Extracto
La alta tasa de mortalidad por cáncer de ovario pueden atribuirse al diagnóstico de la última etapa y la falta de un tratamiento eficaz. A pesar de enormes esfuerzos para desarrollar terapias mejor orientados, quimioterapia basada en platino sigue siendo el estándar de cuidado para los pacientes con cáncer de ovario, y la resistencia se produce a un ritmo elevado. Uno de los factores que limita la tasa de traducción de descubrimiento de nuevos medicamentos en tratamientos clínicos ha sido la falta de modelos preclínicos de cáncer adecuados con un alto valor predictivo. Hemos generado previamente ratón genéticamente modificado (GEM) modelos basados en la perturbación de
Tp53
y
Rb
con o sin
BRCA1
o
BRCA2 Windows que desarrollan serosa cáncer de ovario epitelial (SEOC) se parece mucho a la enfermedad humana sobre histológico y los niveles moleculares. A continuación, describimos una adaptación de estos modelos GEM de aloinjertos ortotópico que desarrollan tumores uniformemente con una latencia corta y son ideales para los estudios preclínicos de rutina. Los tumores de ovario deficientes en
BRCA1
responden al tratamiento con cisplatino y olaparib, un inhibidor de PARP, mientras que
BRCA1
tumores de tipo salvajes son que no responde al tratamiento, recapitulando las sensibilidades relativas observadas en los pacientes. Estos modelos de ratón proporcionan la oportunidad para la evaluación de terapias efectivas, incluyendo la predicción de respuestas diferenciales en
BRCA1
tipo -wild y
BRCA1
tumores y desarrollo de biomarcadores relevantes.
Deficientes
Visto: Szabová L, Bupp S, M Kamal, de Hogar de DB, Hernández L, Schlomer JJ, et al. (2014) Camino específicos de modelos de aloinjertos de ratón Engineered Funcionalmente recapitular serosa humana cáncer ovárico epitelial. PLoS ONE 9 (4): e95649. doi: 10.1371 /journal.pone.0095649
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón
Recibido: 10 Febrero, 2014; Aceptado: March 28, 2014; Publicado: 18 de abril 2014
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este proyecto ha sido financiado en su totalidad con fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud, con el número de contrato HHSN261200800001E. El contenido de esta publicación no refleja necesariamente los puntos de vista o las políticas del Departamento de Salud y Servicios Humanos, ni la mención de nombres comerciales, productos comerciales u organizaciones no implica reconocimiento alguno por parte del Gobierno EE.UU.. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es el segundo cáncer ginecológico más frecuente y la causa más frecuente de muertes relacionadas con el cáncer ginecológico en los EE.UU. [1], con más del 50% de presentar cáncer de ovario epitelial como serosa (SEOC). La mayoría de SEOCs avanzadas se han extendido más allá del ovario en el momento del diagnóstico, y su gestión implica quirúrgica de-aumento de volumen, seguida de quimioterapia con una combinación de platino y taxanos drogas [2], [3]. A pesar de las tasas de respuesta inicialmente elevados, la mayoría de los pacientes recaen con una supervivencia media libre de progresión de 18 meses [4], por lo que la búsqueda de nuevas terapias imperativas.
En los últimos años se ha avanzado mucho en la identificación de sello lesiones genéticas asociadas con SEOC. El estudio del Genoma del Cáncer Atlas (TCGA) de una gran cohorte SEOC alto grado reveló que las mutaciones en
TP53
predominaban, se producen en al menos el 96% de los tumores [5]. Se han observado alteraciones en la red RB en el 67% de los casos, y alrededor del 20% de los tumores tenían línea germinal o mutaciones somáticas en
BRCA1 /2
con un 11% adicional de haber perdido la expresión de los genes BRCA1 través de silenciamiento epigenético [5] .
