Extracto
Con el fin de generar señales genómicas, el receptor de andrógenos (AR) tiene que ser transportados en el núcleo a estímulos androgénicos. Sin embargo, hay pruebas de
in vitro
experimentos que en las células resistentes a la castración cáncer de próstata (CRPC) la AR es capaz de trasladar en el núcleo de una manera independiente de ligando. El reciente descubrimiento de que la inhibición de las 3β glucógeno-sintasa quinasa (GSK-3ß) induce una exportación nuclear rápido de la AR en células de cáncer de próstata andrógeno estimulada nos llevó a analizar los efectos de una inhibición de GSK-3β en el resistente a la castración sublíneas LNCaP y LNCaP C4-2-SSR. Ambas líneas celulares exhiben altos niveles de AR nuclear en ausencia de estímulos androgénicos. La exposición de estas células a la maleimida SB216763, un inhibidor de GSK-3β potente, resultó en una exportación nuclear rápido de la AR, incluso en condiciones de andrógenos privados. Además, la capacidad de C4-2 y las células LNCaP-SSR para crecer en ausencia de andrógenos se redujo después de la inhibición farmacológica de la GSK-3β
in vitro
. La capacidad de SB216763 para modular la señalización AR y función en CRPC
in vivo
se demostró, además, en un ensayo de xenoinjerto membrana corioalantoidea de pollo modificado después de la administración sistémica de SB216763. Nuestros datos sugieren que la inhibición de la GSK-3β ayuda a orientar la AR para la exportación desde el núcleo disminuyendo así los efectos de la AR en las células mal situada CRPC. Por lo tanto, la inhibición de GSK-3β podría ser una nueva estrategia interesante para el tratamiento de CRPC
Visto:. Schütz SV, Schrader AJ, Zengerling F, Genze F, Cronauer MV, Schrader M (2011) La inhibición de la glucógeno sintasa quinasa-3β contrarresta la actividad independiente de ligando del receptor de andrógenos en el cáncer de próstata resistente a la castración. PLoS ONE 6 (9): e25341. doi: 10.1371 /journal.pone.0025341
Editor: Vladislav V. Glinski, Universidad de Missouri-Columbia, Estados Unidos de América
Recibido: March 2, 2011; Aceptado: 1 de septiembre de 2011; Publicado: 29 Septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Schütz et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación que produce la actuación leones Vaincre le Cancer, Luxemburgo (MVC). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción regulación
transcripcional por receptores nucleares desempeña un papel fundamental en el desarrollo y crecimiento del cáncer de próstata (PC) células. Esto es bien ejemplificado por el papel del receptor de andrógenos (AR), un factor de transcripción activados por ligando que pertenece a la superfamilia de receptores de esteroides. En ausencia de andrógenos, la AR es predominantemente situado en el citoplasma estabilizado por un complejo multichaperone [1]. Tras la unión de los andrógenos, se cree que el AR para someterse a un cambio conformacional que conduce a una homodimerización con otra proteína AR después de la disociación de las partes del multichaperone complejo [2]. A continuación, el AR se transporta activamente al interior del núcleo donde se une a secuencias de ADN específicas denomina elementos de respuesta a andrógenos (ARE) encontraron dentro de promotor o potenciador regiones de genes diana AR [3] activando por lo tanto el aparato de transcripción general [4].
la dependencia de andrógenos inicial de las células del cáncer de próstata es la razón por la cual la mayoría responden a los andrógenos PC terapia de ablación. Por desgracia, el beneficio de la ablación de andrógenos sólo es transitorio. Después de un período de alrededor de dos años, casi invariablemente PC progresar a un estado de la enfermedad denomina cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) donde las células tumorales pueden crecer y sobrevivir en los niveles de castración de los andrógenos circulantes. Aunque el
in vitro
desarrollo de un fenotipo independiente de los andrógenos se basa principalmente en la pérdida de la AR en las células tumorales, no hay evidencia de varios estudios clínicos que la AR es raramente pierde en las células CRPC
In vivo
[5], [6]. Además, estos estudios sugieren que la resistencia a la terapia hormonal convencional no se debe a una pérdida de sensibilidad de andrógenos, sino más bien pueden ser una consecuencia de un eje AR de señalización desregulada [7].
