Extracto
Antecedentes
β-lapachona (β-lap), se ha sabido para causar la muerte NQO1-dependnet en las células cancerosas y sensibilizar a las células cancerosas a la radiación ionizante (IR). Se investigaron los mecanismos subyacentes a la radiosensibilización causado por β-lap
Metodología /Principales conclusiones
β-lap aumentó el efecto del IR para hacer que las células clonogénico en NQO1
+ -. MDA- MB-231 células, pero no en NQO1
- MDA-MB-231 células. β-lap causó la apoptosis sólo en NQO1
+ células y no en NQO1
- células y aumentó notablemente la apoptosis inducida por IR sólo en NQO1
+ células. El tratamiento combinado de NQO1 la generación de ROS
+ células inducida, provocada estrés ER y estimula la activación de ERK y JNK. La inhibición de la generación de ROS por NAC atenúa eficazmente la activación de ERK y JNK, la inducción de estrés ER, y la posterior apoptosis. Es importante destacar que, la inhibición de ERK abolió la generación de ROS y el estrés ER, mientras que la inhibición de JNK no lo hizo, lo que indica que la regulación de retroalimentación positiva entre la activación de ERK y la generación de ROS activa estrés ER en respuesta al tratamiento combinado. Por otra parte, la prevención de estrés ER completamente bloqueado inducida por el tratamiento de combinación activación de JNK y posterior muerte celular por apoptosis. Además, el tratamiento combinado indujo eficazmente la translocación mitocondrial de Bax escindido, interrumpido potencial de membrana mitocondrial, y la translocación nuclear de AIF, todos los cuales fueron bloqueados de manera eficiente por un inhibidor de JNK. Las caspasas 3, 8 y 9 fueron activados por el tratamiento combinado, pero la inhibición de estas caspasas no abolió la apoptosis indica la activación de la caspasa jugaron un papel menor en la inducción de la apoptosis.
Conclusiones /Importancia
β- regazo causa radiosensibilización NQO1 dependiente de las células cancerosas. Cuando NQO1
+ células son tratadas con la combinación de IR y β-lap, regulación de la retroalimentación positiva entre ERK y ROS conduce a estrés ER provocando la activación de JNK y la translocación mitocondrial de Bax escindido. La disminución resultante de la membrana mitocondrial conduce a la translocación de la AIF y la apoptosis
Visto:. Parque M-T, Song M-J, Lee H, OH E-T, Choi B-H, Jeong S-Y, et al. (2011) β-lapachona Aumenta significativamente el efecto de la radiación ionizante para causar mitocondrial de apoptosis a través de la activación de JNK en células de cáncer. PLoS ONE 6 (10): e25976. doi: 10.1371 /journal.pone.0025976
Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de junio de 2011; Aceptado: September 14, 2011; Publicado: 6 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Park et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Corea Salud 21 R & amp; D Proyecto (A062254), el programa de investigación y desarrollo nuclear de la Fundación Coreana de Ciencia e Ingeniería (2009 a 0093747), y por la beca de la Fundación Nacional de investigación de Corea financiado por el gobierno de Corea (MEST) (desde 2011 hasta 0.018.954). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
β-lapachona (β-lap) es un agente biorreductor que se ha demostrado que poseen una fuerte actividad anticancerígena tanto
in vitro en
y
in vivo
[1] - [3]. La actividad anti-cáncer de β-lap se ha demostrado que se debe a la reducción de dos electrones de β-vuelta mediada por NAD (P) H: quinona oxidoreductasa (NQO1, DT-diaforasa) usando NADH o NAD (P) H como fuentes de electrones [1] - [3]. Debido NQO1 se expresa más abundantemente en una variedad de cánceres sólidos humanos que en los tejidos normales [1] - [3], β-vuelta puede matar selectivamente las células de cáncer humano. β-vuelta también se ha demostrado que sensibilizar a las células cancerosas a la radiación ionizante (IR) [4]. Sin embargo, la precisión que subyace a este mecanismo radiosensitivas aún no se ha dilucidado.
