Extracto
metilación del ADN desempeña un papel importante en la carcinogénesis y la reversibilidad de este epigenética modificación hace que sea una diana terapéutica potencial. Hasta la fecha, los inhibidores de la ADN metiltransferasa (DNMTi) no han demostrado eficacia clínica en el cáncer de próstata, con uno de los principales obstáculos es la incapacidad para controlar la actividad de la droga durante el ensayo. Dada la alta frecuencia y la especificidad de
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la metilación del ADN en el cáncer de próstata, se investigó si
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es un marcador útil de la eficacia del tratamiento DNMTi. células de cáncer de próstata LNCaP se trataron con 5-aza-2 'desoxicitidina (5-aza-CDR) ya sea con una única dosis alta (5-20 mM), cada día alterno (0,1 a 10 mM) o diaria (0,005-2,5 M). Un régimen de tratamiento diario con 5-aza-CDR era óptima, con una supresión significativa de la proliferación celular logrado con dosis de 0,05 M o mayor (p & lt; 0,0001) y la inducción de la muerte celular de 0,5 M (p & lt; 0,0001). En contraste, el tratamiento con una única dosis elevada de 20 mM 5-aza-CDR inhibió la proliferación celular, pero no fue capaz de inducir la muerte celular. La desmetilación de
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se observó con dosis de 5-aza-CDR que indujeron supresión significativa de la proliferación celular (≥0.05 M). Re-expresión de la proteína GSTP1 sólo se observó a dosis de 5-aza-CDR (≥0.5 M) asociados con la inducción de la muerte celular. El tratamiento de células LNCaP con una DNMTi más estable, Zebularina requiere al menos un 100 veces la dosis más alta (≥50 M) para inhibir la proliferación y fue menos potente en la inducción de la muerte celular, lo que corresponde a una falta de GSTP1 proteína re-expresión. Hemos demostrado que
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estado de metilación del ADN y la expresión de la proteína se correlaciona con la respuesta al tratamiento DNMTi en células de cáncer de próstata. Desde
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está metilado en casi todos los cánceres de próstata, nuestros resultados justifican sus pruebas como marcador de la respuesta a la terapia epigenética en ensayos clínicos futuros. Llegamos a la conclusión de que el estado de metilación del ADN y la expresión de la proteína de
GSTP1 ¿Cuáles son buenos indicadores de la eficacia DNMTi
Visto:. Chiam K, Centenera MM, Butler LM, Tilley WD, Bianco-Miotto T ( 2011) GSTP1 metilación del ADN y la expresión de estado es indicativo de 5-aza-2'- desoxicitidina eficacia en células de cáncer de próstata humano. PLoS ONE 6 (9): e25634. doi: 10.1371 /journal.pone.0025634
Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: Marzo 7, 2011; Aceptado: September 8, 2011; Publicado: 28 Septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Chiam et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación médica y Salud Nacional (627185; WDT, LMB, TBM), el Departamento de Defensa (W81XWH-04-1-0017; WDT, LMB), cáncer Australia /Prostate Cancer Foundation de Australia ( 627229; LMB, WDT), Fundación de cáncer de próstata de Australia Equipo Grant (EG0809; WDT, LMB, TBM), W. Bruce Cancer Council Salón de la Beca de Investigación SA (TBM), y una beca de investigación senior SA Cancer Council (LMB). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es uno de los cánceres masculinos más comúnmente diagnosticado en los países occidentales. Las terapias actuales para la enfermedad clínicamente localizada incluyen la extirpación quirúrgica de la glándula prostática (prostatectomía) y /o radioterapia con o sin terapia de privación de andrógenos (ADT). Desde el descubrimiento, en los años 1940, de que el cáncer de próstata es dependiente de las hormonas sexuales masculinas [1], en un principio de castración y, posteriormente, diversas formas de ADT, ya sea solo o combinado con receptor de andrógenos (AR) antagonistas, han sido la terapia principal para metastásico enfermedad. Después de una duración variable inicial de la regresión del tumor, el cáncer de próstata metastásico más progresan a una etapa de "resistente a la castración" que no responde a ADT. Actualmente hay opciones limitadas de tratamiento disponibles para el cáncer de próstata resistente a la castración y en consecuencia hay una seria necesidad de desarrollar nuevas terapias.