Con el fin de generar señales genómicas en células PC dependientes de hormonas de la AR deben ser transportados en el núcleo a estímulos androgénicos. Hay pruebas convincentes de
in vitro
experimentos que en un subconjunto de células CRPC, el AR adquiere la capacidad de someterse independiente de ligando yendo y viniendo desde el citoplasma al núcleo [8]. Lo más interesante, en estas células la AR muestra un alto nivel de actividad constitutiva, independiente de andrógenos [9]. Como la presencia nuclear del receptor es un requisito previo para la AR señalización, la regulación de la translocación nuclear podría revelar nuevas estrategias para el tratamiento tanto de PC andrógeno-dependientes, así como CRPC.
Varios estudios han ofrecido ideas sobre la nuclear importación de la AR. Una secuencia de localización nuclear bipartita (NLS) se ha identificado en el dominio de unión de ADN (DBD) y la región bisagra de la AR [10]. Este NLS utiliza la vía importin clásica para el transporte a través del complejo de poro nuclear [11], [12]. Además, una NLS menos definida está presente en el dominio de unión al ligando (LBD) de la AR [13], [14]. En contraste con la importación nuclear de la AR, los mecanismos implicados en la exportación nuclear de AR son poco conocidos. Los dominios de unión a ADN (DBD) de diversos receptores de esteroides se han sugerido para funcionar como señales de exportación nuclear (NES) para una calreticulin exportación nuclear mediada por [15]. Sin embargo, para la AR estos datos se han discutido controvertida [16], [17]. Recientemente, Saporita et al. informado de la identificación de un nuevo NES (aminoácidos 743 a 817) situados en el LBD de la AR [18]. La identificación de un NES en el LBD del AR está de acuerdo con los hallazgos previos de nuestro grupo de estudio de la exportación nuclear de la AR en células PC estimulado por andrógenos después de la inhibición de las 3β glucógeno-sintasa quinasa (GSK-3β) [19 ].
el descubrimiento de que la inhibición de la GSK-3β induce una rápida exportación nuclear de la AR en las células PC-andrógenos estimulada nos llevó a analizar los efectos de la inhibición de GSK-3β en sublíneas LNCaP resistentes a la castración C4-2 y LNCaP-SSR [20], [21], tanto sabe que presentan altos niveles de AR nuclear en ausencia de estímulos androgénicos. Tanto
in vitro
, así como
in vivo
datos presentados en este estudio sugieren que la inducción de la exportación AR nucleocytoplasmic podría ser una estrategia útil para disminuir AR señalización, especialmente en avanzado CRPC.
resultados
AR y GSK-3β se regulan en marcha en líneas celulares CRPC
con el fin de analizar los efectos de los inhibidores de GSK-3ß sobre AR-actividad en las células primero se determinó CRPC los niveles de AR o GSK-3ß endógenos en extractos de células enteras de células PC cultivan en ausencia de DHT. Las sublíneas LNCaP AR-positivo C4-2 y LNCaP-SSR, conocido a proliferar en ausencia de andrógenos, sirvieron como modelos para el CRPC [20], [21]. El LNCaP sensible a andrógenos, así como las células PC3-AR negativo sirvieron como controles. Como se ve en la Figura 1A, la AR fue detectable en todas las líneas de LNCaP cultivadas en ausencia del andrógeno DHT AR-estabilizador. Los niveles intracelulares de RA fueron significativamente superiores en las células CRPC AR-positivo (+ 177% C4-2, LNCaP-SSR + 126%) (Tabla 1). El aumento de AR-proteína en sublíneas LNCaP resistentes a la castración fue acompañado de un aumento de PSA (C4-2 + 337% y LNCaP-SSR + 110%, respectivamente), este último que sugiere que la AR es particularmente activa en estas células ( la Figura 1A, B, Tabla 1). El análisis de transferencia Western de la proteína GSK-3β intracelular revelado niveles de GSK-3ß intracelulares significativamente mayor en C4-2 (+ 361%) y LNCaP-SSR (+ 150%) de las células en comparación con las células LNCaP parentales (Figura 1A, Tabla 1) .
