Extracto
microtúbulos perturbar el tráfico de drogas inhiben lisosomal e inducen la permeabilización de la membrana lisosomal seguido de muerte celular catepsina-dependiente. Para identificar las proteínas específicas relacionadas con el tráfico que controlan la supervivencia celular y la estabilidad lisosomal, que exhibió una biblioteca siRNA motor molecular en células de cáncer de mama MCF7 humano. SiRNAs dirigidos a cuatro Kinesins (KIF11 /Eg5, KIF20A, KIF21A, KIF25), miosina 1G (MYO1G), la miosina de cadena pesada 1 (MYH1) y tropomiosina 2 (TPM2) fueron identificados como eficaces inductores de la muerte de células no apoptóticas. La muerte celular inducida por KIF11, KIF21A, KIF25, o MYH1 TPM2 siRNAs fue precedida por permeabilización de la membrana lisosomal, y todos los siRNAs identificados induce varios cambios en el compartimiento de endo-lisosomal,
es decir
aumento del volumen lisosomal (KIF11, KIF20A , KIF25, MYO1G, MYH1), aumento de la actividad de la catepsina cisteína (KIF20A, KIF25), alteración de localización lisosomal (KIF25, MYH1, TPM2), aumento de la acumulación de dextrano (KIF20A), o la reducción del flujo de autofagia (MYO1G, MYH1). Es importante destacar que todos los siete siRNAs también mataron cáncer de cuello uterino humano (HeLa) y osteosarcoma (U-2-OS) las células cancerosas y células sensibilizadas a otros tratamientos lisosomas desestabilizar,
es decir
foto-oxidación, siramesine, etopósido o cisplatino . De manera similar a KIF11 siRNA, el inhibidor de monastrol KIF11 permeabilización de la membrana lisosomal inducida y varias líneas celulares de cáncer sensibilizados a siramesine. Aunque los inhibidores de KIF11 están en fase de desarrollo clínico como bloqueadores de la mitosis, nuestros datos revelan una nueva función para KIF11 en el control de la estabilidad lisosomal e introducen otros seis motores moleculares como dianas terapéuticas del cáncer putativo
Visto:. Groth-Pedersen L, S AITS , Corcelle-Termeau e, Petersen NHT, Nylandsted J, Jäättelä M (2012) identificación de asociada al citoesqueleto proteínas esenciales para lisosomal estabilidad y supervivencia de células de cáncer humano. PLoS ONE 7 (10): e45381. doi: 10.1371 /journal.pone.0045381
Editor: Michael Sherman, Universidad de la Escuela de Medicina de Boston, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Mayo 2012; Aceptado: August 17, 2012; Publicado: 11 Octubre 2012
Copyright: © Groth-Pedersen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Sociedad danesa del cáncer, el Consejo danés de Investigación médica, el Ministerio danés de Ciencia, la Comisión Europea 7PM (APO-SYS), la Fundación Nacional danesa de Investigación, el ML Jørgensen & amp; Fundación G. Hansen, la Fundación Alfred Benzon, la Fundación Meyer, la Fundación Novo Nordisk, el Fondo Memorial de Landshövding por Westling y la Fundación John y de Augusta Persson. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los lisosomas son vesículas ácidas que contienen numerosos hidrolasas, que degradan los orgánulos y macromoléculas que les sean entregados por la autofagia, endocitosis y fagocitosis [1]. síntesis lisosomal mejorada, el tráfico y la liberación extracelular de proteasas lisosomales (catepsinas) son características importantes de cáncer y están asociados con la capacidad metastásica e invasivo de las células cancerosas [2], [3], [4]. Curiosamente, estos cambios de transformación asociada a sensibilizar a las células cancerosas a la vía de la muerte celular lisosomal [5], una forma de muerte celular programada que puede hacerse cargo cuando se inhibe la apoptosis, como es el caso en muchos tipos de cáncer [6]. la muerte celular lisosomal se caracteriza por permeabilización lisosomal y la posterior translocación de catepsinas en el citosol, donde activan la apoptosis o muerte llevan a cabo sin la activación de caspasa [3].