bicicleta inútil entre las formas oxidada y reducida de β-lap se ha demostrado que causa el agotamiento progresivo de NADH y NAD (P) H, que, a su vez induce la liberación masiva de Ca
2 + del retículo endoplasmático (ER) en el citosol, lo que lleva a la activación de la Ca
2 + -dependiente de la proteinasa, calpaína y posterior muerte celular por apoptosis [1], [2 ], [5]. Por otra parte, el ciclo redox causado por un electrón reducida β-vuelta (es decir, la forma semiquinona de β-vuelta), el intermedio entre los dos electrones β-regazo y la forma oxidada de β-lap puede desencadenar la activación de las vías de muerte celular [1]. Estudios recientes sugieren que la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) por diversos estímulos de muerte celular no sólo iniciar cascadas de señales de muerte celular, sino también llevar directamente al daño del ADN [6] - [10]. Sin embargo, las vías de señalización activadas por ROS en las células tratadas con β-vuelta aún no han sido claramente delineada.
A pesar de β-lap se demostró para activar las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) en las células cancerosas, y por lo tanto inducen la muerte apoptótica [11], las vías de señalización implicadas en la activación de las MAPK causadas por β-vuelta, y el papel preciso de la activación de MAPK en la apoptosis β-inducida por la vuelta no se han aclarado.
el celular mitocondrial vía de la muerte está regulada por la relación de pro- a las proteínas anti-apoptóticas, incluyendo miembros de la familia Bcl-2. Entre estos miembros de la familia, Bax o Bak juega un papel clave en la pérdida de potencial transmembrana mitocondrial [12]. A la entrega de un estímulo apoptótico, citosólica Bax se transloca a la membrana mitocondrial externa, donde se oligomeriza para formar homodímeros, la creación de poros que aceleran la liberación de citocromo
c
, factor inductor de apoptosis (AIF), y endonucleasa G (Endo G) desde el espacio intermembrana de la mitocondria en el citosol [7].
En este estudio, se investigó el mecanismo por el cual β-vuelta modula la respuesta de las células de cáncer de mama a la radiación. Se demuestra aquí que el tratamiento combinado de IR y β-vuelta aumenta sinérgicamente clonogénico y la muerte celular por apoptosis de una manera dependiente de NQO1. También muestran que la generación de ROS, la inducción de estrés ER, y la activación de la quinasa extracelular regulada (ERK) y c-Jun N-terminal quinasa (JNK) por el tratamiento combinado son cruciales para la muerte celular apoptótica mitocondrial. Específicamente, llegamos a la conclusión de que se necesita la formación de un bucle de realimentación positiva entre la activación de ERK y la generación de ROS para el estrés ER inducida por el tratamiento combinado, que conduce a la activación de JNK y la posterior muerte celular apoptótica mitocondrial. Nuestros datos proporcionan un mecanismo potencial para tener en cuenta el efecto radiosensibilizador de β-lap y conocimientos obtenidos en el presente estudio conducirán a los avances en la aplicación clínica de tratamiento combinado con IR y β-vuelta en terapias basadas en el tumor NQO1 dirigida focalización .
resultados
el tratamiento combinado con IR y β-lap aumenta clonogénico y la muerte celular por apoptosis en una NQO1 forma dependiente
Para determinar el efecto de β-vuelta en clonogénico la supervivencia celular, se trata de los padres NQO1
- MDA-MB-231 células deficientes en NQO1 o NQO1
+ - MDA-MB-231 células que poseen abundante expresión de NQO1, con diferentes dosis de β-vuelta. Como se muestra en la Figura 1A, un aumento dependiente de la dosis en la muerte de células clonogénicas después del tratamiento β-vuelta era evidente en NQO1
+ - MDA-MB-231 células, pero no en NQO1 parental
- MDA-MB-231 las células, lo que indica NQO1 juega un papel crucial para la muerte celular inducida por β-lap
(a) NQO1
-. NQO1 o
+ - células MDA-MB-231 fueron tratados con diferentes concentraciones de β-vuelta. Las células se dejaron crecer durante 10 a 14 días y se tiñeron con 0,5% de cristal violeta y se puntuaron para la formación de colonias. Los resultados de tres experimentos independientes se expresan como medias ± SEM. * Diferencia significativa entre NQO1
- y NQO1