(a) intracelular AR y los niveles-3β-proteína GSK en las líneas celulares PC cultivadas en ausencia de andrógenos. El LNCaP AR-positivo, las células LNCaP C4-2-SSR y así como las células PC3-AR negativo se cultivaron durante 48 horas en condiciones de andrógenos privados. Posteriormente, las células se lisaron y los lisados celulares se analizaron por transferencia Western para AR y GSK-3β. bandas de ß-actina sirvió como control de carga. (B) los niveles de PSA intracelular en las células cultivadas en condiciones CPRC andrógeno-privada. células LNCaP C4-2 AR-positivo, LNCaP-SSR y se cultivaron y se trataron como se ha descrito. los niveles de PSA relativas se determinaron en los correspondientes lisados celulares por transferencia Western como se describe en Material y Métodos. β-actina bandas sirvieron como control de carga.
El SB216763 maleimida reduce GSK-3β-activación de la fosforilación de la tirosina 216 en
Varios estudios informaron que la mayoría de la GSK moléculas 3ß son inactivos en células LNCaP como resultado de una fosforilación en la serina 9 (S9) [26], [27]. Sin embargo, hay evidencia experimental de que la actividad de GSK-3β no es completamente inhibida en las células LNCaP [28], [29], [30], [31], [32]. Después del tratamiento DHT, la fosforilación de GSK-3β en la tirosina 216 (GSK-3β
Y216), un sitio de fosforilación de GSK-3β-activación, se aumentó en las células LNCaP y C4-2 (Fig. 2). Con el fin de inhibir la actividad de GSK-3β residual en las células LNCaP y C4-2, las células fueron tratadas con el SB216763 maleimida, un inhibidor de GSK-3β recientemente demostrado que inhibe la fosforilación de GSK-3β
Y216 [33]. Además, la capacidad de SB216763 para inhibir la actividad GSK-3β en células C4-2 se verificó por alteraciones en el estado de fosforilación de β-catenina, un objetivo corriente abajo prototípico de GSK-3β (Figura S1).
LNCaP células y células C4-2 fueron sembradas en matraces T25 y se dejaron adherir durante la noche. Después de eso, el medio se reemplazó por medio libre de esteroides y se cultivaron las células durante otras 24 horas. Posteriormente, se añadió SB216763 (concentración final 5 mM) 30 minutos antes de la DHT (10 nM) de tratamiento. Después de 4 horas, se analizaron los lisados celulares para GSK-3β
Y216 y GSK-3β
fosforilación S9 tal como se describe en Materiales y Métodos.
Como era de esperar, la incubación con SB216763 inhibe la fosforilación de GSK-3β
Y216 en ambas líneas celulares, siendo más pronunciada en las células C4-2 independientes de andrógenos (Fig. 2). Lo más interesante, una disminución inducida por SB216763 de GSK-3
Y216 fosforilación en células C4-2 DHT-tratado fue acompañado por un aumento en la fosforilación de S9 (Fig. 2).
unliganded AR se localiza en el núcleo en CRPC LNCaP-sublíneas
localización nuclear de la AR es un requisito previo para la señalización genómica. Como se ve en la Figura 3, las sublíneas LNCaP CRPC-SSR y C4-2 exhiben alta AR nuclear en ausencia de estímulos androgénicos. Cuando se trata con DHT, AR nuclear se incrementó dramáticamente en las células LNCaP dependientes de hormonas, mientras que el aumento de la AR nuclear en LNCaP y C4-2-SSR seguía siendo marginal (Fig. 3, Tabla 2). A fin de analizar la importación nuclear independiente de ligando de la AR en LNCaP y resistente a la castración C4-2, las células fueron transfectadas con una construcción de expresión que codifica para la proteína verde fluorescente de tipo silvestre AR-Eos fusión (AR-EosFP) [19]. En contraste con las células LNCaP en la que AR-EosFP sólo era nuclear en presencia de DHT, AR-EosFP era detectable en los núcleos de las células C4-2 en ausencia de andrógenos (Fig. 4). Este hallazgo sugiere que la localización nuclear predominante del AR en células de C4-2 no se debe a una función autónoma de la molécula receptora sino que depende de una desregulación de los factores celulares en las células C4-2.
