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PLOS ONE: Lucha contra el Cáncer potencial de inhibición vía MAPK en paragangliomas-Efecto de diferentes estatinas en células de ratón Feocromocitoma

2016/6/11


Extracto

Hasta la fecha, los feocromocitomas y paragangliomas malignos (PHEO /paragangliomas) no se puede curar con eficacia y por lo tanto se necesitan con urgencia nuevas estrategias de tratamiento. La lovastatina se ha demostrado que induce eficazmente la apoptosis en células de feocromocitoma de ratón (MPC) y las células derivadas de tejido tumorales de ratón más agresivos (MTT), que fue acompañado por disminución de la fosforilación de jugadores quinasa activada por mitógenos (MAPK). La vía MAPK desempeña un papel en numerosos tumores agresivos y se ha asociado con un subgrupo de los PHEO /paragangliomas, incluyendo
K-RAS
,
RET-
, y
NF1
-mutated tumores. Nuestro objetivo fue determinar si la señalización de MAPK también puede desempeñar un papel en el agresivo, la succinato deshidrogenasa (SDH) B mutación derivada PHEO /paragangliomas. De perfiles de expresión y análisis de transferencia Western indicó que los aspectos específicos de MAPK-señalización son activos en los PHEO /paragangliomas SDHB, lo que sugiere que la inhibición por tratamiento con estatinas podría ser beneficiosa. Por otra parte, se intentó evaluar si el efecto antiproliferativo de lovastatina en MPC y MTT se diferenciaba de la ejercida por la fluvastatina, simvastatina, atorvastatina, pravastatina, rosuvastatina o. Simvastatina y fluvastatina disminución de la proliferación celular más eficaz y las células MTT más agresivos aparecieron más sensibles a este respecto. La inhibición de la fosforilación MAPK1 y 3 después del tratamiento con fluvastatina, simvastatina, lovastatina y se confirmó por Western blot. Los niveles elevados de CASP-3 y PARP escisión confirmaron la inducción de la apoptosis después del tratamiento. A una concentración suficientemente baja para no afectar a la proliferación celular, la migración espontánea de MPC y MTT se inhibió significativamente dentro de las 24 horas de tratamiento. En conclusión, las estatinas lipofílicas pueden presentar una opción terapéutica prometedora para el tratamiento de los paragangliomas humanos agresivos mediante la inducción de la apoptosis y la inhibición de la diseminación tumoral

Visto:. Fliedner SMJ, Engel T, NK Lendvai, Shankavaram T, Nölting S, R Wesley , et al. (2014) Potencial de Lucha contra el Cáncer de MAPK La inhibición de paragangliomas-Efecto de diferentes estatinas en células de ratón feocromocitoma. PLoS ONE 9 (5): e97712. doi: 10.1371 /journal.pone.0097712

Editor: Benjamin Edward Rich, Dana-Farber Cancer Institute, Estados Unidos de América