Está bien establecido que las alteraciones epigenéticas son eventos comunes en la carcinogénesis, incluyendo el cáncer de próstata, el cual puede conducir a la expresión aberrante de genes críticos tales como supresores de tumores y oncogenes. A diferencia de las mutaciones del ADN, alteraciones epigenéticas son químicamente reversible por agentes conocidos como inhibidores de epigenéticos y por lo tanto son posibles dianas terapéuticas. Ejemplos de inhibidores de epigenéticos que han demostrado éxito como agentes terapéuticos incluyen los inhibidores de la ADN metiltransferasa (DNMTi), 5-aza-citidina (5-aza-CR o Vidaza) y su análogo más potente 5-aza-2 'desoxicitidina (5- aza-CDR o decitabina). 5-aza-CR y 5-aza-CDR son nucleósido DNMTi desarrolló inicialmente como agentes quimioterapéuticos de cáncer que se utilizan actualmente para el tratamiento de los síndromes mielodisplásicos (SMD) [2]. Las acciones de desmetilación de 5-aza-CR y 5-aza-CDR se basan en su capacidad de incorporar en el ADN de replicación y covalentemente unirse a la enzima DNMT1 de una manera irreversible, que conduce a la degradación de proteínas DNMT1 [2], [3]. Como se requiere DNMT1 para mantener la metilación del ADN durante la replicación, la degradación de DNMT1 posteriormente se traduce en una pérdida de la metilación del ADN.
expresión aberrante de enzimas epigenéticos modificación implicados en la regulación de la metilación del ADN que se ha observado en todas las etapas de la progresión del cáncer de próstata [4], [5], [6]. los niveles globales de las enzimas 5-metilcitosina y epigenéticos implicados en la modificación de la metilación del ADN (es decir DNMTs) predicen la probabilidad de progresión de la enfermedad en el cáncer de próstata. Este hallazgo sugiere que la metilación del ADN puede ser importante en la progresión del cáncer de próstata y por lo tanto DNMTi debe ser considerada como una opción potencial de tratamiento [7], [8], [9]. Mientras que
in vitro
experimentos y modelos animales han demostrado que el 5-aza-CDR tiene actividades antitumorales en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata [10] [11], [12], [13], [14, ], los ensayos clínicos de 5-aza-CDR para el tratamiento de tumores sólidos no han tenido éxito debido a eventos adversos relacionados con el fármaco, tales como mielosupresión, náuseas y vómitos [15], [16], [17]. Además de los problemas de toxicidad, la eficiencia del suministro y la captación de 5-aza-CDR a los tejidos tumorales, existe incertidumbre acerca de la relación dosis-horario óptimo para determinados tipos de tumores [18]. Hasta la fecha, sólo un pequeño estudio de fase II con 5-aza-CDR en el cáncer de próstata se ha publicado, hace aproximadamente una década [16]. Si bien hay ensayos clínicos en curso para 5-aza-CDR en diversos tumores sólidos, ninguno de estos ensayos son el cáncer-específica ni incluyen el cáncer de próstata (Institutos Nacionales de Salud, EE.UU., clinicaltrials.gov).
in vitro
estudios que investigan los efectos de la 5-aza-CDR en líneas celulares de cáncer de próstata (véase el cuadro S1) han utilizado varios regímenes de tratamiento y las diferentes definiciones de bajas y altas dosis 5-aza-CDR, lo que dificulta para comparar entre los estudios y definir el régimen de tratamiento óptimo, incluyendo dosis y horario, para el cáncer de próstata. Sorprendentemente, muy pocos de los
in vitro
estudios en (Tabla S1 A) han investigado los efectos de la 5-aza-CDR sobre la proliferación y supervivencia de las células del cáncer de próstata, sino que han investigado el efecto de 5-aza- CDR sobre la expresión génica con el fin de identificar candidatos genes regulados epigenetically (Tabla S1 B)
.