Las células fueron cultivadas bajo condiciones libres de esteroides durante 24 horas. Las células se trataron a continuación con 10 nM de DHT y se incubaron durante otros 30 min. Posteriormente, se añadió SB216763 (concentración final 5 mM) y se dejó que las células crecieran durante otros 210 min. Después de este tratamiento, se prepararon extractos nucleares y se analizaron para AR y lamina A como se describe en Material y Métodos. los niveles de AR y lamina A se cuantificaron por densitometría. los niveles de AR se expresaron en factor de cambio AR /Lamin de las células cultivadas en ausencia de DHT y SB216763, que se fijó en 1.
células LNCaP y células C4-2 fueron transfectadas con par-t1EosFP y crecido durante 24 horas en ausencia de andrógenos. Posteriormente, las células fueron tratadas con /sin DHT (concentración final 10 nM). Después de 4 horas de localización nuclear o citoplasmática de AR-EosFP se controló por microscopía de fluorescencia.
Tratamiento de sublíneas LNCaP resistentes a la castración con SB216763 desencadena una exportación nuclear CRM1 mediada de la AR en el ausencia de andrógenos
En las células PC-andrógenos estimulada, la inhibición a corto plazo de la actividad de GSK-3β con varios inhibidores de molécula pequeña ha demostrado inducir una rápida nucleocytoplasmic shuttling CRM1 dependientes de la AR. La exportación nuclear era independiente del modo de acción del inhibidor utilizado en diferentes estudios [32], [19]. Con el fin de analizar los efectos de un inhibidor de GSK-3β-inhibición en la acumulación nuclear independiente de andrógenos de la AR, las líneas celulares LNCaP CRPC-SSR y C4-2 fueron tratados con el inhibidor de GSK-SB216763 3β. células LNCaP dependientes de andrógenos parentales sirvieron como controles (Figura 3). El tratamiento de células con SB216763 C4-2 induce una exportación nuclear rápido de la AR en la ausencia /presencia de andrógenos como se muestra por densitometría de tres transferencias de Western independientes (tasa de AR-exportación en ausencia de DHT = 64%, en presencia de DHT = 75%) (Tabla 2). acumulación nuclear independiente de andrógenos de la AR en la sublínea LNCaP-SSR resistente a la castración también se redujo después del tratamiento SB216763: sin embargo, los efectos fueron menos pronunciadas que en las células C4-2 (41% en ausencia de DHT; 46% en presencia de DHT) (Tabla 2). La exportación nuclear de la AR en las células LNCaP cultivadas en ausencia de andrógenos se mantuvo marginal, pero todavía era detectable (17% en ausencia de DHT; 7% en presencia de DHT) (Tabla 3). Curiosamente, la exportación nuclear de la proteína de AR en las células C4-2 crecido en ausencia de DHT después del tratamiento SB216763 podría ser inhibida por leptomycin B confirmando un mecanismo de exportación CRM1-dependiente (Fig. 5).
C4- 2 las células cultivadas en ausencia de andrógenos se incubaron con /sin el inhibidor de CRM1 leptomycin B (LMB) 30 min antes del tratamiento SB216763. Después de 4 horas, se prepararon extractos nucleares y se analizó la AR y la lamina A como se describe en Materiales y Métodos.
El silenciamiento y la inhibición a largo plazo de la GSK-3β en las células C4-2
el uso de un shRNA validado comercial dirigido contra GSK-3β (32), hemos sido capaces de reducir drásticamente los niveles de GSK-3ß intracelular en las células C4-2 (Fig. 6A). Esta baja regulación fue acompañado de una disminución de AR proteína nuclear en células C4-2. agotamiento nuclear de la proteína AR fue menos pronunciado cuando se cultivaron células C4-2 en presencia de la hormona AR-estabilización de DHT (Fig. 6A). El tratamiento a largo plazo de las células LNCaP y 22Rv1 de andrógenos estimulada con diferentes inhibidores de la GSK-3ß farmacológicas ha demostrado repetidamente que GSK-3β está implicado en la estabilidad AR [27], [32]. El hecho de que las células C4-2 expresan altos niveles de citoplasmática, así como AR nuclear en ausencia de andrógenos nos llevó a analizar los efectos de SB216763 en los niveles de AR intracelulares. Como se ve en la Fig. 6B, el tratamiento a largo plazo con SB216763 conduce a una baja regulación de la proteína en las células AR C4-2 cultivadas en ausencia de andrógenos.