+ - MDA-MB-231 células después del tratamiento con β-vuelta en p & lt; 0,05. (B) Las células fueron tratadas con 2 mM β-vuelta y luego expuestos a dosis crecientes de IR 30 min después del tratamiento con β-regazo. Después de 14 días, se puntuaron las células para la formación de colonias. Los resultados de tres experimentos independientes se expresan como media ± SEM. (C) Las células fueron tratadas con IR solo, β-lap solo o la combinación de IR y β-regazo durante los tiempos indicados. El porcentaje de células con contenido de ADN sub-G1 se determinó por citometría de flujo. Los resultados de tres experimentos independientes se expresan como medias ± SEM
Se analizó el efecto de la β-vuelta sobre la muerte clonogénico IR inducida de NQO1
-. MDA-MB-231 y NQO1
+ - MDA-MB-231 células. Las células fueron expuestas a diferentes dosis de IR en la presencia o ausencia de 2 mM β-regazo y la supervivencia clonogénico se determinó como se muestra en la Fig. 1B. Las curvas de supervivencia de radiación para el tratamiento combinado se normalizaron por la muerte de β-vuelta solo. La curva de supervivencia de radiación para el tratamiento combinado con IR y β-vuelta fue idéntico en NQO1
+ - MDA-MB-231 células. Por otro lado, la curva de supervivencia de radiación para el tratamiento combinado de NQO1
+ - MDA-MB-231 células fue significativamente más pronunciada en particular a las dosis de radiación más bajas que para el tratamiento IR solo resulta en disminución significativa en el hombro de la supervivencia curva. La reducción del hombro indicó que β-lap inhibe la reparación del daño por radiación subletal en NQO1
+ células pero no en NQO1
-.
Células
Se investigó el efecto combinado de IR y β-lap sobre la muerte celular por apoptosis en NQO1
- MDA-MB-231 y NQO1
+ - MDA-MB-231 células. Las células fueron tratadas con 10 Gy de IR por sí solo, se evaluó 2 mM β-vuelta solo, o combinación de IR y β-vuelta para diferentes longitudes de tiempo, y la muerte celular apoptótica. Mientras que la apoptosis de NQO1
+ - células MDA-MB-231 inducida por la IR sola era aproximadamente 13 y 14% a las 24 y 48 h, respectivamente, β-vuelta apoptosis solo inducida en aproximadamente 18 y 40% de las células en 24 y 48 h, respectivamente (Fig. 1C). El tratamiento combinado con IR y β-lap aumentó notablemente la muerte celular por apoptosis en NQO1
+ - MDA-MB-231 células; sobre 58 y 87% de las células fueron apoptóticas a las 24 y 48 h, respectivamente. Por el contrario, en NQO1
- 231 células MDA-MB-, sin la apoptosis significativa se produjo después de tratar con infrarrojos o β-lap solo o incluso con combinación de IR y β-lap, muy probablemente debido a la deficiencia de NQO1 y una forma mutante de p53 expresada en NQO1
-. células [13]
El tratamiento combinado con IR y β-lap 231 MDA-MB-induce marcadamente la generación de ROS en NQO1
+ - MDA-MB -231 células
Hemos investigado la implicación de los ROS en la muerte celular por apoptosis inducida por el tratamiento combinado en NQO1
- MDA-MB-231 y NQO1
+ - MDA-MB-231 células. Primero mide ROS tinción con DCF. En comparación con el tratamiento individual con IR o β-vuelta, el tratamiento combinado causó mucho más aumento de los niveles de ROS por 3 h en NQO1
+ - células MDA-MB-231, pero no en NQO1
- MDA-MB-231 (Fig. 2A). Además, confirmó la generación de ROS por el tratamiento combinado con IR y β-vuelta, utilizando otro tinte ROS detección, dihydroethidium (DHE). Como se muestra en la Figura 2B, se observó marcado incremento en la generación de ROS en NQO1
+ - células MDA-MB-231, pero no en NQO1
- MDA-MB-231 células después del tratamiento combinado con IR y β-lap . Para determinar si el aumento de los niveles de ROS intracelulares estaba directamente relacionado con la muerte celular por apoptosis, pretratados NQO1
+ - MDA-MB-231 células con el antioxidante NAC antes de exponer las células a IR y β-vuelta. Como se muestra en la Figura 2C, el pretratamiento con NAC redujo significativamente la muerte celular por apoptosis causada por el tratamiento combinado con IR y β-regazo. Por otra parte, el pretratamiento con NAC atenúa eficazmente la muerte celular clonogénico causada por el tratamiento combinado con IR y β-vuelta (Fig. 2D). Estas observaciones sugieren que la inducción de ROS contribuye críticamente a la muerte celular por apoptosis y clonogénico causada por el tratamiento combinado con IR y β-vuelta en NQO1
+ -. MDA-MB-231 células
(A) y (B) las células fueron tratadas con IR solo, β-lap solo o combinación de IR y β-regazo durante los tiempos indicados. Después de 3 h, las células se incubaron con 10 mM H2DCF-DA y 4 M DHE, respectivamente, para 30 min y luego se analizaron por citometría de flujo. Los resultados de tres experimentos independientes se expresan como media ± SEM. (C) NQO1