El objetivo de este estudio fue investigar los efectos dependientes de la dosis de 5-aza-CDR en células de cáncer de próstata con el fin de proporcionando una base para el desarrollo de un régimen óptimo de 5-aza-CDR para el cáncer de próstata. También se investigó la toxicidad relativa de 5-aza-CDR y Zebularina en células de cáncer de próstata LNCaP. Zebularina es un análogo de citidina que tiene funciones similares a 5-aza-CDR como un agente de desmetilación, pero es menos tóxico y tiene una vida media más estable (~508 horas a 37 ° C, pH 7) que 5-aza-CDR ( 12 horas a 37 ° C, pH 7) [19], [20]. Identificación de un buen marcador de la eficacia DNMTi para los ensayos clínicos, al igual que la medición de los niveles séricos de PSA para controlar la eficacia de ADT [21], tendría el potencial para ayudar a la gestión clínica de los pacientes con cáncer de próstata tratados con terapias epigenéticas. Para investigar la eficacia de 5-aza-CDR y Zebularina en células de cáncer de próstata, examinamos la metilación del ADN y el estado de expresión de la glutatión-S-transferasa P1 (
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) de genes.
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se hypermethylated en casi todos los cánceres de próstata humanos y su nivel de promotor de la metilación del ADN es capaz de diferenciar entre la hiperplasia benigna de próstata y diferentes grados de adenocarcinoma de próstata [6], [22], [23], [24] , [25]. Mientras que los estudios actuales se han centrado en el uso de
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como un marcador potencial para la detección precoz del cáncer de próstata, se propone que la evaluación de la metilación del ADN de la
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región promotora, así como la expresión de GSTP1 , tiene el potencial de ser una herramienta útil para determinar la eficacia DNMTi en el cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
medición de la viabilidad celular
LNCaP y PC3 células de carcinoma de próstata humano ( American Type Culture Collection, ATCC) se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con 5% o suero bovino fetal al 10% (FBS). 5-aza-CDR y Zebularina (Sigma, A3656 y Z4775) se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) y solución salina tamponada de Hank, respectivamente. Para el único tratamiento y cada día se alternan con 5-aza-CDR, las células se sembraron por triplicado en placas de 24 pocillos a una densidad de 2,5 × 10
4 células por pocillo en 1 ml de medio RPMI. Para el tratamiento diario 5-aza-CDR y tratamiento Zebularina, las células se sembraron por triplicado en placas de 12 pocillos a una densidad de 1 × 10
4 células por pocillo en 1 ml de medio RPMI. Las células se dejó que se unieran durante 241h o 48 h, una vez que se alcanzó la confluencia de células y después se incubaron con medio que contiene 5-aza-CDR a concentraciones de 0 a 20 M o Zebularina a concentraciones de 50 a 1000 mM. Para los tratamientos posteriores o adicionales, se añadieron fresco 5-aza-CDR o Zebularina diluido en medios de comunicación a las células. Los medios que contienen los agentes respectivos eran recién preparados a partir de 10 mM 5-aza-CDR y 70 valores zebularine mM antes de cada tratamiento. Las células se trataron con tripsina y se contaron usando un hemocitómetro en los puntos de tiempo especificados después del inicio del tratamiento y la viabilidad celular evaluada por Trypan exclusión de colorante azul como se describe anteriormente [26]. Los datos se expresan como la media +/- SE de pocillos por triplicado y son representativos de al menos dos experimentos independientes.
inmunotransferencia
células LNCaP fueron sembradas en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 × 10
4 células por pocillo en 2 ml de medio RPMI que contiene 10% de FBS. Las células se dejó que se unieran durante 24 h antes de medio se reemplazó con medio que contiene tratamientos. Las células se lisaron mediante la adición de tampón de lisis de ensayo de radioinmunoprecipitación (10 mM Tris-HCL, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de Triton X-100) que contienen los mini-completa gránulos de inhibidor de la proteasa (Roche). Los lisados (15-30 g) se sometieron a electroforesis a través de 5% o 12% de geles de poliacrilamida, se transfirió a membrana de nitrocelulosa (Amersham Biosciences), y se bloquearon en 5% leche en polvo no grasa en TBS que contiene 0,05% de Tween 20 durante la noche. La inmunodetección se realizó con el anticuerpo primario específico diluido en 1% de leche sin grasa en polvo en TBS que contiene 0,05% de Tween 20. anticuerpo GSTP1 (Chemicon, AB8902) se utilizó a una dilución de 1:5000 y la incubación durante la noche a 4 ° C. anticuerpo Hsp90 (Santa Cruz Biotechnology) se utilizó a una dilución de 1:1000 y 30 min de incubación a temperatura ambiente. De rábano picante anti-anticuerpo secundario de conejo conjugado con peroxidasa (DAKO, E0432) se utilizó a una dilución de 1:2000 y 30 min de incubación a temperatura ambiente. Los resultados se visualizan en Hyperfilm (GE Healthcare) usando la detección de quimioluminiscencia (GE Healthcare).