Entre los fármacos contra el cáncer que activan la muerte celular lisosomal son microtúbulos desestabilizar y -stabilizing drogas (
por ejemplo
vinca alcaloides y taxanos), que inhiben la trata lisosomal e inducen una expansión del compartimiento lisosomal seguido de ruptura lisosomal y la muerte celular dependiente de catepsina [7], [8]. Desafortunadamente, una grave perturbación del citoesqueleto también afecta a los procesos vitales en las células sanas que conducen a la toxicidad en los pacientes [9]. Una orientación más específica de la trata lisosomal lo tanto, podría mejorar la terapia considerablemente.
dinámica del citoesqueleto y el transporte intracelular de vesículas, orgánulos y macromoléculas a lo largo de los microtúbulos citoesqueleto de actina y dependen de las proteínas motoras moleculares. Se pueden dividir en kinesins, dyneins y miosinas, todos los cuales han sido implicados en el tráfico de lisosoma [10], [11], [12]. Además, numerosas proteínas accesorias regular la función de las proteínas motoras [13], [14], [15]. Kinesins y dyneins, que se mueven a lo largo de los microtúbulos, transportan una variedad de carga y ayudar a crear el huso mitótico. Las 44 kinesins humanos conocidos se mueven predominantemente hacia los extremos más de los microtúbulos en la periferia de la célula (transporte anterógrado) [13]. Por el contrario, las dos cadenas conocidas humanos de transporte de carga de dineína pesados, que forman complejos de proteínas funcionamiento motor con varias proteínas accesorias, se mueven hacia los extremos menos de microtúbulos en el área perinuclear de la célula (transporte retrógrado) [14]. Además, el genoma humano codifica para catorce dyneins axonemal responsables para el deslizamiento de los microtúbulos que causa el golpeo de los cilios y flagelos. Myosins, de los cuales los seres humanos tienen ~ 40, se unen a los filamentos de actina que se concentran debajo de la membrana de plasma. Son especialmente importantes para el transporte de corto alcance durante la endocitosis y exocitosis. Myosins también generan fuerza mecánica para la contracción muscular, la migración celular y la citocinesis [15]. Otras proteínas de unión a la actina como tropomiosinas, que afectan a la dinamicidad de la actina y la estabilidad [16], modular la función de la miosina.
Para identificar los motores moleculares y proteínas relacionados necesarios para la supervivencia de las células cancerosas, que exhibió una biblioteca de siRNA dirigidos a 136 molecular motores y proteínas relacionadas para siRNAs que reducen la viabilidad de las células MCF7. Las siete proteínas identificadas se caracterizan entonces por su papel en la muerte celular, el ciclo celular, la estructura del citoesqueleto, la autofagia, la función lisosomal y la integridad lisosomal. Sorprendentemente, el agotamiento de todas las proteínas identificadas desencadena la muerte celular apoptótica que no fue precedida por cambios dramáticos en la estabilidad y la función lisosomal.
Resultados
Identificación de las proteínas del citoesqueleto asociada cuyo agotamiento induce la apoptosis no cáncer de la muerte celular
citoesqueleto disruptores drogas son potentes inductores de la muerte celular lisosomal [7], [8]. Para identificar las proteínas del citoesqueleto de regulación necesarios para la supervivencia de las células cancerosas, que exhibió un Silencer® Molecular Biblioteca Motor Ambion (Tabla S1) para los efectos tóxicos sobre las células del cáncer de mama MCF7 utilizando el ensayo de reducción de MTT. Las proteínas fueron considerados candidatos si ≥ 2/3 siRNAs reducción de la densidad celular por & gt; 40% en tres experimentos independientes. Cuatro miembros kinesin familiares (KIF11, KIF20A, KIF21A, KIF25), dos myosins (MYO1G y MYH1) y tropomiosina 2 (TPM2) cumplen estos criterios (Fig. 1A) y se analizaron adicionalmente después de confirmar desmontables por los siRNAs (Fig. S1) .
