Extracto
El cáncer de colon es un tumor maligno que se desarrolla en los tejidos del colon y del recto. El pronóstico para el cáncer de colon metastásico sigue siendo pobre, y se requieren nuevas opciones terapéuticas para reducir la mortalidad por cáncer de colon. Recientemente, los niveles de AMPc intracelulares se han sugerido para influir en el comportamiento de las células cancerosas. Curiosamente, el ácido fosfatídico cíclico (CPA) y sus análogos estructurales inhiben el crecimiento de muchas líneas celulares de cáncer, y nuestro trabajo previo ha sugerido que cPA aumenta la producción de cAMP. Fosfodiesterasa (PDE) de tipo 3 isoformas PDE3A y PDE3B se expresan principalmente en el tejido cardiovascular y el tejido adiposo, respectivamente. Por otra parte, el aumento de los niveles de AMPc intracelulares se ha asociado con la inhibición del crecimiento en células de cáncer de colon. Estos hallazgos sugieren que cPA podría ser utilizado en la terapia del cáncer de colon. En este estudio, se encontró que cPA inhibió el crecimiento de células HT-29, que expresan altos niveles de PDE3B, pero no el crecimiento de células DLD-1, que expresan bajos niveles de PDE3B. Además, CPA inhibe la fosforilación de Akt en células HT-29 en una manera dependiente de la dosis. Nuestros resultados sugieren que la expresión PDE3B y los niveles de AMPc intracelulares se correlacionan con la proliferación de células de cáncer de colon. Estos resultados demuestran por primera vez que el CPA servir como una herramienta útil en una molécula de terapia dirigida para el cáncer de colon
Visto:. Tsukahara T, Matsuda Y, Haniu H (2013) cíclico del ácido fosfatídico estimula la producción de cAMP e inhibe El crecimiento de las células de cáncer de colon humano. PLoS ONE 8 (11): e81139. doi: 10.1371 /journal.pone.0081139
Editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Junio, 2013; Aceptado: October 18, 2013; Publicado: 25 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Tsukahara et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas-en-Ayudas a la investigación Científica (C) 22591482 (TT) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia, Grant-en-Ayudas de la Fundación Takeda Ciencia (TT), Astellas Fundación para la investigación sobre los trastornos metabólicos (TT) y la Sociedad de Nagano para la Promoción de la Ciencia (TT). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
nucleótido cíclico fosfodiesterasa (PDE) es una enzima que rompe los enlaces fosfodiéster [1]. En los seres humanos, PDEs están codificados por 21 genes de PDE [1], que se dividen en 11 familias basándose en la similitud estructural tal como la secuencia de proteínas de homología. Las PDEs son un grupo de enzimas que escinden el enlace fosfodiéster en el segundo mensajero AMPc, que desempeña un papel central en las respuestas celulares a diversos estímulos extracelulares [2]. Los niveles intracelulares de AMPc se regulan normalmente por el equilibrio entre las actividades de los dos tipos de enzimas, las enzimas generadoras de cAMP (adenilato ciclasas) y las enzimas de cAMP-degradantes (PDE), principalmente en respuesta a las hormonas y los neurotransmisores [3] [4] . PDE3B fue identificado en los seres humanos y sus transcripciones se encuentran predominantemente en el tejido adiposo [5], y se ha informado que ser fosforilada y activada en respuesta a la insulina y hormonas PDE3B que aumentan los niveles de cAMP [6].
lípidos bioactivos tal como el ácido fosfatídico cíclico (cPA) se han sugerido [7] [8] para aumentar los niveles de cAMP celulares y conducir a RhoA inactivación en células de hepatoma [9]. Anteriormente, hemos demostrado que cPA reduce los niveles de triglicéridos intracelulares e inhibe la expresión PDE3B [8]. Por otra parte, se encontró que los niveles de AMPc intracelulares en células 3T3-L1 a aumentar después de la exposición a CPA. Estos resultados sugieren que la vía CPA-PDE3B-cAMP es una diana molecular específica. Fosfolipasa D2 (PLD2) genera Contador público por lisofosfatidilcolina (LPC), y una dosis baja de un tratamiento con insulina de las células estimula la actividad PLD2 y aumenta los niveles intracelulares de CPA [7].