(A) El silenciamiento de la GSK-3β en las células C4-2. C4-2 células fueron transfectadas transitoriamente con enfermedad renal poliquística-GSK-3β-v1 o PKD Negcon-v1. 48 horas después de la transfección, se añadió 10 nM DHT que se indique. Después de otras 24 horas, se prepararon extractos nucleares tal como se describe en Material y Métodos. (B) la inhibición a largo plazo de la GSK-3β utilizando SB216763. células C4-2 AR-positivos fueron tratados con cantidades crecientes de SB216763 durante 48 horas en ausencia de andrógenos. Las células se lisaron y los lisados celulares se analizaron por transferencia Western para AR. ß-actina bandas sirvieron como control de carga.
células CRPC AR-positivas C4-2 y LNCaP-SSR son más susceptibles a los efectos inhibidores del crecimiento de la SB21676 inhibidor de GSK-3β que las células LNCaP o la AR células PC3-negativos
La inhibición de la GSK-3β se ha demostrado que inhibe la proliferación de las células AR-positivas cultivadas en presencia de niveles fisiológicos de los andrógenos [27], [32]. Con un enfoque en las células CRPC, se examinaron los efectos de SB216763 en la proliferación de líneas celulares de PC crecen bajo condiciones de andrógenos-privada. Como se ve en la Figura 7A, las células CRPC AR-positivas cultivadas en ausencia de andrógenos son más susceptibles a los efectos inhibidores del crecimiento de SB216763 (C4-2 & gt; LNCaP-SSR & gt; LNCaP). En un experimento de curso de tiempo (Fig. 7B), la proliferación de las líneas celulares CRPC AR-positivo LNCaP-SSR y C4-2 cultiva durante 96 h en presencia de 1 M SB216763 fue inhibida por 26% y 35%, respectivamente. En contraste, la tasa de proliferación de la LNCaP de los padres y el PC3 AR-negativo solamente se redujo en un 19% y 8% cuando se cultivan en las mismas condiciones. En resumen, las células LNCaP AR-positivas son más susceptibles al tratamiento SB216763 que las células PC3 AR-negativo. El efecto de SB216763 sobre la proliferación celular de las células PC cultivadas bajo condiciones de andrógenos-privada fue la más pronunciada en las células CRPC AR-positivo (C4-2 & gt; LNCaP-SSR & gt; LNCaP & gt; PC3). (Fig. 7A, B)
AR-positivo LNCaP, las células LNCaP-SSR y C4-2, así como las células PC3 AR-negativa, se trataron con cantidades crecientes de SB216763 durante 48 horas (a) o con /sin 1 mM SB216763 para 0, 24 y 96 horas (B). La proliferación se midió usando un ensayo de MTT como se describe en Material y Métodos. Los resultados mostrados en (A) se expresan como% de los controles no tratados ± desviación estándar. Los resultados mostrados en (B) se expresan en porcentaje de SB216763 tratados de control /sin tratar que se fijó en 100% para el punto de tiempo cero ± desviación estándar.
La inhibición de la GSK-3β regula AR-señalización mediante la modulación de la localización intracelular de la AR
in vivo
con el fin de simular los efectos de una inhibición de GSK-3β
in vivo
, que utiliza una membrana corioalantoidea de pollo modificado ( CAM) modelo [25]. SB216763 se inyectó en una CAM de la vena que permite la propagación sistémica del compuesto en el sistema de embrión de pollo-CAM. Los efectos de SB216763 en los nódulos tumorales injertadas se controlaron después de 48 horas por inmunohistoquímica. En contraste con los
in vitro
observaciones no sólo C4-2, sino también LNCaP expresan altos niveles de AR nuclear
in vivo gratis (AR nuclear: LNCaP: 74,6 ± 25,8%, C4-2: 63,4 ± 10%). tratamiento SB216763 siguientes niveles de AR nuclear en las células C4-2 se redujeron en un 57% con respecto a la el 63,3 27.1% después de 48 horas (Fig. 8, Tabla 1). niveles Nuclear AR en LNCaP se mantuvo casi afectados por SB216763 (LNCaP: sin tratar 74,6 ± 25,8%; tratado con SB216763 76,5 ± 18%) (Tabla 3). El porcentaje de células de PSA-positivas fue mayor en la línea celular de C4-2, en comparación con la línea celular LNCaP parental (% de células con tinción para PSA: LNCaP 3 ± 3,3% frente al 16,8 ± C4-2 10,6%), lo que sugiere que la AR en C4-2 está activo. Después del tratamiento SB216763 la disminución de AR nuclear en C4-2 fue acompañado por una disminución en células de PSA-positivos (C4-2 sin tratar: 16,8 ± 10,6% frente a 3,8 ± 4,7% en C4-2 SB216763 tratados). (Fig 8, Tabla 3).