(A, B) MCF7 (A), HeLa (B) y u-2 OS-células (B) se dejaron sin tratar, se trataron con Oligofectamine (Oligo) o transfectadas con siRNA de control (CT) o tres siRNAs independientes contra los objetivos que se indican de forma individual (8 nm; a) o en las piscinas (3 x 6,67 nm; B). La densidad celular se midió después de 72 h por el ensayo de reducción de MTT. las células (C) MCF7-Bcl-2 o MCF7-pCEP (control) fueron transfectadas como en (B).
izquierda abajo, Después de 96 h, la muerte celular se determinó contando las células teñidas con Hoechst 33342 con núcleos condensada (tres campos al azar de 100 células). TNF (20 ng /ml, 24 h) sirvió como control positivo para la Bcl-2 la muerte celular apoptótica sensible.
Izquierda superior
, Western blot confirma la sobreexpresión de Bcl-2 en células MCF7-Bcl-2 no tratados.
núcleos derecho
, ejemplos de imágenes de Hoechst 33342-manchado de MCF7-pCEP y MCF7-Bcl-2 células 96 horas después de la transfección con ARNip indicados. las células (D) MCF7 se trataron como en (B).
izquierda, Después de 60 h, el ADN se tiñeron con yoduro de propidio y la distribución del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo (FL-2A).
derecho
, Ejemplos de histogramas que muestran la distribución del ciclo celular de las células 60 h después de la transfección con siRNAs indicados. Los valores representan las medias + SD de tres experimentos independientes (A, C, D) o triplicados en un experimento representativo (B, n = 3). *
P
& lt; 0,05, **
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P
& lt; 0,001, frente a las células de control transfectadas con siRNA o como se indica ( C).
en experimentos posteriores se combinaron los tres siRNAs para cada objetivo si no se indica lo contrario. Al igual que en las células MCF7, el agotamiento de las proteínas identificadas reduce la densidad de carcinoma cervical HeLa y células de osteosarcoma U-2 OS-significativamente a pesar de que el patrón difería algo de la observada en las células MCF7 (Fig. 1A, B). Este resultado se confirmó usando siRNAs individuales en células U-2 OS-(datos no mostrados). A continuación, examinó si la muerte celular observada fue Bcl-2-sensible (apoptosis) mediante la transfección de células Bcl-2 que sobreexpresan y MCF7 transfectadas con el vector [17] con los siRNAs y cuantificación de condensación de la cromatina asociada a la muerte después de 96 h. Los siete siRNAs causados condensación de la cromatina en 20-60% de las células. Bcl-2 inhibe la condensación de la cromatina sólo después de factor de necrosis tumoral tratamiento (TNF) (un control para la muerte celular apoptótica), y parcialmente en las células transfectadas con siRNA KIF21A (Fig. 1C). Notablemente, KIF21A siRNA todavía indujo condensación nuclear en ~ 40% de las células Bcl-2 que sobreexpresan (Fig. 1C). Resultados similares se obtuvieron con siRNAs individuales (datos no mostrados).
KIF11 y KIF20A se sabe que regulan la formación del huso mitótico y la citocinesis, respectivamente [18], [19]. KIF11 agotamiento detenido las células en la fase G2 /M, como se esperaba, mientras que las células transfectadas con siRNA KIF20A acumulan en la fase G1 (Fig. 1D). Los otros siRNAs no causaron cambios significativos en la distribución del ciclo celular (Fig. 1D).
Efecto de los siRNAs identificados en lisosomas y citoesqueleto
Desde la muerte de células no apoptóticas pueden resultar del daño lisosomal, a continuación estudió el efecto de los ARNip identificados en los lisosomas en células MCF7. KIF11, KIF20A, KIF25, MYO1G y MYH1 siRNAs aumentó significativamente la proporción de células con un agrandamiento de endo-lisosomal (ácido) compartimento (Fig. 2A), y en las células agotadas para KIF20A, KIF25 o MYO1G este aumento se asoció con un aumento de la proteasa lisosomal actividad (Fig. 2B). Por el contrario, KIF11, MYH1 y TPM2 siRNAs reducción de la actividad de la catepsina posiblemente debido a la permeabilización de la membrana lisosomal (ver abajo). Los lisosomas se dispersaron por todo el citoplasma en células transfectadas con control, KIF11, o KIF21A MYO1G siRNAs (Fig. 2C). Por el contrario, las células agotadas-KIF20A muestran largos salientes que a menudo estaban pobladas densamente por lisosomas, y KIF25, TPM2 y MYH1 siRNAs causaron la agregación lisosomal periférica (Fig. 2C). Se observó la distribución lisosomal similares después de la transfección con los tres siRNAs dirigidos individuales KIF20A, KIF25 y MYH1 y siRNAs 1 y 3 de orientación TPM2 (datos no mostrados).