BRCA1 y BRCA2 juego un papel importante en la recombinación homóloga (HR), y la pérdida de cualquiera de las proteínas conduce a la deficiencia en la doble ruptura cadena de ADN (DSB) reparar [6]. En las células de recursos humanos deficientes, DSBs se reparan por mecanismos propensos a errores, que puede conducir a la inestabilidad genómica. La inhibición química de cadena simple (ss) de ADN romper la reparación de las células de recursos humanos con deficiencia puede conducir a la letalidad sintética debido a la ausencia simultánea de dos vías de reparación del ADN [7], [8]. En la clínica, poli (ADP) inhibidores de la polimerasa (-ribose PARPi) están experimentando evaluación como un método de explotación de letalidad sintética para la intervención terapéutica. Se requiere PARP-1 para la identificación de roturas de ssDNA (SSB) y el reclutamiento de proteínas de reparación en sitios dañados [9]. La inhibición de este proceso en las células deficientes en BRCA conduce a la acumulación de DSBs, debido a las horquillas de replicación colapsadas, y en última instancia a la muerte celular [10] - [12]. Sobre la base de estos hallazgos, PARPi han sido probados en ensayos clínicos como terapias solas o combinadas en pacientes con tumores sólidos avanzados [13] - [15]. Recientemente, el PARPi activo por vía oral, olaparib (AZD2281), mostró actividad antitumoral clínica en el cáncer de ovario y de mama BRCA-asociados [15] - [19].
Hasta el momento, los ensayos clínicos de nuevos agentes terapéuticos se han basado en estudios preclínicos realizados en líneas celulares y modelos de xenoinjerto de líneas celulares inmunocomprometidos. altas tasas de fracaso en posteriores ensayos en humanos sugieren la necesidad de modelos preclínicos con un mejor valor predictivo [20]. modelos de ingeniería genética de ratón (GEMM) tienen importantes ventajas sobre los modelos de xenoinjertos de líneas celulares, en que los tumores son accionados por eventos genéticos definidos y surgen debido a la acumulación de eventos estocásticos adicionales dentro del órgano de interés y son, por lo tanto, sujeto a microambiente relevante y el anfitrión de las respuestas de células. Varios GEMM cáncer epitelial de ovario que se desarrollan los tumores se asemejan a las enfermedades humanas se han reportado [21] - [25]; Sin embargo, estos modelos no han sido adaptados para el uso eficiente de los estudios preclínicos, y pocos recapitular toda la gama de características genéticas y biológicas de SEOC humano.
Anteriormente, se informó GEMM que desarrollan cáncer de ovario con la genética y biológica características de SEOCs humanos [26]. Dirigida al epitelio superficial del ovario, la derogación de la supresión de tumores RB (TS) inició la enfermedad, y
Tp53
aberración (mutación sin sentido o supresión) facilitó progresión de la enfermedad a la diseminación peritoneal y metástasis agresiva. Los tumores de ovario de estos modelos, incluidos los deficientes en cualquiera de
BRCA1
o
BRCA2
, representan los 4 subclases de la transcripción de SEOC humano. Aquí, utilizamos estos modelos para crear modelos de trasplante ortotópico inmunocompetentes, y para generar cohortes de ratones sincronizados adecuados para los estudios preclínicos. Para determinar si estos modelos son manejables para su uso en estudios de eficacia de rutina y si sus respuestas terapéuticas reflejan los resultados observados en los ensayos en humanos, se realizó un tratamiento único o combinado con quimioterapia de platino estándar y olaparib. Como se observa en los pacientes, la respuesta al tratamiento fue dependiente de
BRCA1
de estado, lo que demuestra la utilidad de estos modelos en la evaluación de la eficacia potencial de nuevas terapias para el cáncer de ovario.
Material y Métodos
animales de experimentación
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el protocolo de estudio en animales aprobado por el Comité de Cuidado y uso de animales institucional del Laboratorio Nacional de Frederick de Investigación del cáncer y los Institutos nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y uso Animales de laboratorio. FNLCR está acreditado por la AAALAC International y sigue la Política de Servicio de Salud Pública para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. cuidado de los animales se proporciona de acuerdo con los procedimientos descritos en la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" (National Research Council, 1996; National Academy Press, Washington, DC). Los animales se mantuvieron en una instalación de barrera en FNLCR bajo filtración HEPA en jaulas micro aislador y se alimentaron con la dieta para roedores de laboratorio en autoclave (LabDiet, St. Louis, MO). Todos los procedimientos con animales se realizaron bajo anestesia utilizando la inhalación de 1 a 2,5% de isoflurano. El criterio de valoración para los ratones fue el cambio en la salud en general, específicamente & gt; 20% de pérdida de peso corporal, si no puede comer, beber, o deambular, postura encorvada, dificultad para respirar o síntomas de hipotermia, así como signos de ascitis con distensión abdominal y el tumor palpable de aproximadamente 2 cm de tamaño. Los animales que exhiben signos clínicos, crecimiento de tumores sólidos de 2 cm, o se hizo moribundo antes de la expansión máxima de la ascitis (duplicación aproximada de la anchura del abdomen) se sometieron a eutanasia con prontitud por inhalación de CO2.