El ensayo CAM se realizó con células C4-2. Posteriormente, se llevó a cabo la localización nuclear de la AR y la distribución intracelular en PSA tumorales-nódulos no tratados y tratados SB216763-(ampliación 400x) como se describe en Material y Métodos. AR células positivas están marcados con estrellas.
Discusión
En los países industrializados occidentales, PC presenta un problema de salud serio y es la segunda causa de muerte por cáncer en hombres de edad avanzada. A pesar de que la PC es muy heterogénea en su etiología, la señalización de andrógenos es un elemento clave en el desarrollo y progresión de la PC. Inicialmente, las células PC son dependientes en gran medida de los andrógenos para el crecimiento y la supervivencia. Como consecuencia, la terapia endocrina que implica el agotamiento de andrógenos por castración quirúrgica o médica, así como el bloqueo del receptor de andrógenos con anti-andrógenos, se ha convertido en un tratamiento estándar para la enfermedad avanzada o metastásica. Sin embargo, el beneficio de las terapias endocrinas de PC avanzado sólo es transitorio. Dentro de un período de alrededor de 2 años, casi todos los cánceres de próstata progresan a un estado resistente a la castración de la enfermedad en la que ellos ya no responden a las terapias endocrinas estándar. En el pasado, se ha planteado la hipótesis de que el estado de CRPC era debido a una selección clonal de las células AR-negativo. Esta suposición se basa principalmente en el modelo de tumor de rata Dunning en el que el desarrollo de un estado de andrógenos insensible está vinculada a la pérdida de la AR en las células tumorales durante la retirada de andrógenos. Sin embargo, los estudios clínicos mostraron que la AR es raramente perdió pero a menudo es mayor en las muestras de tumor CRPC y sus metástasis [5], [6], [34], [35]. El hecho de que en ausencia de estímulos androgénicos muchos de los mismos genes que se incrementan por los andrógenos en PC dependiente de andrógenos ser elevados en CRPC apoya la noción de proteínas AR constitutivamente activa en células CRPC [36]. Esta hipótesis es apoyada por la observación de que una alteración de la función AR inhibe la proliferación de células CRPC cultivadas en ausencia de andrógenos [37].
En este informe se utilizaron las sublíneas LNCaP AR-positivo C4-2 y LNCaP-SSR que son conocidos tanto para crecer y sobrevivir en condiciones de andrógenos-privada como un
in vitro
modelo de tumor en CRPC para [21], [20]. Hemos sido capaces de demostrar que, en contraste con las células LNCaP parentales dependientes de andrógenos, sublíneas LNCaP resistentes a la castración C4-2 y LNCaR-SSR exhibieron altos niveles de AR y PSA cuando se cultivan en ausencia de andrógenos. Lo más interesante, el aumento en los niveles de proteína intracelular AR fue acompañado por un aumento en GSK-3β, un ubicuo serina treonina quinasa demostrado ser un importante modulador de la estabilidad AR
in vitro
[32], [27]. Aunque por el momento no podemos decir que la desregulación de los niveles de GSK-3ß es responsable de la tendencia de las células PC para aumentar los niveles intracelulares AR-mientras se haga resistente castración, nuestro
in vitro
observaciones están en línea con un estudio clínico reciente que muestra una acumulación de GSK-3β en las células de los tumores resistentes a la castración [38]. La detección de altos niveles de PSA intracelulares en C4-2 y LNCaP-SSR desprovisto de estímulos androgénica sugiere que la AR es funcionalmente activo en estas células, incluso bajo condiciones de andrógenos privadas.