Recientemente, la PDE3 se ha sugerido que desempeñar un papel clave en la invasión de células de cáncer y la motilidad celular [10]. inhibidores de PDE3 tales como cilostazol inhibieron el crecimiento de células de carcinoma de pulmón de células pequeñas [11], la identificación de PDE3 como un objetivo para la terapia del cáncer anti-proliferativa. Reducción de la actividad PDE3B está acompañado por aumentos en los niveles intracelulares de cAMP, que activa cAMP dependiente de la proteína quinasa A (PKA) [1]. En las células humanas normales, cAMP promueve la proliferación y la diferenciación, pero en las células cancerosas, cAMP afecta a la proliferación claramente y suprime la proliferación basal a niveles considerablemente que en las células humanas normales [12]. Por otra parte, los altos niveles intracelulares de cAMP pueden reducir de manera efectiva en el crecimiento de células de cáncer in vitro [1].
Akt (proteína quinasa B) se ha demostrado recientemente para atenuar señalización cAMP mediante la activación de PDE3B [13]. Desde su descubrimiento como un proto-oncogén, la serina /treonina quinasa Akt se ha convertido en un foco importante de atención porque Akt regula diversos procesos celulares críticos, incluyendo la progresión del cáncer [14]. En el cáncer, la actividad de Akt se frecuencia elevada debido a múltiples mecanismos, incluyendo la pérdida de la función del supresor de tumores PTEN gen [15]. Cuando se activa, Akt puede fosforilar múltiples moléculas de aguas abajo implicadas en la regulación de la proliferación celular y la supresión de la apoptosis [16]. la señalización de Akt está vinculada a la formación de tumores, y los inhibidores de Akt se han desarrollado para controlar el crecimiento del cáncer [14]. Sin embargo, para el cáncer de colon, las opciones terapéuticas se limitan actualmente debido a que estos tratamientos producen efectos cardiovasculares y trombóticos adversos [17]. Por lo tanto, deben considerarse otras vías de señalización que puede ser utilizado para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para orientar el cáncer de colon. Curiosamente, CPA ha sido reportado para producir efectos anti-mitogénica y prevenir la invasión de células de cáncer in vitro y la metástasis in vivo [18] [19].
Hemos investigado la expresión de isoformas de PDE3 PDE3A y 3B en el cáncer de colon humano líneas de células HT-29 y DLD-1. reacción en tiempo real cadena de la polimerasa (RT-PCR) y transferencia Western revelaron que PDE3D fue la única isoforma PDE3 expresado en ambas líneas celulares. PDE3B ARNm y proteínas se expresaron en niveles elevados en las células HT-29, y se observó que los niveles de expresión PDE3B correlacionados con la proliferación celular del cáncer de colon. Se encontró que el tratamiento cPA elevado de AMPc intracelular y suprime la proliferación de células HT-29. Además, CPA inhibe la fosforilación de Akt en células HT-29 en una manera dependiente de la dosis. En conjunto, estos resultados sugieren que la vía de CPA-PDE3B-AMPc juega un crítico en la progresión del cáncer de colon
Materiales y Métodos
Reactivos
CPA (18:. 1 ) se adquirió de Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL). La dexametasona se adquirió de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Cilostazol, anticuerpo anti-PDE3B (sc-20793), y el anticuerpo anti-β-actina (sc-47778) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-Akt (# 9272) y anti-pAkt S473 (9271S) fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA).