Recibido: 10 Enero, 2014; Aceptado: 22 de abril de 2014; Publicado: 20 May, 2014

Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0

Financiación:. La financiación fue proporcionada por los Programas de Investigación Intramural del Instituto Nacional Eunice Kennedy Shriver de Salud Infantil y Desarrollo Humano y el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano , Institutos nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE.UU. y el Departamento 1º de Medicina de la Universidad del Centro Médico de Schleswig-Holstein, Lübeck, Alemania. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Recientemente, lovastatina se ha sugerido como opción terapéutica potencial prometedor para el tratamiento de RET, NF1, y TMEM127 tumores de mutación derivada de la producción de catecolaminas adrenales y extra-adrenales cromafines celulares (feocromocitomas (PHEO) y paragangliomas (paragangliomas), respectivamente ) [1]. Sin embargo, el riesgo para la enfermedad metastásica en estos tumores es relativamente baja y la resección del tumor es por lo tanto casi siempre curativa. Por el contrario, el riesgo de malignos PHEO /paragangliomas es especialmente elevada en el caso de la succinato deshidrogenasa B (SDHB) mutaciones de genes [2], [3], y se necesitan con urgencia nuevas estrategias de tratamiento para esta condición
.
Un reciente New England Journal of Medicine artículo reportado disminución de la mortalidad relacionada con el cáncer en pacientes que recibió tratamiento con estatinas anteriores al diagnóstico [4]. De acuerdo con esto, numerosos
in vitro
y
in vivo
estudios demostraron efectos anticancerígenos de lovastatina y otras estatinas solas o como parte de un régimen de tratamiento combinado para los tumores agresivos (revisado en [ ,,,0],5] - [7]). A concentraciones más altas que se requieren para la reducción de los niveles de colesterol, las estatinas se han demostrado inhibir la vía del mevalonato suficiente severamente para inhibir la síntesis de isoprenoides, que actúan como anclajes de membrana necesarias para la función apropiada de ciertas proteínas [8]. Los efectos contra el cáncer de las estatinas se han asociado principalmente con la inhibición de Ras-prenilación (es decir farnesilación o geranilgeranilación), que entre otros efectos, interrumpe la activación de los jugadores de aguas abajo en la vía MAPK [9], [10]. El exceso de activación de la vía del mevalonato, incluyendo MAPK señalización se ha demostrado que es suficiente para la transformación de células [11]. señalización excesiva MAPK apoya la inhibición de la apoptosis, la proliferación y la migración y es una característica clave de muchos tipos de cáncer (resumido en [12], [13]). En el caso de los PHEO /paragangliomas, la actividad vía MAPK elevada se puede comprobar en
H-RAS
,
K-RAS
,
TMEM127
,
RET
,
NF1
, y posiblemente
MAX
tumores relacionados con mutaciones [14] - [22]

Hasta donde sabemos, actualmente no hay evidencia de una mayor señalización de MAPK en SDHB derivados. paragangliomas se ha presentado. En las células de pacientes con síndrome de Cowden-like y SDHB o variantes de genes D, sin embargo, el aumento de los niveles de MAPK 1 y 3 se han observado la fosforilación [23]. En presencia de una vía MAPK activa, las estatinas pueden proporcionar un tratamiento prometedor o la opción de co-tratamiento de paragangliomas malignos Actualmente fatales.

El alcance de los efectos anti-cáncer se ha demostrado que varían según el modelo y el tipo de estatina utilizada [24] - [30]. Por lo tanto, evaluamos cuál de los siete estatinas actualmente disponibles pueden ser más eficaces para el tratamiento PHEO /PGL.

Materiales y Métodos

La fluvastatina, pravastatina, lovastatina, simvastatina y se obtuvieron todos de Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI); atorvastatina y rosuvastatina se obtuvieron de Enzo Life Sciences, Inc. (Farmingdale, NY).

Cultivo de células

tumorales de ratón tejidos derivados de células (MTT) Recientemente se han desarrollado en nuestro laboratorio [31 ]. Se llevaron a cabo todos los estudios en animales necesarios para el desarrollo y caracterización de células MTT de acuerdo con los principios y procedimientos descritos en el Instituto Nacional de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales, y aprobados por el
Eunice Kennedy Shriver sobre National Instituto de Salud infantil y Desarrollo humano Cuidado de Animales y el empleo Comisión (número de Protocolo ASP#06-028). MTT las células son propiedad de los NIH. células de feocromocitoma de ratón (MPC 4 /30PRR) fueron un generoso regalo del Dr. Tischler, de Tufts, Boston. Las células se mantuvieron en DMEM (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY), suplementado con 10% inactivado por calor suero de caballo (Hyclone Logan, UT), suero bovino fetal 5% (Gibco), HEPES (Gibco) y penicilina ( 10.000 unidades /ml) /estreptomicina (100 000 mg /ml) (Gibco) en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2 a 37 ° C. El medio se cambió cada dos días y se pasaron las células cuando se alcanzó el 80-90% de confluencia. Todas las estatinas se compararon con la concentración apropiada de vehículo (DMSO). Cuando se combinaron las estatinas para evaluar los posibles efectos aditivos, 25 mM de 2 diferentes estatinas se compararon con 50 M de cada uno de los estatinas individuales.