(A-D) células MCF7 se dejaron sin tratar, se trató con Oligofectamine (Oligo) o transfectadas con siRNA de control (CT) o piscinas siRNA indicados. (A) Después de 60 h, las células con pH ácido ampliada (endosomas tardíos y lisosomas) fueron identificados por citometría de flujo (FL-2A) de las células teñidas con rojo LysoTracker. El umbral para la alta intensidad de la tinción se define de forma que 90% de las células siRNA transfectadas de control se encontraban por debajo. Se determinó (B) Después de 72 h, la actividad total de la cisteína catepsina (escisión ZFR-AFC). HSPA1 y CTSB siRNAs sirvieron como controles internos. (C, D) Después de 60 h, las células se tiñeron para Lamp-2 (C) o F-actina (D) y se analizó por microscopía confocal. se muestran imágenes representativas.
Las flechas
, la agregación de estructuras lisosomales en la celda salientes /periferia.
Barras
, 20 micras. Los valores representan las medias + SD de un mínimo de tres experimentos independientes. *
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P
. & Lt; 0,001, en comparación con las células control siRNA-transfectadas
a continuación, se examinó si la alteración de la localización lisosomal se asoció con cambios en el citoesqueleto de actina o los microtúbulos, que están ambos implicados en el tráfico de lisosomal [20]. El agotamiento de KIF25 y MYH1 aumentó de manera espectacular los niveles y las fibras de estrés de actina F que puede contribuir a la relocalización lisosomal (Fig. 2D). Se observó un incremento menor en las fibras de estrés por tratamiento con MYO1G y TPM2 siRNAs, mientras que no se observaron cambios con los otros siRNAs (Fig. 2D). Ninguno de los siRNAs identificados tenía efectos detectables sobre los microtúbulos como se visualiza mediante tinción de α-tubulina (datos no mostrados).
Efecto de los siRNAs identificados en la autofagia y acumulación de dextrano
Los lisosomas recibir su carga principalmente a través de la autofagia y la endocitosis. Para probar el efecto de los siRNAs identificados en la autofagia, se utilizó células MCF7 que expresan tfLC3, una proteína fluorescente tándem sensible al pH que consiste en proteína fluorescente roja monomérica (mRFP), el aumento de la proteína fluorescente (EGFP) y proteína asociada a microtúbulos cadena 1 luz verde 3 (LC3) [21]. En vacuolas autofágicos iniciales (AVI) tfLC3 emite fluorescencia verde y rojo, mientras que en las vacuolas autofágicos degradativas (dVA) que emite fluorescencia roja solamente desde EGFP fluorescencia se pierde en amphisomes ácidos y autolisosomas. Como se informó anteriormente [22], el agotamiento de raptor, un componente del complejo de mamíferos objetivo de rapamicina 1 que normalmente bloquea la autofagia, se incrementaron tanto el número de AVI y dVA indicativo del aumento del flujo de autofagia (Fig. 3A, B). En contraste, las piscinas MYO1G y MYH1 siRNA así como los tres siRNAs dirigidos individuales MYH1 y siRNAs 1 y 3 de orientación MYO1G aumentaron AVi pero no AVD. SiRNAs dirigidos a los otros cinco candidatos no tuvieron efectos aparentes en este ensayo (Fig. 3A, B y los datos no se muestra). La capacidad de MYO1G y MYH1 siRNAs para inhibir flujo autophagic también fue indicada por un aumento de la p62 /sequestesome (p62 /SQSTM1, una proteína con eficacia degradada por autofagia) los niveles y la capacidad de un inductor autofagia, la rapamicina reducida, para reducir los niveles de p62 /SQSTM1 después de los tratamientos siRNA (Fig. 3C).