Cultivo de células
líneas celulares de cáncer de colon humano HT-29, LOVO, y Caco-2 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VS). Se obtuvieron DLD-1 células de adenocarcinoma humano de la investigación de la ciencia Banco de Recursos de Salud (Osaka, Japón). Las células fueron cultivadas en Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM; Nacalai Tesque, Kyoto, Japón) o medio RPMI-1640 (Nacalai Tesque) que contiene 10% (v /v) de suero bovino fetal (FBS), 100 U /ml de penicilina, 10 mg /ml de estreptomicina y 2,5 mg /ml plasmocin
TM (Nacalai Tesque) a 37 ° C en un incubador humidificado con un 5% de CO
2.
Western blot análisis
Las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos (Iwaki, Tokio, Japón) a una densidad de 1 × 10
5 células /pocillo. Después de varios tratamientos (como se indica), las células se lisaron en hielo durante 30 min en un tampón de células de lisis (20 mM Tris-HCl [pH 7,4], 10% [v /v] de glicerol, NaCl 100 mM, 1% [v /v] Triton X-100, 1/100 cóctel inhibidor de la proteasa [Sigma], ditiotreitol 1 mM) y se centrifugó a 16.000 ×
g
durante 20 min a 4 ° C. Los sobrenadantes se guardan como lisados celulares y se ensayaron para el contenido de proteína utilizando el método de Bradford (Bio-Rad kit de ensayo de proteínas; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Los lisados celulares se separaron a continuación en 5% -20% de dodecilsulfato de sodio (SDS) poliacrilamida geles (e-PAGEL; ATTO, Tokio, Japón) y se electrotransfirieron a membranas Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA). Las membranas se bloquearon durante 1 h con Block Ace (DS Parma Biomedical Co. Ltd., Osaka, Japón) y se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en TBS-T con 5% Block Ace durante 12 horas a 4 ° C. Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando EzWestLumi más (ATTO).
Cuantitativo en tiempo real PCR análisis
El ARN celular total se preparó usando NucleoSpin® RNA II (Takara, Shiga, Japón), y 0,5 g de RNA total se utilizó para la síntesis de ADNc con el Kit de ReverTra Ace qPCR RT (Toyobo, Osaka, Japón) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Que mide los niveles de ARNm utilizando un sistema en tiempo real PCR ECO (Illumina Inc., San Diego, CA) y SYBR verde en tiempo real PCR Master Mix-Plus (Toyobo) con los siguientes pares de cebadores que se utilizan en las reacciones: PDE3A, 5'- AAAGACAAGCTTGCTTGCTATTCCAAA-3 '(F) y 5'-GTGGAAGAAACTCGTCTCAACA-3' (R); PDE3B, 5'-CCAGGTGTGCATCAAATTAGCA-3 '(F) y 5'-CAATGCCTTCTGTCCATCTCAA-3' (R); 18S rRNA, 5'-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3 '(F) y 5'-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3' (R). Todas las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 10 l, utilizando placas de 48 pocillos de PCR (iluminación). Las condiciones de ciclación fueron 95 ° C durante 10 min (activación de la enzima), seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 55 ° C durante 15 s, y 72 ° C durante 30 s. Después de la amplificación, las muestras se calentaron lentamente desde 55 ° C a 95 ° C y la fluorescencia se midió continuamente para obtener una curva de fusión. los niveles de ARNm relativos se calcularon utilizando la fórmula 2
-ΔΔCq, donde ΔCq es la diferencia entre el umbral del ciclo de un ADNc diana dada y la de un cDNA de referencia endógeno. Derivación de las fórmulas y las pruebas de validación se han descrito en el Boletín del Usuario de Applied Biosystems No. 2.