Ensayos de proliferación

Las células se sembraron en colágeno recubierta 96- pocillos (BD Biosciences, San Jose, CA) a 10.000 células por pocillo, y dejó que se unieran durante 24 h. A continuación, los medios de comunicación se intercambió con concentraciones de 6,25, 12,5, 25, y 50 mM de los diferentes estatinas, se disuelve en medios suplementados. Después de 0, 24, 48, y 72 h de tratamiento, la proliferación celular se evaluó con el kit de proliferación celular II (XTT) (Roche Applied Science; Indianapolis, IN) de acuerdo con el manual del producto. Después de cuatro horas de incubación, las placas se midieron a 490 nm con longitud de onda de referencia 650 nm en un lector de microplacas (Victor
3 1,420 contador Multilabel, Perkin Elmer, Waltham, MA). Todos los experimentos se realizaron por cuadruplicado y se repitieron al menos dos veces.

ensayos de migración celular espontánea

Las células se sembraron a 60.000 células por pocillo para la evaluación de la migración espontánea en un dispositivo xCELLigence DP (Roche Diagnostics, Mannheim , Alemania) como se informó anteriormente [32]. La migración espontánea se registró durante 24 horas en presencia de 5 mM fluvastatina, lovastatina, y simvastatina sola, o en combinación con 100 mM trans, trans farnesol (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EE.UU.).

vía MAPK gen de enriquecimiento en paragangliomas SDHB

Expresión de datos se extrae de los datos de microarrays previamente presentados en 45 muestras de pseudohypoxic PHEO /paragangliomas, incluyendo 18 SDHB, 8 SDHD cabeza y cuello (HN), 6 SDHD abdominal y torácica (AT), y 13 muestras de la BVS en comparación con médula suprarrenal normales [33]. Como se informó, análisis de predicción de microarrays identificado 6937 genes como característica para uno de los diferentes subgrupos de pseudohypoxic PHEO /paragangliomas. Estos fueron mapeados con una lista de 254 genes de la vía MAPK (Kyoto Enciclopedia de genes y el genoma vía). Predomina sobre-expresión en muestras de SDHB en comparación con la médula normal se confirmó mediante ANOVA y los intervalos se basa en la estadística del rango de Student, el método de "Honest diferencia significativa" de Tukey.

Declaración de Ética

Colección de tejidos era aprobado por la junta de revisión institucional de la
Eunice Kennedy Shriver
Instituto Nacional de Salud infantil y Desarrollo humano. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente.

tejido tumoral humano

tejido PHEO /PGL se congeló inmediatamente después de la resección. información del paciente y del tumor para cada muestra se presentan en la Tabla 1. Las muestras congeladas se homogeneizaron en hielo en la proteína del tejido reactivo de extracción (Thermo Fisher Scientific Inc., Lafayette, CO, EE.UU.) con 0,1% de inhibidor de fosfatasa (Cell Signaling Technology Inc., Danvers , MA, EE.UU.) y un inhibidor de proteasa completo de la tableta Mini por 10 ml de solución (Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN, EE.UU.). Los homogeneizados se centrifugaron a 10.000 xg durante 5 minutos a 4 ° C. El sobrenadante se utilizó como extracto de proteína.

recolección de células

Las células se sembraron en placas recubiertas de colágeno [34] a 600.000 células /ml y que se pueden conectar por un mínimo de 18 h antes de medio se cambió a las soluciones de estatinas 25 micras o control de DMSO. soluciones de tratamiento se renovaron después de 24 h. Después de 48 h de tratamiento, se recogieron las células con un policía de goma y se lavaron 3 veces en PBS enfriado con hielo por centrifugación a 500 x g. Las células se recogieron a 1500 × g, se disolvió en 0,1% cholamidopropyldimethylammoniopropanesulfate, que contiene un inhibidor de proteasa Mini tableta completa por 7 ml de solución (Roche Applied Science) y 0,5% de cóctel inhibidor de fosfatasa 2 (Sigma-Aldrich Co.). Las muestras se sonicaron durante 2 minutos en hielo y posteriormente se centrifugaron a 10.000 xg durante 10 min, 4 ° C. El sobrenadante se utilizó como extracto de proteína.