información detallada cepa de ratón y generación de adenovirally modelos SEOC inducidos se han descrito anteriormente [26]. Beige nude [Cr: NIH-bg-nu-Xid], desnudos atímicos [atímicos NCR-nu /nu] y FVB [FVB /CNR] ratones hembra se obtuvieron del Programa de Producción Animal, FNLCR o de los Laboratorios Jackson [FVB /NJ ].
el trasplante ortotópico tumor
para llevar a cabo el trasplante ortotópico tumor, la región lumbar de hembras FVB (5-8 semanas de edad) se afeitó, los animales fueron anestesiados y la piel se prepara para la cirugía aséptica . Una incisión en la piel longitudinal lateral se realizó en la región de flanco que recubre el ovario derecho y otra incisión más pequeña se hizo en el peritoneo. El ovario expuesta, con la almohadilla de grasa circundante, se exterioriza y se insertó un fragmento de tumor donante pequeño (aproximadamente 2 mm) en la bolsa a través de una pequeña rotura quirúrgica. Los ovarios fueron sustituidos en la cavidad abdominal, el peritoneo y se suturó la piel se cerró con clips metálicos.
Los cultivos de células
línea celular de carcinoma de ovario humano HeyA8 fue un regalo del Dr. Elise Kohn , Instituto Nacional del Cáncer, y fue descrito originalmente en [27]; 1A9 y líneas resistentes al cisplatino 1A9CP80 fueron regalos de Dr. Tito Fojo (NCI), y se obtuvieron como en [28], [29];
BRCA1
línea mutante UWB1.289 se obtuvo de la ATCC (Manassas, VA). Todas las líneas de ovario fueron cultivadas en RPMI (Life Technologies, Grand Island, NY) con 10% de suero bovino fetal (Hyclone, Pittsburg, PA) y los antibióticos estándar; 1A9CP80 medio de células se complementó con cisplatino 80 mM (Tocris, Bristol, UK). Un procedimiento detallado para el establecimiento de líneas celulares de cáncer de ovario murino se proporciona en datos S1.
in vitro
ensayos de citotoxicidad
La viabilidad de las células de cáncer de ovario adjuntos se evaluó mediante XTT como se describe [30]. Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1-2,000 células /50 l /pocillo y se incubaron durante 24 h. El cisplatino (Tocris, Bristol, Reino Unido) y olaparib (AZD2281, Selleck químicos, Houston, TX) se prepararon en las existencias de dimetil sulfóxido (DMSO) y se aplicaron a células cultivadas en placas de soluciones de trabajo recién preparados diluidos en serie en el medio. Las células se reponen con fármacos frescos después de 3 días y se determinó la viabilidad después de 7 días mediante la incubación de los cultivos con XTT y midiendo la absorbancia utilizando un lector de placas Tecan F200 (Research Triangle Park, Carolina del Norte). La densidad de células en pocillos tratados se expresó como porcentaje de control. Los experimentos incluyeron muestras por triplicado y se repitieron al menos tres veces. Los valores de IC50 (concentraciones que producen la pérdida de viabilidad en el 50% de las células) se calcularon mediante regresión lineal.
Los estudios preclínicos en ratones
in vivo
estudios, cisplatino (Tocris , Bristol, Reino Unido) fue reconstituido en solución salina estéril al 0,9% y se inyecta por vía intraperitoneal, y olaparib (AZD2281, Selleck Chemicals, Houston, TX) se administró por vía oral en vehículo [PBS que contenía 10% de DMSO (Sigma, St. Luis, MO) y 10% (2-hidroxipropil) ciclodextrina (Sigma, St. Luis, MO)]. Para los estudios de ratones farmacodinámicas con tumores de ovario ortotópico establecidos (~ 0,5 cm de diámetro) fueron tratados con: 1) cisplatino (5 mg /kg), n = 3; 2; 3 y 3 para la línea 29255; 32233; 39877 y 30200; respectivamente, 2) olaparib (50 mg /kg), n = 1; 3; 2 y 3 de la línea 29255; 32233; 39877 y 30200; respectivamente 3) cisplatino (5 mg /kg) seguido de olaparib (50 mg /kg) 1 hr más tarde, n = 3; 2; 2 y 2 para la línea 29255; 32233; 39877 y 30200; respectivamente, o 4) del vehículo, n = 2; 2; 2 y 1 para la línea 29255; 32233; 39877 y 30200; respectivamente, en el día 1. Grupos 2 y 4 recibieron otra dosis de olaparib y grupo 4 otra dosis de vehículo 24 horas más tarde. Todos los animales fueron sacrificados en el día 2, dos horas después de la última dosificación. Los tejidos tumorales se recogieron y los niveles de PAR se midieron utilizando la PARP HT
in vivo
farmacodinámico Ensayo II (Trevigen, Gaithersburg, MD). lisados tumorales se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante y 2 g de proteínas totales se analizaron.