Con el fin de generar señales genómicas, las AR tiene que ser transportado en el núcleo. En este estudio, el AR se encontró que era predominantemente nuclear en las células LNCaP-SSR y células C4-2, en ausencia de andrógenos. La razón de la acumulación nuclear independiente de andrógenos de longitud completa en células AR CRPC permanece en gran medida desconocido. En condiciones normales, la translocación nuclear de la AR se incrementa dramáticamente en la hormona de unión como se ha demostrado para LNCaP. Los resultados recientes sugieren que, con el fin de entrar en el núcleo, la AR tiene que someterse a un cambio de conformación intra-molecular que trae el N- y C-terminales de la molécula en las proximidades. Este cambio conformacional intra-molecular que permite la activación y translocación nuclear de un monómero de AR, antes de la AR dimerización, generalmente se induce por la unión del ligando y sólo se produce en las células vivas, no en lisados de células [39], [40], lo que sugiere que este reorganización intra-molecular de la AR no es la proteína-autónoma pero depende de factores celulares. Para probar esta hipótesis, se posteriormente las células transfectadas C4-2 y LNCaP con una construcción de expresión que codifica para un AR de tipo salvaje fusionada a una proteína Eos verde fluorescente (EosFP) [41]. En presencia de DHT AR-EosFP era detectable en los núcleos de ambos LNCaP y C4-2. Cuando se cultiva en ausencia de DHT, AR-EosFP fue sólo detectable en los núcleos de las células C4-2 resistentes a la castración, pero no en los núcleos de las células LNCaP dependientes de andrógenos. Esta observación es consistente con un experimento similar que demuestra una localización nuclear robusta de un AR GFP-etiquetados transfectadas en células C4-2 [42]. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la localización nuclear de AR de larga duración en CRPC no requiere necesariamente la unión de la hormona y puede en cambio ser regulada por otros factores.
Como se ha demostrado recientemente por nuestro grupo, la inhibición a corto plazo de la serina /treonina quinasa GSK-3β por inhibidores de molécula pequeña indujo un rápido shuttling, CRM1 dependientes nucleocytoplasmic de la AR en las células tratadas con andrógenos [19]. Como GSK-3β se sobreexpresa en células CRPC
in vivo e in vitro
, la hipótesis de que la enzima también podría ser parte de un complejo de proteína putativa implicada en la acumulación nuclear de la AR. Esta hipótesis está apoyada por un hallazgo anteriores que muestran que GSK-3β está altamente fosforilada en la tirosina 216 (Y216), la función de activación de la enzima, en las células C4-2 [30]. El aumento de la GSK-3β
fosforilación Y216 en células LNCaP después del tratamiento DHT (Fig. 2), además, sugiere un papel importante para GSK-3β en la señalización de AR en condiciones normales. En un intento de interrumpir la localización nuclear predominante de la AR en las células CRPC, se trataron resistente a la castración C4-2 y LNCaP-SSR, así como la LNCaP parental con el SB216763 maleimida. Este compuesto altamente potente es conocida para inhibir la actividad de tirosina quinasa intramolecular de la molécula de GSK-3β, siendo este último responsable de su autofosforilación en Y216 [33]. Como se ve en la Figura 2, el inhibidor de GSK-3β SB216763 es capaz de disminuir Y216-fosforilación de GSK-3β en LNCaP, así como en las células C4-2. Tras el tratamiento con SB216763, la acumulación nuclear de la AR en las sublíneas LNCaP resistentes castration- C4-2 y LNCaP-SSR se redujo drásticamente en presencia, y lo más importante en la ausencia, de DHT, siendo más pronunciada en células C4-2 (Tabla 2). shuttling nucleocytoplasmic de la AR después de GSK-3β-inhibición en células C4-2 cultivadas en ausencia de DHT podría ser revertido por leptomycin B (LMB), lo que sugiere un mecanismo de exportación CRM1-dependiente (Fig. 5). En un estudio anterior, hemos identificado un sitio de unión CRM1 en el C-terminal de la AR [19]. Debido a su cercanía con el dominio de unión del ligando, la hipótesis de que la unión de la hormona podría regular la accesibilidad del sitio de unión CRM1, modulando así la exportación nuclear de la AR. La observación de que la AR se pueden exportar desde los núcleos de las células CRPC que crecen en ausencia de andrógenos es un importante hallazgo novedoso, lo que demuestra claramente que la exportación nuclear de la AR después de la inhibición de GSK-3β no se debe a una modulación de las propiedades de unión de la hormona del receptor.