+ - células MDA-MB-231 fueron tratados con IR solo, β-lap solo o combinación de IR y β-regazo durante 24 horas en la presencia o ausencia de NAC (10 mM). Después de 24 h, el porcentaje de células con contenido de ADN sub-G1 se determinó por citometría de flujo. Los resultados de tres experimentos independientes se expresan como media ± SEM. (D) NQO1
+ - células MDA-MB-231 fueron tratados con la combinación de IR (2 Gy) y β-lap (2 M) en presencia o ausencia de NAC (10 mM). Las células se dejaron crecer durante 10 a 14 días y se tiñeron con 0,5% de cristal violeta y se puntuaron para la formación de colonias. Los resultados de tres experimentos independientes se expresan como medias ± SEM. * Diferencia significativa entre las células en presencia o ausencia de NAC después del tratamiento combinado con IR y β-lap, p. & Lt; 0,05
β-lap en combinación con IR activa rápidamente ERK y JNK, lo que lleva apoptótica de la muerte celular
para revelar la posible participación de MAPK en la muerte celular por apoptosis causada por el tratamiento combinado con IR y β-vuelta, se estudiaron los niveles de las formas activadas de las MAPK en NQO1
- MDA-MB-231 y NQO1
+ - MDA-MB-231 células por análisis de transferencia de Western usando anticuerpos anti-fosfo. Como se muestra en la Figura 3A, en NQO1
- MDA-MB-231 células, IR solo ligeramente aumento de la fosforilación de ERK y JNK, mientras que β-lap solo causó pocos cambios en los niveles de fosforilados ERK y JNK. El efecto del tratamiento combinado fue similar a la de IR solo. La fosforilación de p38 MAPK en NQO1
- MDA-MB-231 células fue negativa, ya sea después de los tratamientos simples o combinadas con IR y β-vuelta. Sin embargo, en NQO
+ - MDA-MB-231 células, el tratamiento combinado llevó a una rápida regulación de ERK y JNK fosforilada en comparación con el tratamiento con IR solo o β-lap sola (Fig. 3A). la activación de ERK fue evidente en 0.5 h, y permaneció elevada durante 3 h después del tratamiento combinado. Además, la activación de JNK comenzó a aumentar dentro de 0,5 h, pero disminuyó 2 h después del tratamiento se combinan en NQO1
+ - MDA-MB-231 células. Los niveles celulares totales de ERK y JNK se mantuvieron constantes. IR tratamiento aumentó la fosforilación de p38 MAPK, mientras que el tratamiento β-lap no causó ningún cambio en la fosforilación de p38 MAPK. El nivel de fosforilación de MAPK p38 después del tratamiento combinado fue menor que después del tratamiento con IR por sí solo, lo que indica β-vuelta suprime la activación inducida por IR de MAPK p38 en NQO1
+ - MDA-MB-231 células (Fig. 3A). Para examinar la relación entre la activación de MAPK y la muerte celular apoptótica, pretratados NQO1
+ - MDA-MB-231 células con SP600125, PD98059, o SB203580, los inhibidores de JNK, MEK /ERK, y MAPK p38, respectivamente, antes del tratamiento con β-IR y vuelta. Como se muestra en la Figura 3B, PD98059 y SP600125 reducido efectivamente la muerte celular por apoptosis causada por el tratamiento combinado de 56% a 24% y 13%, respectivamente, mientras que SB203580 era ineficaz. Para investigar más a fondo la participación de ERK y JNK2 en la muerte celular por apoptosis causada por el tratamiento combinado con IR y β-lap, pretratados NQO1
+ - MDA-MB-231 células con siRNAs dirigidos ERK y JNK2. En consonancia con los resultados obtenidos con inhibidores farmacológicos, la inhibición específica de ERK y JNK2 con siRNAs casi completamente abolido la muerte celular por apoptosis causada por el tratamiento combinado (Fig. 3C). Estos resultados demuestran que ERK y JNK acto como mediadores importantes de la muerte celular apoptótica inducida por el tratamiento combinado con IR y β-vuelta en NQO1
+ -. MDA-MB-231 células
(A) NQO1
- o NQO1
+ - células MDA-MB-231 fueron tratados con IR solo, β-lap solo o combinación de IR y β-regazo durante los tiempos indicados. Los datos representan un experimento típico llevado a cabo tres veces con resultados similares. (B) y (C) NQO1
+ - células MDA-MB-231 fueron tratados con IR solos, β-lap solo o combinación de IR y β-regazo durante 24 horas en la presencia o ausencia de PD98059 (30 mM ), SP600125 (30 M), SB203580 (30 mM), o siRNA dirigidos ERK1 /2 o JNK2. El porcentaje de células con contenido de ADN sub-G1 se determinó por citometría de flujo. Los resultados de tres experimentos independientes se expresan como medias ± SEM.