Para los estudios de eficacia y tratamiento a largo plazo animales con tumores palpables (~ 0,5 cm de diámetro) y se obtuvieron imágenes al azar en 4 grupos de tratamiento, como se describió anteriormente, basado en el volumen del tumor para conseguir aproximadamente misma distribución de los volúmenes en todos los grupos. El cisplatino se administró por vía intraperitoneal una vez a la semana. Olaparib y el vehículo se administraron por vía oral durante 5 días consecutivos por semana. Los animales en los estudios de eficacia fueron tratados durante 2 o 3 semanas, fotografiados para determinar cambios en el volumen del tumor y sacrificados 2 horas después de la dosificación olaparib /vehículo. Los animales en el estudio de dosificación a largo plazo fueron tratados durante un máximo de 10 semanas y la imagen cada dos semanas usando ultrasonido (US) para determinar los volúmenes de los tumores. Ellos fueron controlados tras la interrupción del tratamiento para el desarrollo de tumores y fueron sacrificados una vez moribunda debido a la carga tumoral. Se recogió el tejido tumoral para el análisis histológico e inmunohistoquímica (IHC).
perfiles de expresión génica
perfiles de expresión génica y la comparación de los murinos y humanos conjuntos de datos se llevó a cabo como se describe anteriormente [26]. Los datos de análisis de expresión génica de primaria murino y derivan tumores SEOC ortotópico están disponibles al público en la base de datos de expresión génica Omnibus con el número de GSE51927.
Datos S1 contiene material y métodos para el establecimiento de líneas celulares de tumores primarios murinos, implantaciones de células, mediciones de imagen y el volumen del tumor, colección de tejidos, análisis patológico y IHC, el análisis cuantitativo de las manchas de IHC, tinción de inmunofluorescencia de las células humanas y murinas y análisis de PCR cuantitativa de
BRCA1
de estado.
resultados
Transplant conservan las características biológicas y genéticas de SEOCs primarias
modelos GEM SEOC fueron inducidos por la inyección de un vector de adenovirus Cre en la bolsa ovárica de los ratones que albergaban varias combinaciones de alelos Cre-dependientes. Como se ha descrito anteriormente [26], cuando la función RB-TS se inactivó mediante la expresión de
TgK18
T121
alelo y se combinó con
Tp53
deleción o mutación de sentido erróneo (
p53
R172H
), cánceres evolucionó a lo largo de 8-12 meses para producir la enfermedad metastásica de alto grado. La pérdida de
Brca1
o
2
combinado con RB-TS inactivación no dio lugar a la progresión de la enfermedad más allá de la etapa I sin concurrente aberración Tp53, y no influyó notablemente la biología de la progresión de la enfermedad cuando se combina con perturbación de
Rb
y
Tp53
. Sin embargo,
BRCA1
o
BRCA2
estado impacta claramente determinado los resultados terapéuticos en los seres humanos; Por lo tanto, era importante mantener modelos con y sin tipo salvaje
BRCA1 Opiniones de los estudios preclínicos. Los modelos
de novo
SEOC son excelentes para la comprensión de la etiología de la enfermedad y para el descubrimiento de biomarcadores, sin embargo, exhiben una larga latencia de la enfermedad avanzada, por lo que el tiempo de la producción de cohortes para los estudios preclínicos desafiantes. Además, debido a la presencia de la p53
alelo R172H (un alelo nulo antes de la recombinación), los modelos de GEM SEOC pueden desarrollar tumores fuera del ovario, tales como linfomas y sarcomas [26], lo que reduce el tamaño de la cohorte predecible. Estas características hacen que los modelos sub-óptimos para los estudios preclínicos terapéuticos.
