias y condiciones de PCR están disponibles bajo petición. ADN bloque de tejido Archivo se preparó como se describe [32]. primer secuencias de HeLa-PCR específica (400 pb) fueron para (5'-GGTTGCGATCAAGGCCCCGA-3 ') y Rev (5'-GCCTGTGGATGCCACACATG-3'). Las condiciones de PCR fueron 95 ° C x 10 "; 94C × 30 ", 58C × 30", 72C × 30 "(38 ciclos); 72C × 7 '.
Análisis estadístico
Para la comparación de la frecuencia de mutantes, Fisher (dos colas) se utilizó la prueba exacta no apareado. Las curvas de supervivencia se generaron en GraphPad Prism5, con la comparación de las curvas realizadas con la prueba de log-rank (Mantel-Cox). La razón de riesgo y su intervalo de confianza se calcularon utilizando el método de Mantel-Haenszel. Los valores de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Apoyo a la Información
Figura S1.
La clonación y caracterización de
LKB1
intragenic supresión de interrupción en HeLa /HeLaS3. Un fragmento de 2,8 kb que abarca la supresión de corte se clonó a partir de ADN de HeLa mediante PCR como se describe en el texto; se muestran 974 pb de esta secuencia. Secuencia en letras rojas en negrita corresponde a la repetición Alu en el que se produjo el evento de recombinación homóloga de presunción que resulta en la eliminación de HeLa. polimorfismos de nucleótidos en las dos secuencias Alu nativas (no se muestra) fueron consistentes con un evento de recombinación que ocurren dentro de la secuencia de caja 5 pb (es decir, las que flanquean bases G fueron polimórficos e informativo). Secuencia en azul corresponde a una secuencia única en el genoma humano (Ensembl 50 19: 1145482 a 1.145.865). Esta secuencia es ~ 11 kb del extremo 5 'de la
LKB1
gen (inicio de la transcripción). Secuencia en verde (Ensembl 50 19: 1170845-1.171.115) se encuentra dentro de
LKB1
intrón 3-4. Las flechas muestran la ubicación de los cebadores diseñados para-HeLa específico PCR (400 pb de amplificación). La ubicación genómica de estos cebadores en el mapa genómico se muestra en la Figura 4C
doi:. 10.1371 /journal.pone.0005137.s001
(0.01 MB PDF)
Tabla S1.
lista completa de las mutaciones LKB1 detectada por secuenciación o MLPA
doi:. 10.1371 /journal.pone.0005137.s002 gratis (0.01 MB PDF)
Reconocimientos
en deuda con Grover Hutchins (Johns Hopkins University School of Medicine) y Juanita Valenciana (UT Southwestern) para obtener ayuda con la adquisición de muestras y asesoramiento técnico. Agradecemos también a Jennifer Sayne y el UT Southwestern Tejido recursos para la gestión del Centro de Cáncer Integral Simmons para obtener ayuda con la adquisición de muestras y gestión de la información clínica.