metilación del ADN análisis
Después de la evaluación de la viabilidad celular, se recogieron las células LNCaP restantes para la extracción de ADN genómico utilizando TES (10 mM Tris-HCl a pH 8, NaCl 0,1 M, EDTA 1 mM), tampón de proteinasa K y SDS al 20% como se ha descrito anteriormente [27]. ADN (1-2 g por muestra) era bisulfito modificado con el Kit MethylEasy ™ DNA Bisulfito de modificación (Human Genetic Signatures Pty Ltd) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Un volumen total de 25 l o 50 l de mezcla de reacción PCR se realizó con 3-5 l de la ADN modificado con bisulfito y 2,5 unidades de ADN polimerasa de HotStarTaq (Qiagen).
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reacción en cadena de la polimerasa-metilación específica (MSP) [28] y combinado Restricción bisulfito Análisis (COBRA) [29] cebadores fueron adquiridos de GeneWorks (Australia del Sur, Australia).
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secuencias de cebador MSP fueron como se describe anteriormente [24] y todas las secuencias de los cebadores utilizados en este estudio se proporcionan en la Figura S1. Las temperaturas de recocido para los respectivos cebadores fueron: 40 ciclos a 64,3 ° C durante metilados
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cebadores MSP; 45 ciclos a 61,6 ° C durante no metilado
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cebadores MSP; 45 ciclos a 56,8 ° C durante
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cebadores COBRA. Los productos PCR de la
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análisis COBRA se digirieron con las enzimas de restricción BstUI y HhaI (New England Biolabs). Los productos de PCR se visualizaron por electropheresis gel de agarosa con el sistema de documentación de geles AlphaImager 2200 (San Leandro).
El análisis estadístico
Una forma de análisis de varianza (ANOVA) con un post-hoc múltiple de Dunnet se utilizó la prueba de comparación para comparar la viabilidad celular entre los tratamientos y el control del vehículo cuando se evaluó un solo punto de tiempo. ANOVA de dos vías con una prueba post-hoc de Bonferroni se utilizó para comparar la viabilidad celular entre los tratamientos y el control del vehículo cuando se evaluaron varios puntos de tiempo. Los análisis se realizaron con el software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., CA, EE.UU.) y la significación estadística se estableció en p. & Lt; 0,05 (dos caras)
Resultados
Revista de 5- se requiere un tratamiento aza-CDR para inducir la inhibición óptima de la proliferación y la inducción de la muerte celular en células de cáncer de próstata LNCaP
para investigar la eficacia de diferentes esquemas de 5-aza-CDR de tratamiento, se realizaron ensayos de proliferación celular y la viabilidad de LNCaP células de cáncer de próstata y comparó el siguiente: un solo tratamiento, tratamientos alternativos día y tratamientos diarios. En comparación con el control (vehículo), un tratamiento único de 5-aza-CDR efectivamente suprime la proliferación de células de cáncer de próstata LNCaP en todas las concentraciones usado (5-20 mM) (Figura 1A, Día 4: p & lt; 0,001 para 5 M y p & lt ; 0,0001 para 10, 20 m, día 6: p & lt; 0,0001 para todas las dosis), pero no inducir la muerte celular significativa 6 días después del tratamiento (Figura 1B). Cuando 5-aza-CDR se añadió cada segundo día (tratamiento alternativo día), dosis más bajas de 5-aza-CDR (0,1, 0,5 y 2,5 M) en comparación con las dosis utilizadas en el programa de tratamiento único como resultado una inhibición significativa dependiente de la dosis de la proliferación celular en comparación con los tratados con vehículo las células LNCaP (Figura 1C, Día 4 y 6: p & lt; 0,0001 para todas las dosis). Sólo dosis de 5-aza-CDR de 2,5 M o mayor muerte celular significativa inducida en comparación con la de las células tratadas con vehículo (Figura 1D, Día 6: p & lt; 0,001 para 2,5 M y p & lt; 0,0001 para 10 mM). En contraste, el tratamiento diario de 5-aza-CDR consigue una inhibición significativa de la proliferación a concentraciones más bajas (0,05 M) (Figura 2A, Día 6: p & lt; 0,05 para 0,05 M, p & lt; 0,001 para todas las dosis de 0,5 M o más, Un día 8 : p & lt; 0,05 para 0,01 M y p & lt; 0,001 para todas las dosis de 0,05 M o mayor) y el aumento de la muerte celular en células LNCaP (Figura 2B, día 8: p & lt; 0,001 para las dosis de 0,5 M o más) en comparación con dosis similares administra cada segundo día. la inhibición dependiente de la dosis de la proliferación se logra con dosis diarias 5-aza-CDR de 0,05 M o mayor que resulta en una reducción del 62% en el número de células en comparación con las células tratadas con vehículo y la inhibición completa de la proliferación a dosis de 0,5 M o mayor (Figura 2A y 2E, p & lt; 0,0001). A las dosis que provocaron una inhibición completa de la proliferación, también hubo un aumento significativo en la muerte celular, de aproximadamente 3 veces, en comparación con el control del vehículo (Figura 2B y 2F, p & lt; 0,0001).