(A-D) células tfLC3-MCF7 (A, B) o las células MCF7 (C, D) se deja sin tratar, tratado con Oligofectamine (Oligo) o transfectadas con ARNsi de control (CT) o piscinas siRNA indicados (3 × 6,67 nM). (A, B) Después de 48 h, las células tfLC3-MCF7 se analizaron por microscopía confocal. Imágenes representativas (A;
Barras
, 10 micras) y cuantificación de los puntos lagrimales (B) se muestran. Raptor siRNA (RPTOR) sirvió como control de flujo aumentado de la autofagia. flechas indican cerrados dVA, flechas abiertas indican AVI. (C) Después de 60 h, el nivel de p62 /SQSTM1 (p62), que se degrada por la autofagia, se examinó por transferencia de Western. La rapamicina (20 nM, 4 h) se utilizó para inducir la autofagia. Los números representan p62 niveles como porcentaje del nivel en las células siRNA transfectadas de control sin tratar. (D)
Top
, Después de 60 h, las células MCF7 se trataron con 100 mg /ml Alexa Fluor 488-dextrano (dextrano-488) durante 1 h y se analizaron por citometría de flujo (FL1-H). El umbral para la alta intensidad de la tinción se define de forma que 88% de las células siRNA transfectadas de control se encontraban por debajo.
Bottom Restaurant, histogramas de ejemplo que muestra el contenido de dextrano-488 de células transfectadas con siRNA control o KIF20A. M1 = puerta para alta intensidad de tinción. Los valores representan las medias + SEM de 20 células en un experimento representativo (B, n = 3) o los medios + SD de tres experimentos independientes (D). *
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P
. & Lt; 0,001, en comparación con las células control siRNA-transfectadas
a continuación, se examinó el efecto de los ARNip identificados en la captación de 10 kDa Alexa Harina 488-dextrano por citometría de flujo. KIF20A agotamiento aumentó la acumulación de dextrano significativamente, mientras que KIF11 siRNA provocó un ligero (p = 0,066) aumento. Los otros cinco siRNAs no tuvieron ningún efecto en este ensayo (Fig. 3D). Cabe señalar que este ensayo no puede distinguir entre el aumento y la disminución de la endocitosis exocitosis.
Reducción de la estabilidad lisosomal por los siRNAs identificados y monastrol
La muerte de células no apoptóticas y numerosos cambios lisosomales observó anteriormente nos llevó a estudiar el efecto de los siRNAs identificados en la estabilidad lisosomal. En primer lugar, se midió la capacidad de los lisosomas para retener naranja de acridina, un colorante básico metacromática, cuando fueron estimulados con luz azul [23]. KIF11, KIF20A, KIF21A, MYH1 y TPM2 siRNAs sensibilizaron células MCF7 significativamente a las fugas lisosomal foto-oxidación inducida y KIF25 siRNA mostraron una tendencia similares 60 h después de la transfección (Fig. 4A, B). Cuando se analizó después de 72 h, todos los siRNAs habían inducido fugas lisosomal (aparición de proteasas lisosomales en el citosol), a pesar de que el efecto de KIF20A y MYO1G siRNAs no alcanzó significación estadística (Fig. 4C). En particular, el tratamiento de las células MCF7 con monastrol, un bien caracterizado inhibidor de molécula pequeña de KIF11 [24], también inducida permeabilización de la membrana lisosomal (Fig. 4D). Por lo tanto, el agotamiento de cada una de las siete proteínas, así como los resultados del tratamiento monastrol en desestabilización lisosomal.
células (A-C) MCF7 se dejaron sin tratar, se trataron con Oligofectamine (Oligo) o transfectadas con siRNA de control (CT ) o piscinas siRNA indicados (3 × 6,67 nM). (A y B) Después de 60 h, las células se trataron con naranja de acridina y se analizaron por imágenes de células vivas para medir la pérdida de la integridad lisosomal (aumento de la fluorescencia verde) después de tratamiento con láser. A miminum de 25 células de áreas predefinidas se examinó para cada experimento. Tres experimentos independientes se muestran en A y B representan los valores en los medios + SD de estos experimentos en el punto de tiempo de 60 seg. (C) Después de 72 h, las actividades totales de cisteína catepsinas citosólicas y se midieron mediante el análisis de la escisión de ZFR-AFC. Las actividades en extractos citosólicos se muestran como porcentajes de las actividades en los extractos totales correspondientes. HSPA1 y CTSB siRNAs sirvieron como controles para la inducción de la fuga lisosomal y la eficacia de la transfección, respectivamente. (D) Las actividades de la catepsina cisteína citosólicos en células MCF7 dejaron sin tratar o se trataron con vehículo (sulfóxido de 2% de dimetilo, DMSO) o indicaron concentraciones de monastrol durante 72 h se determinaron como en (C). Los valores representan las medias + SD de cinco (C) o tres (D) experimentos independientes. *
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P Hotel & lt; 0,001, frente al control de siRNA-transfectadas (B, C) o células tratadas con vehículo (D).