regulación de la retroalimentación positiva entre ROS y ERK inducida por el tratamiento combinado con IR y β-vuelta es esencial para la activación de JNK
para determinar si la generación de ROS está implicado en la activación de ERK y JNK por el tratamiento combinado con IR y β-vuelta, pretratados NQO1
+ - MDA-MB-231 células con el antioxidante NAC antes del tratamiento con IR y β -regazo. Como se muestra en la figura 4A, la activación de ERK y JNK por el tratamiento combinado fue completamente bloqueado por el pretratamiento con NAC. A continuación examinó la contribución de ERK y JNK a la generación de ROS causado por el tratamiento combinado. Se han tratado NQO1
+ - MDA-MB-231 células con siRNAs dirigidos ERK y JNK2 antes del tratamiento con β-IR y vuelta. Como se muestra en la Figura 4B, siRNA mediada desmontables ERK bloqueado efectivamente la generación de ROS, tal como se determina con DCF, inducida por β-vuelta solo y en un grado aún mayor por el tratamiento combinado, mientras que siRNA dirigidos JNK2 no atenuar la generación de ROS.
(a) NQO1
+ - células MDA-MB-231 fueron tratados con IR solo, β-lap solo o combinación de IR y β-regazo durante 30 minutos en presencia o ausencia de NAC. Los datos representan un experimento típico llevado a cabo tres veces con resultados similares. (B) NQO1
+ - células MDA-MB-231 fueron tratados con IR solo, β-lap solo o combinación de IR y β-regazo durante 3 horas en presencia o ausencia de siRNA dirigidos a ERK1 /2 o JNK2. Después de 3 h, las células se incubaron con 10 mM H2DCF-DA durante 30 min y después se analizaron por citometría de flujo. Los resultados de tres experimentos independientes se expresan como media ± SEM. (C) NQO1
+ - células MDA-MB-231 fueron tratados con IR solo, β-lap solo o combinación de IR y β-regazo durante 30 minutos en presencia o ausencia de PD98059 o SP600125. . Los datos representan un experimento típico realizado tres veces con resultados similares
Para aclarar aún más la posibilidad de interferencia entre ERK y JNK, pretratados NQO1
+ - MDA-MB-231 células con PD98059 o SP600125. Como se muestra en la Figura 4C, la activación de ERK y JNK por el tratamiento combinado fue completamente abrogada por el pretratamiento con PD98059 y SP600125, respectivamente. Por otra parte, la activación de JNK inducida por tratamiento PD98059 combinación efectivamente bloqueado, mientras que SP600125 no atenúa la activación de ERK, lo que indica que ERK es un activador corriente arriba de JNK (Fig. 4C). Estos resultados indicaron que la β-lap en combinación con IR conduce a la regulación de la retroalimentación positiva entre ROS y la activación de ERK que pueden contribuir a la activación de JNK.