el hecho de que la inhibición a corto plazo de la GSK-3β (máx. 4 horas) conduce a una rápida exportación de la AR nos llevó a analizar los efectos de una inhibición a largo plazo de la enzima en AR CRPC-células positivas. El silenciamiento de la GSK-3β usando específica shRNA condujo a una disminución de AR nuclear en células C4-2. agotamiento nuclear de la proteína AR fue menos pronunciado en las células C4-2 cultivadas en presencia de la hormona AR-estabilización de DHT. A pesar de estos hallazgos apoyan la hipótesis de que la inhibición de la GSK-3β desencadena la nucleocytoplasmic shuttling de la AR, los datos derivados de las largas shRNA-experimentos deben ser interpretados con cuidado. la inhibición a corto plazo de la actividad de GSK-3β por pequeñas moléculas como SB216763 se demostró repetidamente para inducir un rápido de las exportaciones, CRM1 dependientes nuclear de la AR en las células PC [19], [32]. En contraste con estos resultados, la inhibición a largo plazo de la GSK-3β causó una degradación proteasomal de la proteína AR [32]. Debido a GSK-3β desencadena localización AR así como la estabilidad AR, que postula que el agotamiento dramática de AR nuclear en las células C4-2 siguiente silenciamiento GSK-3β se debe a una combinación de exportación nuclear y la degradación proteasomal de la molécula receptora.
el hecho de que la inhibición de la GSK-3β afecta a la función AR, así como la estabilidad AR nos llevó a analizar los efectos de una inhibición de la GSK-3β en la proliferación de las células PC
in vitro
. La respuesta al tratamiento de las células con SB216763 PC fue más pronunciado en las células CRPC AR-positivo (inhibición del crecimiento celular: C4-2 & gt; LNCaP-SSR & gt; & gt LNCaP; PC3). La capacidad de SB216763 para inhibir la proliferación celular fue acompañado de su capacidad para inducir una exportación CRM1 dependientes de la AR en las células PC.
Con el fin de probar la eficacia de los inhibidores de GSK-3ß como agentes terapéuticos potenciales, se ampliado nuestros estudios para un modelo de xenoinjerto-CAM. Para nuestra sorpresa, el AR era predominantemente nuclear en xenoinjertos de LNCaP, así como en xenoinjertos de C4-2. Una posible explicación de esto podría ser la producción de andrógenos por el organismo huésped. Además, el AR de LNCaP y sus derivados está llevando a una mutación puntual (T877A) que conduce a un AR promiscua que puede, al menos en parte, ser activado por diversos esteroides no androgénicos [43], [44]. Sin embargo, el AR de C4-2, en comparación con el AR de la LNCaP parental es más activo en el modelo CAM-xenoinjerto, como se documenta por los niveles de PSA intracelulares (células positivas para PSA: LNCaP 3,1% y el 16,8% C4-2 ). Después de un tratamiento de 48 horas con SB216763, los niveles de AR nucleares de células C4-2 se redujeron significativamente, lo que fue acompañado de una reducción considerable en los niveles de PSA intracelulares. En contraste con los resultados en las células C4-2 los efectos en la AR y PSA en las células LNCaP se mantuvo insignificante.
En conjunto nuestro estudio demuestra que (1) la sobreexpresión de la AR en las células CPRC tiene su paralelo en un aumento de intracelular GSK-3β, (2) los efectos de GSK-3β sobre la señalización AR no se deben a una modulación de DHT unión a la AR, (3) la acumulación nuclear de la AR en las células CRPC no es una función autónoma de un receptor de AR mutado pero está mediada por factores celulares desregulados, como GSK-3β, (4) GSK-3β y CRM1 son parte de un complejo putativo controlar la localización nuclear de la AR en las células CRPC, y (5) inhibición de la actividad GSK-3β por inhibidores de moléculas pequeñas induce una rápida exportación nuclear de la AR en las células CRPC
in vitro
y
in vivo
que la modulación de la señalización AR.
la dependencia de la CRPC en AR activa transcripcionalmente ha resurgido el interés en el desarrollo de inhibidores de orientación del eje AR o andrógenos. terapias hormonales de próxima generación reconocen el hecho de que en CRPC la AR puede ser activado por la producción intrínseca de andrógenos de tejidos, así como por factores de crecimiento de péptidos. Entre los agentes hormonales actualmente se están probando son inhibidores de CYP17 como abiraterona, TAK-700 y de TOK-001 o la segunda generación anti-andrógenos MDV-3100 [45]. inhibidores de moléculas pequeñas como EPI-001 y sintokamide dirigidos al dominio de transactivación en el extremo N-terminal de la AR han mostrado resultados alentadores in vitro, así como en modelos animales experimentales [46], [47].