Medición de la proliferación celular
Las células se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos (5 x 10
3 células /pocillo) y se incubaron durante 24 h. La proliferación celular se midió usando el Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japón): 10 l de solución de Cell Counting Kit-8 se añadió al medio y se incubó durante 2 h en una incubadora con 5% de CO
2; la cantidad de tinte de formazán naranja producido se calculó midiendo la absorbancia a 450 nm en un lector de microplacas (Awareness Technology, Inc., Palm City, FL).
fosfodiesterasa de nucleótidos cíclicos ensayo
La actividad de PDE3B recombinante etiquetado con GST (BPS Bioscience Inc., San Diego, CA) se ensayó usando un kit de ensayo de PDE de nucleótidos cíclicos (Enzo Life Science, Farmindale, NY) en placas de 96 pocillos y midiendo la absorbancia a 620 nm con un espectrofotómetro ; los ensayos se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Efecto de la CPA en el nivel de cAMP intracelular
Las células fueron cultivadas en medio libre de suero que contiene CPA para 60 min. los niveles de cAMP celulares se midieron mediante ELISA (sistema de inmunoensayo cAMP Biotrak Enzyme, Amersham Biosciences) en placas de 96 pocillos y mediante la determinación de la absorbancia a 450 nm con un espectrofotómetro, siguiendo las instrucciones del fabricante.
interferencia de ARN
suprimimos PDE3B y la expresión de Akt en las células HT-29 mediante la transfección de las células con pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) dirigidos PDE3B y Akt (Santa Cruz de Biotecnología); Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) se utilizó para las transfecciones. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos (Iwaki) a una densidad de 5 × 10
4 células /pocillo en DMEM que contiene 10% de FBS y luego transfectadas con 100 pmol /ml de siRNAs o siRNAs (control) revueltos mRNA específica . Reducción de los niveles PDE3B y Akt fue confirmada por Western Blot.
El análisis estadístico
de Student
t-test
se utilizó para las comparaciones estadísticas. Las diferencias se consideraron significativas a la
p Hotel & lt; 0.05.
Resultados
La PDE3 isoformas PDE3A y son conocidos PDE3B que se expresa en los seres humanos [1]. Para evaluar la función de PDE3 en células de cáncer de colon humano, se utilizó 4 líneas celulares de cáncer de colon, HT-29, LOVO, DLD-1, y Caco-2 (Figura 1A), y examinamos la expresión de la proteína PDE3B en estas líneas celulares . PDE3B se expresó en niveles altos en células HT-29 LOVO y.
cuatro líneas celulares de cáncer de colon humano (HT-29, LOVO, DLD-1 y células Caco-2) se cultivaron en DMEM suplementado con 10 % de FBS; los niveles de proteína se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia Western con un anticuerpo anti-PDE3B, y bandas de proteínas se visualizaron utilizando un reactivo de quimioluminiscencia. Cada carril se cargó con 20 g de lisado de células enteras. β-actina se tiñó como control de carga. (B) en tiempo real medición de PCR de la expresión de PDE3A y 3B ARNm y ARNr 18S (control interno) en el HT-29 y células DLD-1 (media ± SEM, n = 3, ** p & lt; 0,01, Estudiante de
t
prueba). (C) Análisis de PCR en tiempo real (izquierda) y el Western Blot (derecha) para comparar la expresión PDE3B en células HT-29 después del tratamiento con CPA (1, 3, y 10 mM) durante 60 minutos (media ± SEM, n = 3 , ** p & lt; 0,01, de Student
t
prueba)
En otros estudios, se optó por una línea de células que expresan altos niveles de PDE3B, HT-29, y una celda. línea que expresa bajos niveles de PDE3B, DLD-1. Estar de acuerdo con los resultados de la expresión de proteínas, ARNm PDE3B también estuvo presente en niveles más altos en las células HT-29 que en DLD-1 células (Figura 1B). Por el contrario, PDE3A ARNm no se detectó en cualquiera de las líneas celulares. Estos resultados sugieren que PDE3B es la principal isoforma PDE en células DLD-1 HT-29 y. Hemos probado el efecto de la CPA en la expresión de ARNm y proteínas PDE3B en 29 HT-células (Figura 1C), y encontramos que cPA no influyó en la expresión de genes PDE3B, lo que sugiere que cPA no produce sus efectos por la disminución de la expresión PDE3B en HT- 29 células. A continuación, se examinó el efecto de la CPA en los niveles intracelulares de AMPc en las células DLD-1 HT-29 y. Aunque cAMP puede promover o suprimir la proliferación en muchos tipos celulares, en la mayoría de los casos cAMP parece ser anti-proliferativa. El tratamiento con la CPA aumentó sustancialmente los niveles de AMPc en células HT-29, pero no en las células DLD-1 (Figura 2A). Los resultados anteriores indicaron que el nivel de expresión PDE3B se correlacionó con el potencial de proliferación de células de cáncer de colon. Curiosamente, los experimentos de tiempo-por supuesto mostraron que el tratamiento cPA inhibe la hidrólisis de AMPc por PDE (Figura 2B), lo que sugiere que el bloqueo de la actividad de PDE3 con la CPA mejora la acumulación de AMPc intracelular. Sin embargo, el AMPc puede ejercer su efecto antiproliferativo a través de mecanismos distintos en diversas líneas celulares.