próstata LNCaP células cancerosas (2,5 × 10
4 células por pocillo en placas de 24 pocillos) fueron tratados con dosis crecientes de 5-aza-CDR (5-20 mM) administrado (A-B) una vez en el día 0 o (C- D) con dosis crecientes de 5-aza-CDR (0,1-10 M) se repone en días alternos para un máximo de 6 días. (A) y las células (C) se contaron a intervalos regulares usando un hemocitómetro y el número de células viables se evaluó mediante exclusión con azul de Trypan colorante. (B) y (D) el número de células muertas se expresa como un porcentaje del número total de células contadas. Los datos en cada punto de tiempo representa la media +/- SE de pocillos por triplicado. * Dos vías ANOVA: p & lt; 0,0001 para (A), (C) y (D) (10 mM); P & lt;. 0.001 para (D) (2,5 M) cuando se compara con el control del vehículo (veh) el último día de tratamiento
células cancerosas
(A-B) y LNCaP (C-D) de próstata PC3 (1 × 10
4 células por pocillo en placas de 12 pocillos) fueron tratados con dosis crecientes de 5-aza-CDR (0,005 a 2,5 M) se repone diariamente durante hasta 8 días. (A) y las células (C) se contaron a intervalos regulares usando un hemocitómetro y el número de células viables se evaluó mediante exclusión con azul de Trypan colorante. (B) y (D) el número de células muertas se expresa como un porcentaje del número total de células contadas. (E) y (F) la viabilidad celular relativa después de 6 u 8 días de tratamiento con 5-aza-CDR se presentan como el porcentaje de células viables en comparación con el control del vehículo (veh) y la muerte celular relativa como el pliegue de por ciento de células muertas en comparación con el control veh. Los datos en cada punto de tiempo representa la media +/- SE de pocillos por triplicado a partir de al menos dos experimentos. * Dos vías ANOVA: p & lt; 0,05 para (A) (0,01 M); p & lt; 0,001 para (A) (0,05 a 2,5 M), (B) y (D) (0,5 M); p & lt; 0,0001 para (C) y (D) (1, 2,5 M) cuando se comparó con el control del vehículo (veh) el último día de tratamiento
Efectos de la 5-aza-CDR sobre el cáncer de próstata. la viabilidad celular es independiente de la AR
Para determinar si los efectos de la 5-aza-CDR en células LNCaP dependían de un AR funcional, un programa de tratamiento diario, también se realizó en células PC3, que carecen de un funcional ARKANSAS. Cuando se trata con 5-aza-CDR en dosis de 0,005 a 2,5 M, hubo una inhibición dependiente de la dosis similar de la proliferación y la inducción de la muerte celular en células PC3 ya que había en las células LNCaP (Figura 2A-D). Considerando que una inducción aproximada de 3 veces de la muerte celular se observó con 0,5 M 5-aza-CDR en ambas líneas celulares (Figura 2F), en las células PC3, dosis más bajas de 5-aza-CDR (0,005 M y 0,01 M) dado en una reducción significativa en el número de células (p & lt; 0,0001, Figura 2E), y esto ocurrió en un punto de tiempo anterior (4 días) en comparación con las células LNCaP (6 días) tratados de forma idéntica (Figura 2A y 2C). Desde 5-aza-CDR se basa en la división de células para la incorporación para provocar sus efectos, la diferencia en el tiempo entre las líneas celulares 2 duplicar, aproximadamente 24 horas en células PC3 en comparación con 48 horas en las células LNCaP, puede explicar el aumento de la potencia de 5 -aza-CDR sobre la viabilidad celular PC3. La inhibición independiente de andrógenos de la proliferación y la inducción de la muerte celular por la 5-aza-CDR en células de cáncer de próstata se confirmó adicionalmente mediante ensayos de viabilidad celular realizados en células LNCaP cultivadas en medio esteroide-agotado (Figura S2).