Western blot

Para estimar las concentraciones de proteína se utilizó el kit de ensayo de proteínas Quant-iT (Invitrogen, Life Technologies Corporation). cantidades iguales de proteína de los extractos tumorales en tampón de gel página de muestra LDS (Thermo Fisher Scientific) o extractos de células en tampón Lämmli se cargaron en 4-20% Criterio TGX geles prefabricados (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.) o la mano echado 12 % geles, separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida de sodio-dodecilsulfato, y transferidos a membranas de PVDF (Immobilon-P, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, EE.UU.). Las membranas se bloquearon en leche seca no grasa al 5% en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) con 0,01 a 0,05% de Tween 20 (Sigma-Aldrich Co.) durante 1 hora. Los anticuerpos se disolvieron en 5% de albúmina de suero bovino o leche en polvo al 5% no grasa en solución salina tamponada con Tris (pH 7,6) con 0,01 a 0,05% de Tween 20. Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C o durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios fueron de conejo anti-escindido con la caspasa-3, conejo anti-p44 /p42 MAPK, conejo anti-fosfo-p44 /p42 MAPK, conejo anti-PARP, conejo anti-GAPDH (Cell Signaling, Technology Inc.), anti-ratón -β-actina (Sigma-Aldrich). Los anticuerpos secundarios fueron burro unido a HRP anti-conejo (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EE.UU.), de cabra anti-conejo y de cabra anti-ratón (DAKO tanto North America, Inc., Carpinteria, CA). Las membranas se incubaron en Super Señal West Pico Substrato quimioluminiscente (Thermo Fisher Scientific) y se expusieron a película de alto rendimiento de quimioluminiscencia (GE Healthcare) o se incubaron en reactivo ECL de Amersham Prime Western Blotting de detección (GE Healthcare) y se visualizaron en un sistema de ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories). Las membranas fueron despojados con Restore Plus Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher Scientific) antes de volver a bloqueo e incubación con otro anticuerpo secundario.

El análisis estadístico

Se utilizó un enfoque de dos etapas para evaluar la eficacia anti-proliferativa de cada fármaco para disminuir la viabilidad celular. En el primer paso, cada uno de los 6 fármacos se comparó por separado al vehículo para cada nivel de la duración del tratamiento, la dosis y tipo de célula. Los datos utilizados para estos análisis fueron los (replicados) proporciones de los valores así fármaco dividida por la media del conjunto asociado de valores de control de DMSO. Estas relaciones, de 2 a 4 experimentos independientes, se analizaron mediante una de dos vías ANOVA de efectos fijos. Los valores de p resultantes se Bonferroni-corrigen multiplicándolos por 24, el número de configuraciones de duración, dosis y tipo de célula para un fármaco dado. A continuación, se seleccionaron las drogas que disminuyeron significativamente la proliferación general y se evaluaron las duraciones y las dosis más eficaces para cada fármaco para cada tipo de célula: por un ANOVA inicial, seguido por la clasificación sobre la base de post-ANOVA significa, seguido de Student-Newman Keuls (SNK) pruebas post hoc para determinar qué medias difieren significativamente. Las actuaciones generales de los 3 mejores medicamentos que realizan se compararon mediante un ANOVA de una vía 4 (factores: las drogas, la duración, la dosis y el tipo de células); de nuevo se realizaron las pruebas post hoc de SNK para determinar qué medicamentos fueron significativamente diferentes en general
.
El efecto de las estatinas combinadas en comparación a cada individuo con estatinas se evaluó de una manera análoga. Los datos se presentan como la media y el error estándar (basado en el ANOVA y el delta-método) de al menos dos experimentos independientes. Los cálculos estadísticos se realizaron en Stata (Release 12, StataCorp., College Station, Texas, EE.UU.).

Resultados

La evidencia de MAPK señalización en PHEO SDHB /paragangliomas

como se ha demostrado anteriormente, lovastatina ejerce un fuerte efecto antiproliferativo sobre las células MPC y MTT, que se asoció con una disminución de fosfo-MAPK 1 y 3 (pMAPK1 /3) niveles [1]. Para evaluar si el tratamiento con estatinas puede ser de beneficio para los pacientes con paragangliomas metastásicos, se evaluó si pMAPK1 /3 estuvo presente en los paragangliomas agresivas derivadas de SDHB y otros PHEO hereditarios /paragangliomas (fig. 1A). información del paciente y del tumor para cada muestra se presentan en la Tabla 1. Entre los humanos PHEO /paragangliomas los niveles pMAPK1 /3 fueron muy variables. A pesar de que los niveles medios de pMAPK1 /3 eran comparativamente baja en los tumores SDHB en relación con otras muestras analizadas, la fosforilación fue evidente en 4 de cada seis muestras SDHB. No hay diferencia entre paragangliomas SDHB primarios y metástasis SDHB era evidente.