Para adaptar estos modelos preclínicos a herramientas eficaces que preservan las características del estroma SEOC y la inmunocompetencia, hemos optimizado el trasplante ortotópico de fragmentos de tumor de SEOCs primarias GEM-derivado en el ovario bolsa de ratones receptores (Fig. 1A). De los 35 tumores primarios, 17 tumores se pasaron con éxito en ratones receptores singénicos (Tabla 1). La tasa de absorción en el paso 1 varió de 20-100% entre las diferentes líneas tumorales con marcadas diferencias en tasa de aceptación entre los
BRCA1
nula (
TgK18G
T121
tg /+ /BRCA1
Δ /Δ /p53
Δ /Δ)
y
BRCA1
tipo salvaje
(TgK18G
T121
tg /+ /p53
Δ /Δ)
tumores (95% ± 5,0 vs 64,5% ± 5,6, p & lt; 0,01). Para ambos genotipos, la latencia de desarrollo a la etapa terminal se acorta sustancialmente de 9,95 ± 1,29 a 2,12 ± 0,61 meses en comparación con el modelo de novo (Tabla 1). Subsiguientes
in vivo
pases latencias más cortas y más a menudo mejora de las tasas de asimilación (Tabla 1). También observamos diferencias en la latencia entre los tumores a pases de
TgK18G
T121
tg /+ /BRCA1
Δ /Δ /p53
Δ /Δ
v
s TgK18G
T121
tg /+ /p53
Δ /Δ
genotipos en la primera (P1) (2,8 ± 0,2 meses frente a 3,6 ± 0,1 meses, p & lt; 0,01) y el segundo paso (P2) (1,8 ± 0,1 meses frente a 2,7 ± 0,2 meses, p & lt; 0,01). Es de destacar, también trató de establecer modelos de aloinjertos ortotópico utilizando células cultivadas a partir de tumores primarios o ascitis. Si bien estos cultivos podrían establecerse fácilmente
in vitro Opiniones y demostrado ser útil para la evaluación de la citotoxicidad de drogas (véase más adelante), la implantación ortotópica
in vivo
era mucho menos éxito en el establecimiento de manera eficiente los tumores con fidelidad requerida en comparación con trasplante directo de los tejidos tumorales en los receptores singénicos (datos S1).
A, modelos de aloinjertos de SEOC se generaron mediante el trasplante de un fragmentos de tumor de ovario de la
de novo y modelos de SEOC bajo la bursa de los ratones inmunocompetentes singénicos. líneas celulares de carcinoma de ovario primario fueron generadas simultáneamente. La latencia para el desarrollo de tumores en modelos ortotópico acortado considerablemente en comparación con la latencia de la
de novo
modelo. B, H & amp; E de tumores primarios (TP) y 1 (P1) tumores de paso correspondientes de 4 líneas tumorales diferentes que indican SEOC histología en PT y derivan trasplantes de tumor ortotópico. La barra de escala representa 100 micras. C, Análisis de componentes principales del epitelio normal de ovario superficie, tumores ováricos primarios y diferentes pasajes de ortotópico tumores derivados. D, Análisis de agrupamiento de datos en humanos y de ratón fusionados utilizando conjuntos de genes clasificador mostró que los tumores a pases, de manera similar a los tumores primarios, representados los 4 subgrupos de SEOC humana derivadas originalmente de estudio TCGA [5].
Para determinar si los cambios significativos en el fenotipo tumoral se asocian con un mayor número de pases, histopatologías tumorales primarias y ortotópico fueron evaluados y clasificados como SEOC papilar, SEOC papilar pobremente diferenciado, o carcinoma indiferenciado (ver datos S1). Había una alta concordancia en la clasificación de tumores P2 donante y el P1 y, aunque se observó una tendencia hacia la pérdida de bien diferenciado histología SEOC con aumento del número de paso (Fig. 1B, Tabla 1). Al igual que con el
de novo
SEOC modelo de ratón y la enfermedad humana, un porcentaje sustancial de los ratones con tumores ortotópico desarrollado carcinomatosis abdominal (media = 32%) o metástasis a distancia (media = 40%).
Para controlar los tumores a pases a nivel molecular, se compararon los perfiles de transcripción de un conjunto de datos publicados anteriormente [26] compuesto por SEOCs normales del epitelio superficial del ovario primarios y con un conjunto recién generada de hacer coincidir SEOC primaria y derivamos tumores ortotópico. Por el análisis de componentes principales (PCA), las muestras normales claramente separados de los tumores, mientras que los tumores agrupados a pases con tumores primarios con indicación de su parecido con los de novo SEOCs (Fig. 1C). Además, el análisis conjunto de los datos humanos y de ratón fusionados utilizando conjuntos de genes clasificador mostró que los tumores a pases, de manera similar a los tumores primarios, representados los 4 subgrupos de SEOC humana identificados originalmente en el estudio TCGA [5] (fig. 1D). Por lo tanto, los modelos de cáncer de ovario trasplantables ortotópico recapitulan la enfermedad humana en los niveles moleculares e histopatológicas.