prolongados resultados 5-aza-CDR de tratamiento en la muerte celular similar, con independencia del régimen de tratamiento
Para caracterizar mejor las diferencias entre el día alternativo y el régimen de tratamiento diario, el más alto de tratamiento en días alternos (10 mM) y la más alta diaria tratamiento (2,5 M) se compararon en una curva de crecimiento prolongado (Figura 3). células de cáncer de próstata LNCaP se trataron con control de vehículo o 5-aza-CDR repone en días alternos o diariamente, como el anterior. La viabilidad celular y la muerte celular se evaluaron después de 6 días de tratamiento. Un conjunto de células y luego continuó recibiendo 5-aza-CDR se repone en días alternos o diariamente hasta el día 12 (indicado como 10 M-12d o 2,5 M-12d; Figura 3), mientras que el otro conjunto de células recibida medios que contienen el control del vehículo ( denotado como 10 M-6d o 2,5 M-6D; Figura 3). Después de 6 días de tratamiento, tanto en el día alternativo y los regímenes de tratamiento diario inducidos supresión del crecimiento en comparación con el control del vehículo, pero sólo el tratamiento diario resultó en la muerte celular (Figura 3). Como las células de control habían alcanzado la confluencia por día 6, se excluyeron estas células durante el resto del experimento. Con un tratamiento continuado a uno y otro régimen de la cantidad de muerte celular siguió aumentando durante los últimos 12 días, alcanzando el 61,4% para el tratamiento en días alternos y 68,6% para el tratamiento diario. Curiosamente, las células que sólo recibieron el tratamiento durante 6 días muestran niveles equivalentes de la muerte celular a los que recibieron el tratamiento durante 12 días (Figura 3).
(A) y células de cáncer de próstata LNCaP (C) (2,5 × 10
4 células por pocillo en placas de 24 pocillos) fueron tratados con 10 mM 5-aza-CDR o de control del vehículo, que se repone en días alternos. (B) y (D) células de cáncer de próstata LNCaP (1 × 10
4 células por pocillo en placas de 12 pocillos) fueron tratados con 2,5 M 5-aza-CDR o vehículo control, se repone diariamente. Después de 6 días de tratamiento, se dejaron las células de control y las células restantes continuaron recibiendo 5-aza-CDR (10 M-12d o 2,5 M-12d, respectivamente) o recibido vehículo fresco medios que contienen (10 M-6d o 2,5 M -6D). (A) y las células (C) se contaron en el día 6, 8 y 12 usando un hemocitómetro y el número de células viables se evaluó mediante exclusión con azul de Trypan colorante. (B) y (D) el número de células muertas se expresa como un porcentaje del número total de células contadas.
GSTP1
estado promotor de la metilación del ADN y las proteínas reexpresión como marcadores de la 5-aza-CDR eficacia
para investigar cómo los efectos antiproliferativos de 5-aza-CDR se relacionan con su actividad de desmetilación, MSP se realizó para evaluar el estado de metilación del ADN de la
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promotor (Figura 4A). Hypermethylated
GSTP1
promotor de ADN estaba presente en las células LNCaP tratadas con el control del vehículo. Por el contrario, no metilado
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promotor de ADN se detectó en las células LNCaP tratadas diariamente con 0,05 M o mayor 5-aza-CDR, pero completamente desmetilado
GSTP1
promotor de ADN no se observó incluso con el más alto concentración de 5-aza-CDR. La desmetilación de la
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promotor por 5-aza-CDR en dosis grandes que o igual a 0,05 M coincidió con la capacidad de 5-aza-CDR para inhibir sustancialmente la proliferación de células en estas concentraciones (Figura 2A-B) .