A. Western blot de pMAPK1 /3, el total de MAPK1 /3, y GAPDH en PHEO /paragangliomas humanos. información del paciente y del tumor para cada muestra se presentan en la Tabla 1. Abreviaturas: B) SDHB, D) SDHD, N) NF1, M) médula suprarrenal normales. B. Mapa de calor que muestra la expresión de los genes de la vía MAPK 21 en pseudohypoxic PHEO /paragangliomas. La expresión de estos 21 genes fue significativamente elevado en comparación con SDHB médula normal (p & lt; 0,002). Cada muestra se le asigna un número. El identificador de muestra correspondiente del artículo original [33] se da en la Tabla S1. información del paciente y un enlace a los datos depositados se dan en el artículo original.

Además, se evaluó el perfil de expresión de ARNm de genes de la vía MAPK en pseudohypoxic PHEO /paragangliomas. Mapeo de 254 genes de la vía MAPK a 6937 genes previamente identificados de interés [33] reveló un partido de 85 genes. La agrupación jerárquica de los 85 genes reveló dos grupos de genes, uno de los cuales contenía 21 genes que parecían estar más altamente expresado en SDHB y PHEO /paragangliomas SDHD-AT en comparación con la médula normales suprarrenal y SDHD-HN y BVS PHEO /paragangliomas (fig. 1B). Una mirada más de cerca a estos 21 genes reveló general el aumento de expresión en las muestras de SDHB en comparación con médula suprarrenal normal (p & lt; 0,002) (Fig. 1B) y un ANOVA de los genes individuales con la evaluación post-hoc confirmó significativamente más alta expresión de MAPK12, CACNB3 , CACNG7, MAP4K2, MAP3K9 y MAPK6 en PHEO SDHB /paragangliomas que la médula suprarrenal normal (p≤0.02). Por lo tanto, ciertos aspectos de la señalización de MAPK parecen ser activadas en los más agresivos PHEO /paragangliomas derivados de SDHB, por lo que la orientación de esta vía puede ser un enfoque prometedor nuevo tratamiento.

Comparación de los
in vitro
eficacias de diferentes estatinas

Para determinar la eficacia de las estatinas en diferentes PHEO /paragangliomas, hemos utilizado dos modelos de ratón; líneas de células MTT y MPC. No se espera evidencia de succinato deshidrogenasa disfunción o subunidad mutación en células MPC o MTT, sin embargo actualmente hay mejor in-vitro existe modelo para estudiar el efecto de nuevas opciones terapéuticas para los PHEO /paragangliomas. la viabilidad celular relativa disminuyó con el aumento de la duración del tratamiento y la concentración de los diferentes estatinas para MPC y MTT. Duración de tres días de tratamiento con la mayor concentración de 50 mM era más eficaz para todas las estatinas (Fig. 2) y mostró un efecto significativamente mayor en comparación con la misma dosis y de estatina en el segundo día de tratamiento (p≤0.029 SNK para todos estatinas, excepto pravastatina, que fue ineficaz).

Porcentaje significativa los resultados de todos estatinas para todas las dosis de tratamiento en las diferentes duraciones de tratamiento para MPC (A) y MTT (B). El porcentaje de resultados significativos se incrementó en comparación con MTT MPC después de 48 y 72 h, lo que sugiere que MTT son más sensibles al tratamiento con estatinas.

La aparición de forma significativa disminución de la viabilidad relativa en comparación con vehículo aumentó con la dosis y duraciones de tratamiento y estos efectos fueron más pronunciados para MTT de MPC, lo que indica una mayor susceptibilidad del tipo de célula más agresiva para el tratamiento con estatinas (Fig. 2).

el efecto anti-proliferativo de los seis estatinas difería significativamente (p & lt; 0,0001). La lovastatina, simvastatina, fluvastatina y demostraron más alta inhibición de la proliferación (Fig. 3). La comparación directa de sus eficacias antiproliferativos reveló una mayor potencia de simvastatina y fluvastatina en comparación con lovastatina (p = 0,033; simvastatina vs SNK lovastatina p = 0,043, fluvastatina vs SNK lovastatina p = 0,031).