células de carcinoma de ovario murinos muestran un perfil de sensibilidad a los fármacos similares a líneas celulares humanas
Para la comparación de la respuesta al tratamiento de drogas en murinos y células humanas, se midió la citotoxicidad tras la exposición a cisplatino y olaparib en células de carcinoma de ovario humanos establecidos y cultivos de células tumorales derivadas de SEOCs primarios de ratón y ascitis (fig. 1A). Mientras que la línea humana UWB1.289 expresa una proteína truncada inactiva BRCA1, el estado BRCA1 en líneas humanos 1A9 (un subclón de la línea A2780), y 1A9CP80 HeyA8 es desconocida. Para determinar si estas líneas celulares humanas eran capaces de reclutamiento RAD51 y la reparación de recombinación homóloga mediada por lo tanto, se evaluó la formación de focos inducida por la radiación de γH2AX y RAD51. Mientras γH2AX marca sitios de DSB independientes de la funcionalidad de los genes BRCA1, RAD51 contratación de las DSB es BRCA1-dependiente. 1A9CP80 células y HeyA8 sometidas a irradiación 10 Gy y se tiñeron 6 horas más tarde, mostraron una profunda formación de RAD51 y γH2AX focos. Por el contrario, la ausencia completa de RAD51 focos se observó en 1A9 y UWB1.289 células (Figura S1.), Lo que indica la falta de funcionalidad de los genes BRCA1
Como se informó anteriormente [27] - [29]. UWB1.289 y 1A9 eran más sensibles al tratamiento con cisplatino, mientras que las líneas de IC50 1A9CP80 y HeyA8 eran generalmente 2-2,5 veces mayor que sus contrapartes sensibles (Fig. 2A). tratamiento olaparib produjo la mayor citotoxicidad en células 1A9, mientras que 1A9CP80, HeyA8 y UWB1.289 eran similares y aproximadamente 2 veces menos sensible (Fig. 2B).
humano (A, B) y murino (C- H) células de cáncer de ovario se expusieron a cisplatino, olaparib o vehículo durante 7 días después de que la viabilidad celular se midió utilizando el reactivo XTT. viabilidad proporcional se calculó mediante la comparación de los medicamentos con los controles del vehículo cuya viabilidad se supone que es 100%. C. panel de líneas de células murinas se selecciona en función de
BRCA1
estado conteniendo
BRCA1
-deficiente (barra rayada) y líneas de tipo -wild (barras rellenas) manteniendo similares
BRCA1
expresión como sus tumores de origen (D). Los valores de IC50 para las líneas celulares de cáncer individuales se muestran en las leyendas (A, B, E, G, paréntesis detrás de la designación de línea celular). La comparación de la IC50 para el cisplatino (F) y olaparib (H) en el tipo salvaje (
TgK18G
T121
tg /+ /p53
Δ /Δ
; R5810T, R5838T) y mutante (
TgK18G
T121
tg /+ /BRCA1
Δ /Δ /p53
Δ /Δ
; 39647T, 60577T, 60580T, 82394T) líneas celulares murinas muestra diferencias significativas entre los genotipos (t-test, 333,7 ± 54,1 vs 146,0 ± 8,2, p & lt; 0,01 y 18,2 ± 1,4 vs 10,4 ± 1,2, p & lt; 0,05, respectivamente, para las drogas). Se muestra el error medio y estándar.
Para los ensayos de citotoxicidad comparativos, primario del ratón SEOC líneas de células que albergan, ya sea de tipo salvaje
BRCA1
o el mutante de deleción, se cultivaron. Como se informó anteriormente [31],
BRCA1
células deficientes crecen muy poco en la cultura. Por lo tanto, debido a la recombinación mediada por Cre in vivo no es 100%, hay una fuerte
in vitro
selección de células con insuficiente
Brca1
deleción en líneas celulares derivadas de predominantemente
Brca1
tumores deficientes [31]. De 32 líneas celulares examinados, cuatro líneas celulares que mantienen la
BRCA1
niveles de expresión (por debajo del 20%) con relación a la más baja
fueron escogidos BRCA1
líneas de tipo salvaje para representar
BRCA1
-deficiency (Fig. 2C). Estos niveles de
BRCA1
fueron comparables a los padres que sus tumores (Fig. 2 D).