Es necesaria la generación de ROS inducida por el tratamiento combinado con IR y β-vuelta para el inducción de estrés ER
a continuación se investigó si el tratamiento combinado con IR y β-lap induce estrés ER en NQO1
+ - MDA-MB-231 células por medio de la fosforilación de eIF2α y picar expresión. Como se muestra en la Figura 5A, IR por sí sola no alteró los niveles de fosforilados eIF2α (p-eIF2α) y CHOP expresión, y β-lap solo aumentó ligeramente p-eIF2α y picar expresión. Sin embargo, el tratamiento combinado indujo notablemente p-eIF2α y aumentó CHOP nivel de expresión (Fig. 5A). Para examinar aún más la implicación del estrés ER en la muerte celular por apoptosis inducida por el tratamiento combinado con IR y β-lap, pretratados NQO1
+ - MDA-MB-231 células con salubrinal (Sal), un inhibidor de estrés ER. Como se muestra en la Figura 5B, inducida por tratamiento Sal combinación efectivamente suprimida la muerte celular apoptótica. Estos resultados indican que el estrés ER es un importante contribuyente a la muerte celular por apoptosis inducida por el tratamiento combinado en NQO1
+ -. MDA-MB-231 células
(A) NQO1
+ - MDA-MB -231 células fueron tratadas con IR solo, β-lap solo o combinación de IR y β-regazo durante los tiempos indicados. Los lisados celulares se sometieron a análisis de transferencia Western. Los datos representan un experimento típico llevado a cabo tres veces con resultados similares. (B) NQO1
+ - células MDA-MB-231 fueron tratados con IR solo, β-lap solo o combinación de IR y β-regazo durante 24 horas en la presencia o ausencia de Sal (10 mM). Después de 24 h, el porcentaje de células con contenido de ADN sub-G1 se determinó por citometría de flujo. Los resultados de tres experimentos independientes se expresan como media ± SEM. (C) NQO1
+ - células MDA-MB-231 fueron tratados con IR solo β-vuelta solo o combinación de IR y β-vuelta por 3 h en presencia o ausencia de Sal (10 M). Después de 3 h, las células se incubaron con 10 mM H2DCF-DA durante 30 min y después se analizaron por citometría de flujo. Los resultados de tres experimentos independientes se expresan como media ± SEM. (D) NQO1
+ - células MDA-MB-231 fueron tratados con IR solo, β-lap solo o combinación de IR y β-regazo durante 30 minutos en presencia o ausencia de NAC. Los datos representan un experimento típico llevado a cabo tres veces con resultados similares. (E) y (F) NQO1
+ - células MDA-MB-231 fueron tratados con IR solo, β-lap solo o combinación de IR y β-regazo durante 30 minutos en presencia o ausencia de Sal, SP600125 o PD98059. Los datos representan un experimento típico realizado tres veces con resultados similares
A continuación se investigó la relación entre la generación de ROS y estrés ER en NQO1
+ -. MDA-MB-231 células tratadas con la combinación de IR y β-vuelta. Como se muestra en la Figura 5C, el tratamiento previo con Sal no atenuar la generación de ROS causada por el tratamiento combinado, mientras que el pretratamiento con NAC evita eficazmente la fosforilación de eIF2α (Fig. 5D), indicando que se requiere la generación de ROS inducida por el tratamiento combinado para la inducción de estrés ER.
ER estrés inducido por el tratamiento combinado con IR y β-vuelta es necesaria para la activación de JNK
para analizar la relación entre el estrés ER y MAPK (ERK y JNK), que examinado primero el efecto de la Sal de la activación de ERK y JNK. Como se muestra en la Figura 5E, el pretratamiento con Sal suprime eficazmente la activación de JNK inducida por el tratamiento combinado, pero no atenúa la activación de ERK. Para establecer la función crítica de las MAPK en la inducción de estrés ER, pretratados NQO1
+ - MDA-MB-231 células con PD98059 o SP600125. Como se muestra en la figura 5F, la fosforilación inducida por el tratamiento combinado de eIF2α fue completamente bloqueado por PD98059, pero no por SP600125. Estos resultados indican que ERK es un activador ascendente de estrés ER responsable de la activación de JNK en respuesta al tratamiento combinado con IR y β-vuelta.