MPC ( a-F) y MTT (G-K) fueron tratados con ▪ 6,25 M, ▴ 12,50 M, ▾ 25,00 m, y ⧫ 50,00 M de atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, rosuvastatina, y simvastatina para 24, 48, y 72 horas.

Además de establecer qué estatina es más eficaz en la inhibición de la proliferación celular en MPC y MTT, se exploró si la combinación de dos diferentes estatinas podría aumentar la eficacia. Curiosamente, las cuatro combinaciones más eficaces incluyen todos simvastatina: simvastatina /lovastatina, simvastatina /fluvastatina, simvastatina /atorvastatina, simvastatina y /rosuvastatina. Sin embargo, ninguna de estas combinaciones de disminución de la viabilidad relativa con más eficacia que los tres estatinas más eficaces, fluvastatina, simvastatina, lovastatina y solo (Fig. 4).

viabilidad relativa de MPC (A) y MTT (B) a las dosis y duraciones indicadas para los tratamientos combinados más efectivos, así como la simvastatina en relación con la simvastatina sola.

Western blot reveló que las tres estatinas más efectivas todas fosforilación de MAPK inhibe a las 48 h de tratamiento con 25 mM (Fig . 5A). Además, fluvastatina, simvastatina, lovastatina y aumento de los niveles de productos de escisión de CASP-3 y PARP, lo que indica aumento de la apoptosis (Fig. 5B).

A. Western blot que muestra disminución de los niveles de pMAPK1 /3 en tratados frente MPC no tratada y MTT relativa al total de MAPK1 /3 y GAPDH. B. Western blot que muestra disminución de los niveles de PARP intacta (bandas superiores) y el aumento de los niveles de PARP escindida (bandas más bajas) en tratados frente a no tratados MPC y MTT. De acuerdo, escinde CASP-3 fue elevado en las células tratadas, lo que indica la apoptosis. Las células fueron tratadas con 25 M de la estatina indicada durante 48 horas.

proliferación de MTT ni MPC ni se vio afectado por 6,25 M de cualquier estatina prueba después de 24 o 48 h. Sin embargo, la migración celular espontánea de MPC y MTT se vio gravemente inhibida por el tratamiento con 5 mM de fluvastatina, simvastatina, lovastatina y (Fig. 6). capacidad migratoria fue rescatado en parte, mediante la adición de 100 mM trans farnesol, trad.

MPC (A) y MTT (B) se sembraron en el vehículo (CTR), fluvastatina 5 M (Fluva), 5 mM simvastatina (Simva ), 5 M lovastatina (Lova) con o sin 100 mM farnesol trans, trans (FOH) y la migración espontánea se registró 24.

Discusión

Hasta la fecha, ningún tratamiento curativo se ha establecido para metastásicos PHEO /paragangliomas. Sin embargo, varias nuevas estrategias terapéuticas se han probado recientemente en organismos modelo [35] - [38], incluyendo lovastatina [1]. Anteriormente, se ha informado de las estatinas para disminuir la proliferación, supervivencia, progresión del ciclo celular, y la migración en otras células incluyendo modelos de cáncer agresivos, entre otros por la inhibición de la vía MAPK [10], [25] - [27], [29], [30 ], [39] - [41]. Sin embargo, en la actualidad evidencia de que el tratamiento con estatinas será potente en el tipo más agresivo de los PHEO /paragangliomas, es decir, aquellos con mutaciones SDHB [42], se carece.

Nuestros datos indican que MAPK1 /3 fosforilación está presente en algunas SDHB-paragangliomas, incluyendo metástasis. De acuerdo un estudio previo mostró un incremento MAPK1 /3 fosforilación en lymphoblastoids inmortalizadas de pacientes con Cowden-como el síndrome de variantes y de línea germinal SDHB o SDHD genes o mutaciones [23]. Además, varios genes de la vía MAPK parecían estar más altamente expresado en SDHB-paragangliomas que en la médula suprarrenal normales. La función exacta y la posible participación de los genes identificados en SDHB mutación tumorigénesis mediada aún no se han evaluado.