BRCA1
deficiencia también se confirmó mediante un ensayo funcional en las células irradiadas fueron incapaces de reclutar RAD51 a los sitios de DSB (Fig. S2).
BRCA1
líneas celulares deficientes (39647, 60580, 60577 y 82394; todos los
TgK18G
T121
tg /+ /p53
Δ /Δ /BRCA1
Δ /Δ
genotipo) fueron aproximadamente 2 veces más sensibles a cisplatino que
BRCA1
líneas de tipo -wild (R5810 y R5838; ambos
TgK18G
T121
tg /+ /p53
Δ /Δ
genotipo; Fig. 2E-F). Del mismo modo, el tratamiento con olaparib mostró una mayor potencia in
BRCA1 deficiente en
que
BRCA1
líneas celulares de tipo -wild (Fig. 2 G-H). Nuestros resultados indican que estas líneas de células se replican las sensibilidades relativas de los tumores humanos, donde
BRCA
mutaciones se encuentran con mayor frecuencia en platino-sensible que la enfermedad resistente al platino [32], [33].
ortotópico modelos de trasplante de recapitular
BRCA
diferencias relacionados con la PI en la respuesta al tratamiento en pacientes observados
Lo ideal para el uso eficaz de cualquier modelo preclínico en el desarrollo de la terapéutica humana y biomarcadores asociados al tratamiento, la previsibilidad de las respuestas humanas conocidas debe ser establecido. Con este fin, se evaluaron las respuestas de los
BRCA1
modelos tipo SEOC deficientes y -wild a cisplatino y olaparib. En primer lugar, para determinar un horario de dosificación óptima, se analizó la cinética del crecimiento tumoral mediante resonancia magnética (RM) de serie (Fig. S3). Los animales receptores desarrollaron pequeños tumores de ovario de 70 a 80 mm
3 (~ 0,5 cm de diámetro) por 21 a 28 días después de la implantación (p. i.) seguido por el crecimiento rápido del tumor. Los animales se volvieron moribundos debido a los grandes tumores de ovario y ascitis por 40 a 60 días p.i. Para los estudios de eficacia, el tratamiento se inició una vez un pequeño (& gt; 80 mm
3). Masa tumoral se había desarrollado con el fin de imitar los pacientes con carga tumoral residual después de la cirugía de aumento de volumen de (. Diseño del estudio se representa en la figura 3A)
a, esquema de régimen de dosificación y la imagen en los estudios de eficacia. B, la inhibición de la formación de PAR en lisados tumorales tratados con olaparib para 2 (C). Se muestra el error medio y estándar. D, imágenes representativas de MR antes y después de 2 semanas de tratamiento con vehículo, olaparib, cisplatino o una combinación de olaparib y cisplatino se muestran. La barra de escala representa 1 cm. Las flechas blancas indican los tumores, las flechas verdes indican ovarios contralaterales. MRI cuantificación basado de los cambios de volumen de tumor expresadas como RTV siguiente 2 semanas (E) y régimen de tratamiento 3 semanas (F). Las diferencias estadísticas entre los grupos fueron analizados por ANOVA de una vía y prueba de comparación múltiple de Tukey. Cada punto representa un animal. V; vehículo, O; olaparib, C; cisplatino, O + C; olaparib y cisplatino.
Para determinar la actividad in vivo y la modulación diana por olaparib en el modelo ortotópico, que analizaron los niveles de PAR en los tumores tratados. Tumorales lisados de todos los animales que recibieron el tratamiento olaparib habían reducido en gran medida los niveles de PAR después de corto plazo (28 horas; p & lt; 0,01 para la línea 32233, p & lt; 0,001 para la línea 30200) ya largo plazo (2 semanas; p & lt; 0,01 para la línea 29255 y 30,200, p & lt; 0,0001 para la línea 39 877) la dosificación en comparación con los ratones tratados con vehículo o cisplatino (Fig 3B, C), lo que indica que la exposición a tumor olaparib era suficiente para la inhibición de PARP.. Como era de esperar, no hubo diferencias en los niveles de PAR entre los
BRCA1
tumores de tipo salvaje y deficientes, en consonancia con la formación de PAR se produce aguas arriba de los genes BRCA1, independiente del estado del mecanismo de reparación HR.