niveles intracelulares de cAMP en los lisados de cultivo se midieron usando el sistema de inmunoensayo cAMP Biotrak Enzyme. Cilostazol (5 M; Cilo) se utilizó como control positivo. Los datos se expresan como medias ± SEM (n = 4), ** p & lt; 0.01. (B) Evolución temporal de la inhibición CPA-dependiente de cAMP hidrólisis por PDE3B. PDE3B se incubó con cAMP y 5'-nucleotidasa con o sin la CPA (10 M) para 10 a 50 min; el inhibidor de la PDE IBMX (50 mM) se utilizó como control positivo.
El efecto de la CPA en la proliferación celular se determinó utilizando un ensayo colorimétrico. Se encontró que cPA inhibe la proliferación de células HT-29 LOVO y pero no de DLD-1 y células Caco-2 (Figura 3A), que tienen bajos niveles endógenos de PDE3B que HT-29 y células LOVO [8]. Para probar si PDE3B afecta a la proliferación de células HT-29, la expresión PDE3B fue derribado el uso de siRNAs. El PDE3B de metas de siRNA derribado PDE3B con eficacia, como se muestra mediante transferencia Western con un anticuerpo anti-PDE3B (Figura 3B). Cabe destacar que 24 horas después de la transfección con el PDE3B-siRNA, la proliferación de células HT-29 se redujo sustancialmente. Estos resultados indican que la anulación de la PDE3B inhibe el crecimiento de células HT-29.
Las células (1 × 10
5 células /pocillo) se sembraron en placas de 6 pocillos y se incubaron durante 24 h o 48 h a 37 ° C con 5% de CO
2, después de lo cual se añadieron 10 l de la solución de Cell Counting Kit-8 al medio. Después de incubar durante 2 h más, la cantidad de tinte de formazán naranja generado se determinó midiendo la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas. Los datos se expresan como medias ± SEM (n = 4), ** p & lt; 0.01. (B) El derribo de expresión PDE3B en células HT-29. La proteína total se extrajo a partir de células no transfectadas y de células transfectadas con ARNsi de control o siRNA-PDE3B específica y analizadas por Western Blot con un anticuerpo anti-PDE3B; β-actina se tiñó como control de carga de proteínas. (C) La inhibición del crecimiento celular después de caída PDE3B se midió usando el Kit-8 de conteo celular. Las células (1 × 10
5 células /pocillo) se sembraron en placas de 6 pocillos y se incubaron durante 24 horas a 37 ° C con 5% de CO
2, después de lo cual el 10 l de la Recuento celular solución Kit-8 se añadió al medio. Después de incubar durante 2 h más, la cantidad de tinte de formazán naranja generado se determinó mediante la obtención de la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas. Los datos se expresan como medias ± SEM (n = 4), ** p & lt; 0.01.