En conclusión, al menos, un subgrupo de pacientes con paragangliomas agresivas que muestran MAPK1 /3 fosforilación pueden beneficiarse del tratamiento con estatinas. Nuestros datos indican que este grupo de pacientes no puede restringirse a agruparse 2 pacientes PGL. Determinación de MAPK1 /3 fosforilación en una base de caso por caso en el paragangliomas metastásicos puede ser útil para la estimación de un beneficio potencial del tratamiento con estatinas.

En un estudio basado en microarrays publicado previamente comparando los PHEO /paragangliomas con diferentes antecedentes genéticos, tumores derivados de SDHX MAPK mostró disminución de la expresión de genes vía en relación con Ret, NF1, TMEM127, y PHEO esporádicos /paragangliomas [21]. La discrepancia entre este resultado y nuestros datos puede ser debido al hecho de que, en relación con Ret, NF1, TMEM127, y ciertos PHEO /paragangliomas esporádicos, la sobre regulación de señalización MAPK genes puede ser marginal en SDHB PHEO /paragangliomas, y por lo tanto no detectable en ausencia de tejido de control normal. Nuestros datos de microarrays revelaron patrones de expresión en SDHB y SDHD paragangliomas-HN opuestas con respecto al MAPK genes de señalización; agrupando así las muestras pueden oscurecer la sobre-expresión de genes relacionados con la MAPK en los PHEO SDHB /paragangliomas en comparación con otros PHEO /paragangliomas. Aquí presentamos varios genes de señalización de MAPK que son en relación con médula suprarrenal normales hasta reguladas. Por lo tanto, se concluye que el tratamiento con estatinas por sí sola o en combinación con otros regímenes terapéuticos pueden ser beneficiosos en ciertas PHEO SDHB derivados /paragangliomas

En la actualidad, siete estatinas son diferentes en el mercado que -. Además de su colesterol características de descenso - han demostrado interferir con varias vías de cáncer pertinentes [43], [44]. Sus acciones y el impacto sobre la expresión génica farmacológicos han demostrado que difieren [43], [45], [46] y por lo tanto, dependiendo de las células a tratar, el fármaco más eficaz tiene que ser determinada. Aquí mostramos que en caso de MPC y MTT, la estatinas lipofílicas fluvastatina, simvastatina, lovastatina y reduce considerablemente la proliferación celular, con simvastatina y fluvastatina que muestra los efectos ligeramente más fuertes. La pravastatina se ha demostrado ser ineficaz en varios modelos de cáncer [47], [48], que puede ser debido a sus características hidrófilas y la falta de transportadores adecuados en las células tumorales. En otros estudios que comparaban los efectos de varias estatinas, simvastatina o fluvastatina parecían ser más eficaz que la lovastatina [24], [30]. Para otros estudios, puede considerarse la posibilidad al hecho de que las características farmacocinéticas de fluvastatina se ha informado de que es preferible a los de la simvastatina y la lovastatina [45].

Curiosamente, las células MTT más agresivos parecía ser más sensibles al tratamiento con estatinas, lo que indica que las células más agresivas pueden ser más receptivos a los efectos antiproliferativos de estatinas. La diferencia en el mecanismo de representación MTT restos más sensibles se han dilucidado.

La concentración estatina máxima registrada en la sangre humana después de la administración oral (12,3 M) [49] estaba en el rango de nuestra tercera concentración más alta (12,5 mM) , que disminuyó significativamente la proliferación celular en MPC y MTT a las 48 ó 72 horas de tratamiento con fluvastatina, lovastatina, y simvastatina. Holstein et al. informaron que hasta 415 mg /m
2 por vía oral cada seis horas durante cuatro días fueron bien tolerados por los pacientes con neoplasias graves [49]. Sin embargo, los niveles de estatinas sangre no aumentó de manera lineal, y por lo tanto la administración oral pueden no ser la mejor opción para alcanzar concentraciones altas de tejido. técnicas de administración óptimas para lograr que las concentraciones buscadas tendrán que ser determinados. efectos insignificantes de las estatinas sobre las células normales en comparación con las células cancerosas se han reportado [24], [50].