Se evaluó la eficacia de olaparib, cisplatino y su combinación en el
BRCA1
modelos deficientes después de dos semanas de tratamiento (Fig. 3D, e) mediante la medición de los volúmenes tumorales relativos (RTV), los cambios en el volumen tumoral con respecto al inicio (pre-dosificación) para el punto final como se determina por resonancia magnética. Cada punto en el gráfico representa un ratón individual. Los 13 animales tratados con vehículo de 2 modelos de tumores independientes mostraron un crecimiento rápido del tumor dentro de 2 semanas, con 3 animales sacrificados antes del día 14 debido al deterioro de la salud asociados con el crecimiento tumoral (Fig. 3D, E). El tratamiento con olaparib resultó en modesta reducción del crecimiento del tumor en el
Brca1
modelo deficiente en 30.200 tumor y en una reducción significativa en el modelo 39877 (p & lt; 0,01). Sin embargo, en ambos casos, la reducción de la RTV fue más profundo cuando se trataron con cisplatino (p & lt; 0,001) y la combinación de cisplatino y olaparib comparación con olaparib sola (p & lt; 0,01) (Fig. 3D, E)
para investigar si la respuesta al tratamiento fue dependiente de
BRCA1
estado, se realizó un estudio de tratamiento de 3 semanas en el
BRCA1 deficiente en
modelo 30200 y un
BRCA1 CD - modelo de tipo salvaje 29255. Seis de 9 ratones tratados con vehículo de ambas líneas se convirtió moribundo antes del día 21. el cisplatino mono o terapia de combinación fue igual de efectivo en los puntos de tiempo 3 y 2 semanas. Sin embargo, el tratamiento extendido de
Brca1
tumores deficientes con olaparib como resultado una mayor reducción del tumor en comparación con los tumores tratados con vehículo (2.037 ± 0.282 5.598 ± RTV vs 2.296 RTV, p & lt; 0,01) a 3 comparado con el tratamiento 2 semanas (3.008 ± 0.509 vs 3.710 ± 1.325 RTV, ns), lo que sugiere que se requiere un umbral de daño en el ADN para la potencia óptima. Por el contrario, el
BRCA1
modelo tipo de tumor -wild no respondió a olaparib pesar de la inhibición de PARP en los tumores, lo que indica la importancia de la reparación de daños de recursos humanos para la eficacia olaparib (Fig. 3B, F). la terapia con cisplatino fue igualmente ineficaz en
BRCA1
tumores de tipo salvaje (Fig. 3F).
BRCA1
respuestas específicas del genotipo a fármacos de platino, así como olaparib También se han documentado en los pacientes [34] - [37], por lo tanto, el modelo ortotópico es una herramienta útil para examinar estas respuestas diferenciales y predecir los posibles resultados.
los cambios histopatológicos que resultan de olaparib y el tratamiento con cisplatino reflejan las diferencias observadas en los volúmenes tumorales
para evaluar el efecto del tratamiento de la droga a nivel celular, H & amp; se analizaron las secciones del tumor teñidas con los cambios histológicos (Fig. 4AA-l). En ambos
BRCA1
modelos deficientes, el tratamiento con olaparib resultó en menos diferenciadas SEOC con el aumento del tamaño nuclear y pleomorfismo en comparación con el bien a moderadamente diferenciado estructuras papilares de los tumores de ovario en ratones tratados con vehículo (Fig. 4A una , b). En contraste, la monoterapia cisplatino tenía un efecto más profundo en la histología del tumor (Fig. 4ac), produciendo SEOC papilar pobremente diferenciado o carcinoma no diferenciado con un aumento en el estroma tumoral, focos necróticos, y las células apoptóticas con un alto grado de pleiomorfismo nuclear y la presencia de tumor de células gigantes multinucleadas atípicas. El tratamiento de la
Brca1
modelos deficientes con combinación de cisplatino y olaparib resultó en histología muy similar a la de los tumores tratados con cisplatino solo (Fig. 4AD). Por el contrario, no se observaron efectos mínimos en el tratamiento de drogas
BRCA1
modelo de tumor de tipo -wild que indica una concordancia general de los cambios histopatológicos y el volumen del tumor después del tratamiento de drogas (Fig. S4).
A, un ejemplo de la histología y la IHC de
TgK18G
T121
tg /+ /BRCA1
Δ /Δ /p53
Δ /Δ
tumores tratados con cisplatino y /o olaparib (una -l). línea tumoral 39877 era sensible al tratamiento con medicamentos, lo que resultó en disminución de la proliferación (Ki67) (A e-h) y el aumento de daño en el DNA (γ-H2AX) (A i-l).