El tratamiento combinado con IR y β-lap induce la muerte celular por apoptosis a través de la translocación nuclear FIA de
Debido a la activación de la caspasa es un mecanismo importante para la inducción de muerte celular por apoptosis [14], se determinó la implicación de las caspasas en la apoptosis respuesta al tratamiento combinado de NQO1
+ - MDA-MB -231 células con β-IR y vuelta. Como se muestra en la Figura 6A, el tratamiento combinado dio lugar a activaciones de la caspasa-8, -9 y -3. Tenga en cuenta que la activación de la caspasa 9 y 3 se produjo antes de la activación de la caspasa 8. IR o β-vuelta solo no causó activaciones evidentes de estas caspasas. El citocromo c liberado de las mitocondrias se ha descrito la formación de un complejo con la procaspasa-9 y apoptosis de la proteasa activadora del factor-1 (Apaf-1), lo que resulta en la activación de la procaspasa-9 [14]. Por lo tanto, a fin de determinar si el tratamiento combinado con IR y β-lap induce la liberación de citocromo c de la mitocondria al citosol. Como se muestra en la Figura 6B, el tratamiento combinado eleva eficazmente el nivel de citocromo c dentro de la fracción citosólica por 12 h, mientras que IR o β-vuelta por sí sola no lo hizo. A continuación, estudiamos el requisito de la caspasa de la apoptosis inducida por el tratamiento combinado utilizando un amplio espectro inhibidor de la caspasa, z-VAD-fmk. La Figura 6C muestra que z-VAD-fmk impidió eficazmente la activación de las caspasas causados por el tratamiento combinado. Sorprendentemente, sin embargo, z-VAD-fmk reduce sólo parcialmente la muerte celular apoptótica inducida por el tratamiento combinado de aproximadamente 51% a 42% (Fig. 6D). Estos resultados indican que la muerte celular por apoptosis causada por el tratamiento combinado con IR y β-vuelta se produce, a pesar de la activación de las caspasas se inhibe
(A) NQO1
+ -. Células MDA-MB-231 eran tratados con IR solo, β-lap solo o combinación de IR y β-regazo durante los tiempos indicados. Los datos representan un experimento típico llevado a cabo tres veces con resultados similares. (B) NQO1
+ - células MDA-MB-231 fueron tratados con IR solo, β-lap solo o combinación de IR y β-regazo durante 12 h. fracciones citosólicas de NQO1
+ - se prepararon y se sometieron a análisis de transferencia Western MDA-MB-231 células. Los datos son representativos de un experimento típico llevado a cabo tres veces. Los datos representan un experimento típico llevado a cabo tres veces con resultados similares. (C) NQO1
+ - células MDA-MB-231 fueron tratados con la combinación de IR y β-vuelta durante 12 h en presencia o ausencia de z-VAD-fmk. Los datos representan un experimento típico llevado a cabo tres veces con resultados similares. (D) NQO1
+ - células MDA-MB-231 fueron tratados con IR solo, β-lap solo o combinación de IR y β-regazo durante 24 horas en la presencia o ausencia de z-VAD-FMK (30 mM ). Después de 24 h, el porcentaje de las células con contenido de ADN sub-G1 se determinó por citometría de flujo. Los resultados de tres experimentos independientes se expresan como media ± SEM. (E) NQO1
+ - células MDA-MB-231 fueron tratados con IR solo, β-lap solo o combinación de IR y β-regazo durante 24 h. fracciones nucleares de NQO1
+ - se prepararon y se sometieron a análisis de transferencia Western MDA-MB-231 células. Los datos son representativos de un experimento típico llevado a cabo tres veces. (F) NQO1
+ - células MDA-MB-231 fueron tratados con IR solo, β-lap solo o combinación de IR y β-regazo durante 24 horas en la presencia o ausencia de siRNA dirigidos FIA. Después de 24 h, el porcentaje de las células con contenido de ADN sub-G1 se determinó por citometría de flujo. Los resultados de tres experimentos independientes se expresan como media ± SEM. (G) NQO1
+ - células MDA-MB-231 fueron tratados con la combinación de IR y β-regazo durante 24 horas en la presencia o ausencia de NAC, PD98059, Sal o SP600125. fracciones nucleares se prepararon y se sometieron a análisis de transferencia Western. Los datos son representativos de un experimento típico llevó a cabo tres veces.
Debido FIA, un flavoproteına mitocondrias-localizada, es conocido por estar involucrados en la inducción de muerte celular por apoptosis independiente de caspasas [7], el próximo investigó si AIF juega un papel en la inducción de muerte celular por el tratamiento combinado con IR y β-regazo. AIF es liberado de las mitocondrias en respuesta a estímulos de muerte celular, posteriormente se transloca al núcleo, donde causa la fragmentación del ADN [7]. Fraccionamiento subcelular mostró que el tratamiento combinado indujo dramáticamente la translocación nuclear de AIF, mientras que el IR o β-vuelta solo causaron un pequeño aumento en AIF en el núcleo (Fig. 6E). Por otra parte, siRNA mediada por AIF desmontables muerte celular por apoptosis inducida por el tratamiento de combinación redujo efectivamente de 55% a casi niveles de control (Fig. 6F). Estos resultados sugieren que se requiere la translocación nuclear de la FIA para la inducción de muerte celular por apoptosis mediante el tratamiento combinado con IR y β-vuelta.