A concentraciones no tóxicas, alcanzables mediante la administración oral, se ha informado de las estatinas para exhibir otro efecto anti-cáncer , la inhibición de la migración celular y la invasión [9], [47], [51]. Por esta razón hemos probado la consecuencia de las estatinas eficaces, lovastatina, simvastatina, fluvastatina y sobre la motilidad celular espontánea de MPC y MTT a 5 mM. Nuestros ensayos de proliferación no mostraron una reducción en la proliferación a 6,5 ​​micras dentro de las 24 horas de tratamiento. La lovastatina, fluvastatina, simvastatina y la migración eficazmente inhibida de MPC y MTT dentro de las 24 horas. La migración de inhibición parecía ser al menos parcialmente dependiente de agotamiento de farnesilo, ya que la presencia de farnesol trans capacidad migratoria trans, parcialmente rescatado. Sin embargo, incluso una concentración relativamente alta de 100 M trans, trans farnesol no revirtió completamente el efecto anti-migratoria de las tres estatinas. Por lo tanto, los efectos de farnesilación independiente de las estatinas sobre el MPC y el MTT no pueden ser excluidas. En un estudio anterior, pirofosfato de geranilgeranilo ha demostrado ser más eficaz en la reversión de los efectos de las estatinas que farnesilpirofosfato [24]. Además, también se han descrito las vías no mevalonato efectos estatinas depende de las células del cáncer [43].

Desde la administración oral de las estatinas no producir concentraciones tan altas como se utiliza aquí para lograr los mejores efectos anti-proliferativos en vitro, administración combinada de otras drogas parece ser una estrategia prometedora. El sunitinib inhibidores multicinasa y sorafenib también afectan a la vía MAPK y han demostrado ser eficaces en paragangliomas metastásicos progresivos [52], [53]. El tratamiento con sunitinib mostró efectos clínicos beneficiosos en 8 de cada 17 pacientes con paragangliomas metastásico progresivo. Curiosamente, 6 de los respondedores lleva a SDHB mutaciones. Sin embargo, como la mayoría de los fármacos antineoplásicos, los efectos secundarios de los inhibidores de la multicinasa pueden ser graves y nueve de los 17 pacientes tratados con sunitinib tuvieron que interrumpir el tratamiento o reducir la dosis con el tiempo.

Un efecto sinérgico de fluvastatina y sorafenib ha sido presentado por las células de melanoma in vitro [54]. Esto tiene el potencial de disminuir las concentraciones de inhibidor multicinasa, que sirven para aliviar la gravedad de los efectos secundarios mientras que el rendimiento anti-tumoral se mantiene. Sin embargo, tienen el mandato de más estudios para determinar si la combinación de inhibidores de la multicinasa con estatinas puede tener efectos aditivos en paragangliomas agresivos. Como se informó anteriormente, la inhibición combinada de PI3K /AKT y mTORC1 señalización /2 se ha sugerido como régimen terapéutico prometedor para ciertos paragangliomas [1].

En conclusión, las estatinas pueden ser de beneficio solo o en combinación con otros agentes terapéuticos regímenes en pacientes con agresivos PHEO /paragangliomas que muestran actividad de la vía MAPK.

Información de apoyo sobre Table S1.
los números de muestra de la figura 1A con sus correspondientes chip Identificadores y los identificadores de muestra de Shankavaram & amp; Fliedner et al. Neoplasia 2013 15: 435-447. información del paciente y un enlace a los datos de microarrays depositados se dan en el artículo original
doi:. 10.1371 /journal.pone.0097712.s001 gratis (XLSX)

Reconocimientos

Nos haría agradecer al Dr. Tischler y el Dr. Martiniova para proporcionar células MPC y MTT, respectivamente. También estamos agradecidos al Dr. Perwitz, la Sra Maushagen, y la Sra Resch para proporcionar asesoramiento experto y anticuerpos. Además, nos gustaría expresar nuestro agradecimiento al Prof. Dr. Aherrahrou y Perwitz, por compartir generosamente sus equipos.

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