Nuestros resultados sugieren que los niveles PDE3B se correlaciona con las tasas de proliferación celular y que el efecto de PDE3B depende del tipo de célula. A continuación, determinamos si cPA inhibe la fosforilación de Akt en células HT-29, debido a que muchos efectos de cAMP están mediados por la activación de Akt [20] [21]. Akt se asocia con la supervivencia de células tumorales, la proliferación y la invasividad [22] [23]. Para determinar si cPA contribuye a los efectos de Akt en células HT-29, hemos probado cómo cPA afecta a la activación de Akt. La inhibición de la señalización de Akt se ha asociado con las acciones biológicas de los compuestos quimio-preventiva, como el galato de epigalocatequina, que suprime los niveles marcadamente pAkt en tumores intestinales sin alterar sustancialmente [24] niveles totales de Akt. la activación de Akt implica la fosforilación de dos residuos, Thr308 en el bucle de activación y Ser473 en el motivo hidrófobo C-terminal; fosforilación de Ser473 se ha examinado ampliamente en muestras de tumor como un indicador de la actividad de Akt [25]. En primer lugar, se analizó la fosforilación de Akt Ser473 basal en las células HT-29 y encontramos este sitio en Akt constitutivamente a ser fosforilada (Figura 4A). Además, determinamos si cPA inhibe la fosforilación de Akt en células HT-29. Nuestros resultados indican que cPA bloqueó la fosforilación constitutiva de Akt en una manera dependiente de la dosis (Figura 4, A y B), y que esta inhibición mediada-CPA de la fosforilación de Akt duraron hasta 120 min (Figura 4C). Aunque CPA es un lípido estable y 75% de la molécula puede permanecer intacto en medio de cultivo durante 24 h [19], CPA se puede convertir en LPA por la apertura de la estructura de anillo de la CPA. Esto plantea la posibilidad de que la escisión hidrolítica del anillo de fosfato cíclico de la CPA por fosfatasas de fosfolípidos en las células HT-29 conduce a la formación LPA, que puede activar Akt [26].
(A) la fosforilación de Akt en HT- 29 células tratadas con cPA (1, 3, y 10 M), NGF (50 ng /ml, control positivo), o dexametasona (inhibidor de Akt, 25 m). Akt fosforilada (p-Akt) y el total de Akt se detectaron por inmunotransferencia. (B) Las intensidades de las bandas se cuantificaron Akt, y la relación de fosforilados a Akt total se calculó. Los datos se expresan como medias ± SEM (n = 3), ** p & lt; 0.01. (C) células HT-29 fueron tratadas con CPA (10 mM) y los lisados se recogieron a 30, 60, 90, y 120 min. la inhibición de Akt se midió como una pérdida de la fosforilación de Ser473. (D) El derribo de la expresión de Akt en células HT-29. La proteína total se extrajo a partir de células no transfectadas y de células transfectadas con ARNsi de control o-Akt siRNA y se analizaron mediante transferencia de western con un anticuerpo anti-Akt; β-actina se tiñó como control de carga de proteínas. los niveles de (E) intracelular de cAMP en HT-29 tratadas con 1, 3, o 10 M CPA para 60 min después de Akt desmontables; los niveles de cAMP se determinaron en los lisados celulares utilizando el sistema de inmunoensayo enzimático de cAMP Biotrak. Los datos se expresan como medias ± SEM (n = 3), ** p & lt; . 0,01
Por último, se midieron los niveles de cAMP en células HT-29 en presencia y en ausencia de la CPA después de eliminar a Akt; Western Blot con un anticuerpo anti-Akt confirmó que el siRNA Akt-focalización derribado expresión Akt eficazmente en células HT-29 (Figura 4D). En particular, el tratamiento cPA de los 29-HT células con niveles disminuidos de Akt no logró aumentar significativamente los niveles de cAMP (Figura 4E).