ADN y las proteínas se extrajeron a partir de células LNCaP tratadas con dosis crecientes de 5-aza-CDR (0,005 a 2,5 M). Las células se trataron diariamente y el ADN y la proteína recogieron después de 6 días de tratamiento. (A) MSP se realizó en ADN bisulfite modificados con cebadores dirigidos metilado modificado con bisulfito de
GSTP1
promotor o no metilado
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promotor. (B-C) el estado de metilación relativo del promotor GSTP1 después del tratamiento 5-aza-CDR fue evaluado por COBRA usando dos enzimas de restricción, BstUI y HhaI. Se han usado MDA-MB-231 células de cáncer de mama como un control para no metilado
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promotor. (D) por inmunotransferencia se realizó para analizar la expresión de proteína GSTP1. La detección de Hsp90 se utilizó como control de carga.
A fin de examinar el estado de metilación de ADN relativo de los
células LNCaP GSTP1
promotor en la 5-aza-CDR tratada, era COBRA realizado utilizando BstUI y enzimas de restricción HhaI (Figura 4B-C). El metilado
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promotor presente en MDA-MB-231 células de cáncer de mama no fue digerido por BstUI o HhaI (Figura 4B). En consonancia con los resultados de MSP, metilados
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promotor se detectó en vehículo tratada (control) y 5-aza-CDR trataron células LNCaP a dosis de desde 0,005 hasta 0,5 mM. Considerable
GSTP1
desmetilación promotor de ADN sólo se observó en respuesta a 0,5 M 5-aza-CDR, que es la 5-aza-CDR dosis más baja suficiente para inducir la inhibición completa de la proliferación celular y la muerte celular LNCaP demostrado en el ensayos de viabilidad celular (Figura 2A-B). Estos hallazgos sugieren que la eficacia de 0,5 M 5-aza-CDR se debe a su capacidad para inducir una mayor desmetilación del ADN de
GSTP1
en comparación con dosis más bajas.
El mayor efecto de desmetilación de 0,5 M en comparación con 0,05 M 5-aza-CDR corresponde con la proteína GSTP1 re-expresión observada en 0,5 M 5-aza-CDR o mayor (Figura 4D). Consistente con esto, las dosis 5-aza-CDR que resultan en re-expresión de la proteína GSTP1 también inducen la muerte celular significativa en células LNCaP (Figura 2B y 2F).
Zebularina inhibe la proliferación de células de cáncer de próstata, pero tiene efectos limitados sobre la muerte celular
células LNCaP se trataron con Zebularina (0-1000 M; la dosis más alta utilizada en estudios previos [30]), mientras que las células PC3 se trataron con dosis zebularine de hasta 400 mM. Zebularine se le dio en el día 0 y se repone de nuevo a la mitad del período de tratamiento. Zebularina causó una inhibición dependiente de la dosis de la proliferación tanto en las células de cáncer de próstata PC3 (Figura 5A y 5C, p & lt; 0,0001) LNCaP y, lo que sugiere que Zebularina tiene un mecanismo inhibidor del crecimiento AR-independiente similar de acción sobre las células de cáncer de próstata como 5-aza -cdr. Se observó una reducción significativa en el número de células viables con 100 a 200 mM Zebularina, y se observó inhibición completa de la proliferación celular en 400 mM o mayor, tanto en las células PC3 (Figura 5A y 5C, P & lt; 0,0001) LNCaP y. Considerando Zebularina no inducir la muerte celular en cualquier dosis en las células LNCaP (Figura 5B), la muerte celular significativa fue inducida por 400 mM Zebularina en células PC3 (Figura 5D, p = 0,0004).
(AB) y LNCaP (C-D) células de cáncer de próstata PC3 (1 × 10
4 células por pocillo en placas de 12 pocillos) fueron tratados con dosis crecientes de Zebularina (0-400 m, hasta 1000 M para las células LNCaP) se repone una vez en día 4 por un período de 6 días para células PC3, y 8 días para las células LNCaP. (A) y las células (C) se contaron a intervalos regulares usando un hemocitómetro y la viabilidad celular se evaluó mediante exclusión con azul de Trypan colorante. (B) y (D) el número de células muertas se expresa como un porcentaje del número total de células contadas. Los datos en cada punto de tiempo representa la media +/- SE de pocillos por triplicado. * ANOVA de una vía; p & lt; 0,0001 para (A) y (C); p = 0.0004 para (D) en comparación con el control del vehículo (veh).