Para definir mejor el papel de los ROS, ERK, JNK estrés ER y en la translocación nuclear de la FIA a tratamiento combinado con IR y β-lap, pretratados NQO1
+ - MDA-MB-231 células con los inhibidores correspondientes, NAC, PD98059, Sal o SP600125, y examinar la localización subcelular de la FIA. Como se muestra en la Figura 6G, la translocación nuclear de AIF inducida por el tratamiento combinado fue completamente bloqueado por el tratamiento previo con NAC, PD98059, Sal o SP600125. Estos resultados muestran que las ROS, ERK, JNK y estrés ER son activadores aguas arriba de la muerte celular mediada por la FIA inducidos por el tratamiento combinado con IR y β-vuelta.
El tratamiento combinado con IR y β-lap induce la translocación mitocondrial de escindido Bax y la interrupción del potencial de membrana mitocondrial
Para determinar el papel de la vía mitocondrial de la apoptosis inducida por el tratamiento combinado en NQO1
+ - células MDA-MB-231, lo primero que examinó los cambios en Bcl-2 y los niveles de expresión de Bax, y el potencial de membrana mitocondrial. Como se muestra en la Figura 7A, los niveles de Bax se redujeron marcadamente en respuesta al tratamiento combinado con IR y β-vuelta, pero no en respuesta a un tratamiento individual con IR o β-regazo. Los niveles de expresión de Bcl-2 se mantuvieron sin cambios por el tratamiento individual o combinada. Se ha informado de que Bax se escinde de una forma nativa de 21 kDa a un fragmento de 18 kDa en respuesta a estímulos de muerte [15], [16]. Debido a la translocación de 18 kDa escindida Bax desde el citosol a las mitocondrias se ha informado de inducir una disminución de la transmembrana mitocondrial potencial liberación y posterior de las proteínas proapoptogenic de la mitocondria [15], [16], se investigó si el tratamiento combinado induce la translocación mitocondrial de escinde Bax . Como se muestra en la figura 7B y C, el tratamiento combinado con IR y β-vuelta aumentado más efectivamente los niveles de 18 kDa escinden Bax dentro de la fracción mitocondrial de tratamiento individual con IR o β-regazo. Sin embargo, 18 kDa forma de Bax fue indetectable en lisados de células enteras después del tratamiento combinado (Fig. 7C). Debido a que una proteasa catepsina-como se ha sugerido que participan en la rápida degradación de 18 kDa forma de Bax en el citosol [17], pretratados células con el MG132 inhibidor de la proteasa saber por qué escindido Bax estaba ausente en lisado de células enteras después combinado el tratamiento con β-IR y vuelta. Como se muestra en la Figura 7D, cuando las células fueron tratadas con la combinación de IR y β-vuelta en presencia de MG132, se escindió Bax se detectó en lisado de células enteras, lo que indica que escinde Bax se degrada fácilmente en el citosol después del tratamiento combinado con IR y β -regazo. Por lo tanto, la forma de 18 kDa de Bax puede ser inestable en el citosol, pero estable en la fracción mitocondrial tras el tratamiento combinado con IR y β-regazo. Además, como se muestra en la Figura 7E, el tratamiento combinado interrumpido significativamente el potencial transmembrana mitocondrial de una manera dependiente del tiempo, coincidiendo con los cambios observados en los niveles de Bax. . En conjunto, estos resultados demuestran que la muerte celular inducida por el tratamiento combinado implica una alteración en el potencial transmembrana mitocondrial mediada por la redistribución intracelular de Bax escindido
(A) NQO1
+ - células MDA-MB-231 eran tratados con IR solo, β-lap solo o combinación de IR y β-regazo durante los tiempos indicados. Los lisados celulares se sometieron a análisis de transferencia Western. Los datos representan un experimento típico llevado a cabo tres veces con resultados similares.