Discusión
lisofosfolıpido ha sido durante mucho tiempo reconocido como un metabolito de fosfolípidos de membrana. Recientemente, sin embargo, el lisofosfolípido ha surgido como una molécula candidata para fines de diagnóstico y farmacológicas, y LPA se ha informado de que un potente inductor de la progresión del cáncer en múltiples niveles. Aunque CPA es químicamente similar a LPA, las funciones de la CPA son distintas de, o incluso opuestas a las de LPA. Por ejemplo, LPA estimula pero cPA inhibe la proliferación celular y la invasión de células del cáncer [19] [27] [9]. Por otra parte, CPA puede reprimir la invasión del cáncer y elevar los niveles de AMPc intracelular [27]. enzimas PDE3 constituyen una de las familias más estudiadas de las PDE cAMP hidrolizantes, porque las enzimas PDE3 desempeñan varios papeles en los procesos fisiológicos y fisiopatológicos en el cáncer [28]. En el contexto del cáncer de colon, el cilostazol inhibidor de PDE3-específico, que se ha utilizado previamente para tratar a pacientes con trombosis, se utilizó para evaluar los efectos de la inhibición PDE3B en el crecimiento celular. La proliferación de células es inhibida por AMPc a través de diversos mecanismos que pueden inducir la detención del ciclo celular en G1 y la apoptosis [29]. Sin embargo, el mecanismo a través del cual PDE3B está involucrado en la producción de cAMP intracelular en respuesta a CPA ha seguido siendo poco clara. Hemos llevado a cabo este estudio sobre las células de cáncer de colon que utilizan un CPA, que había sido previamente demostrado aumentar los niveles intracelulares de cAMP directamente [8], una función de la CPA, que también es sugerido por las propiedades anti-invasivos de la CPA [9]. Se encontró que cPA inhibió el crecimiento de las células HT-29 LOVO y, que expresan altos niveles de PDE3B, pero no el crecimiento de células DLD-1 y Caco-2, que expresan bajos niveles de PDE3B. Apoyando a estos hallazgos, CPA inhibió la actividad de PDE3B en células que expresan altos niveles de PDE3B, y siRNA mediada por supresión de la expresión PDE3B inhibió el crecimiento celular. Estos resultados sugieren que PDE3B regula los niveles de AMPc intracelular en las células de cáncer de colon y está implicado en el crecimiento celular del cáncer. En este estudio, se encontró que cPA inhibe la fosforilación de Akt en células HT-29 en una manera dependiente de la dosis. Akt regula múltiples funciones celulares, incluyendo la supervivencia celular y la proliferación y diversos aspectos del metabolismo intermediario. En el epitelio del colon neoplásico, Akt se encontró que era no sólo se expresa en niveles más altos, sino también hyperactivated [30], y los estudios en modelos químicos han confirmado que Akt es upregulated en las primeras etapas de la tumorigénesis intestinal. expresión PDE3B y los niveles de AMPc intracelulares se correlacionan con el potencial de proliferación de células de cáncer de colon. Hemos corroborado nuestros resultados utilizando el análisis de siRNA y se demostró una disminución en pSer473-Akt con buena correlación entre el grado de la producción de cAMP y la regulación a la baja de la fosforilación de Akt. Estos resultados sugieren que la vía de señalización relacionados con Akt está estrechamente vinculada a la vía CPA-PDE3B-AMPc y por lo tanto indican por primera vez que cPA puede servir como una molécula útil en la terapia dirigida para el cáncer de colon.
Conclusiones
Nuestros hallazgos indican que el AMPc juega un papel crítico en la inhibición del crecimiento de células de cáncer de colon en un CPA. En base a los resultados, se sugiere que elucidar los mecanismos moleculares por los cuales cPA induce la producción de cAMP mediante la inhibición de la PDE3B en células de cáncer de colon puede proporcionar información valiosa que ayudan a explicar cómo se regula el crecimiento de células cancerosas. La comprensión de cómo se regula el crecimiento de células de cáncer, a su vez, ayudar a desentrañar los mecanismos moleculares de la invasión de células del cáncer y la metástasis y facilitar el análisis de las vías de transducción de señales que conducen a la proliferación celular. Aunque se necesitan más investigaciones para examinar la diafonía entre las moléculas de señalización que hemos descrito aquí, nuestros resultados apoyan colectivamente el uso potencial de la CPA como un compuesto terapéutico para el tratamiento de cáncer de colon.