Zebularina tiene acciones demetilantes más débiles en el
GSTP1 promotor
comparación con el 5-aza-CDR
para investigar la actividad de desmetilación de Zebularina, MSP se realizó para examinar el estado de metilación del ADN de la
GSTP1
promotor en células LNCaP (Figura 6A). Después de 8 días de tratamiento, metilado
GSTP1
estaba presente en el control del vehículo y todo Zebularina muestras tratadas (0-400 mM), mientras que la desmetilación de la
GSTP1
promotor carecían de dependencia de la dosis (Figura 6A). Cuando el estado de metilación de ADN relativo de la
GSTP1
región promotora en estas células LNCaP tratadas con Zebularina se compararon mediante el uso de COBRA BstUI y HhaI la digestión con enzimas de restricción, no metilado
GSTP1
se detectó (Figura 6B ). Las acciones demetilantes débiles e inconsistentes de Zebularina sobre las células LNCaP se reflejó también en la falta de proteínas GSTP1 re-expresión después de 8 días de tratamiento (Figura 6C).
ADN y las proteínas se extraen de las células LNCaP después de 8 días de tratamiento con dosis crecientes de Zebularina (0-400 mM). (A) El ADN fue modificado y bisulfito-MSP se realizó con cebadores de orientación modificado con bisulfito metiladas
GSTP1
o no metilado
GSTP1
. (B) El estado de metilación de ADN relativo de la
GSTP1 promotor
después del tratamiento se evaluó por Zebularina COBRA usando dos enzimas de restricción, BstUI o HhaI. (C) inmunotransferencia se realizó para analizar la expresión de proteína GSTP1 en células LNCaP después de 8 días de tratamiento Zebularina. Las proteínas se extrajeron a partir de células LNCaP tratadas con dosis crecientes de Zebularina (0-400 mM). células PC3 expresar la proteína endógena GSTP1 y se utilizaron como control positivo.
Discusión
Mientras que el DNMTi 5-aza-CDR es eficaz en el tratamiento de enfermedades hematológicas, pruebas clínicas en forma sólida tumores y el cáncer de próstata han demostrado una eficacia limitada o nula. El fracaso de los ensayos clínicos previos en tumores sólidos se ha atribuido a regímenes de dosis inapropiadas, lo que conduce a los eventos adversos relacionados con la toxicidad. En parte, esto se debe a una mala comprensión de las acciones mecanicistas de 5-aza-CDR en tumores sólidos. En este estudio, hemos demostrado que el 5-aza-CDR, a una dosis de 0,5 M administra diariamente, inhibe la proliferación celular inducida por completo y la muerte celular en células de cáncer de próstata, y se asoció con la desmetilación de la
GSTP1 promotor
y re-expresión de la proteína GSTP1. Estos hallazgos sugieren que una dosis baja de régimen de tratamiento 5-aza-CDR diaria puede ser más eficaz que un horario de dosis alta menos frecuentes o único para el control del crecimiento de células de cáncer de próstata. También hemos demostrado que una dosis baja diaria régimen de tratamiento 5-aza-CDR es más eficaz que uno usando el más estable DNMTi, Zebularina. Lo más importante, aportar pruebas de que el aumento de la potencia de la 5-aza-CDR en comparación con Zebularina en células de cáncer de próstata está estrechamente relacionada con su actividad de desmetilación e identificó
GSTP1
como biomarcador potencialmente útil para evaluar la eficacia DNMTi en la próstata cáncer.
varios estudios han demostrado que la 5-aza-CDR reduce la proliferación celular e induce la re-expresión de genes específicos en varios tipos de cáncer (Tabla S1). Los diferentes tipos de cáncer responden a 5-aza-CDR diferente, pero una amplia gama de dosis 5-aza-CDR y los regímenes de tratamiento se han utilizado en estudios previos, y los puntos finales y el análisis eran diferentes en los diferentes estudios. Nueve estudios publicados han investigado los efectos de 5-aza-CDR sobre la viabilidad de líneas celulares de cáncer de próstata (Tabla S1A) [10], [11], [31], [32], [33], [34], [ ,,,0],35], [36], [37]. Las comparaciones entre estos estudios son difíciles debido a las razones mencionadas anteriormente. Por ejemplo, Walton et al [11] informaron de la inhibición de aproximadamente el 30% de la proliferación celular en comparación con el control del vehículo en las células de cáncer de próstata LNCaP después del tratamiento con 8,8 M 5-aza-CDR, mientras que Pulukuri et al [10] informaron de% de inhibición de 70 la proliferación celular en comparación con el control del vehículo en la misma línea celular con una alta dosis de tratamiento 10 M 5-aza-CDR.