Sensibilización al lisosoma disruptores drogas por los siRNAs identificados y monastrol
Dado que los siRNAs desestabilizan los lisosomas, hemos examinado si podrían también sensibilizar células de lisosomas interrumpir las drogas. Para este propósito, las células MCF7 fueron transfectadas con siRNAs durante 48 h y luego se trató durante 48 h adicionales con siramesine, etopósido o cisplatino, todos los cuales son capaces de causar la muerte celular lisosomal [5], [25]. Todos los siRNAs excepto células sensibilizadas KIF25 siRNA a siramesine con el efecto más fuerte observada para KIF11 y KIF21A siRNAs (Fig. 5A, B). Para KIF11, esto se confirmó usando los tres siRNAs individuales (datos no mostrados). La sensibilización a etopósido fue visto con KIF11, KIF21A, KIF25, MYH1 y TPM2 siRNAs (Fig. 5A, B). KIF20A siRNA no tuvo ningún efecto, mientras que MYO1G siRNA reduce la muerte celular en respuesta a etopósido, posiblemente debido a su capacidad para inhibir la autofagia, que puede contribuir a la muerte inducida por etopósido [26]. Además, KIF11, KIF21, MYH1 y TPM2 siRNAs mejorado la muerte celular inducida por cisplatino pero debido a las variaciones entre experimentos el efecto sólo fue significativo para KIF21A siRNA. Además, la combinación monastrol y siramesine resultó en la inducción sinérgica de la muerte celular en MCF7, HeLa, U-2-OS y DU-145 células (Fig. 5C, S2). Por lo tanto, todos los siRNAs sensibilizaron las células cancerosas a uno o varios lisosoma disruptores fármacos con los efectos más fuertes observadas en células que carecen de KIF11 o KIF21A.
(A, B) las células MCF7 se dejaron sin tratar, se trataron con Oligofectamine (Oligo) o transfectadas con siRNA control o piscinas siRNA indicados (3 x 6,67 nM). Después de 48 h, las células se dejaron sin tratar o tratadas con 2 siramesine M (
Top of), 50 M etopósido (
medio) o 10 mM cisplatino (
inferior) para 48 h adicionales antes de microscopía de luz imágenes se tomaron imágenes representativas (en B) y la muerte celular se cuantificó mediante el ensayo de liberación de LDH (A). células (C) MCF7 se dejaron sin tratar o tratadas con 2 mM siramesine junto con las concentraciones indicadas de monastrol durante 72 horas y muerte celular se cuantificó mediante el ensayo de liberación de LDH. Los valores representan las medias + SD de un mínimo de tres experimentos independientes. *
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P Hotel & lt; 0,001, en comparación con las células control siRNA-transfectadas (A) o Las células tratadas con siramesine 2 M sola (C).
Discusión
En este estudio, hemos identificado KIF11, KIF20A, KIF21, KIF25, MYO1G, MYH1 y TPM2 como proteínas cuya agotamiento provoca la inhibición del crecimiento y la muerte celular no apoptótica en las células cancerosas (Tabla 1). A nuestro entender, este estudio es el primero en identificar KIF21A, KIF25, MYO1G, MYH1 y TPM2 como proteínas esenciales para la supervivencia de las células del cáncer, mientras que otros tienen la muerte celular se informó anteriormente en el agotamiento de KIF11 [27], [28], [29 ] y KIF20A [30] en otras líneas celulares de cáncer. De manera similar a los hallazgos de nuestro estudio anterior que muestran que el agotamiento de KIF5B es más tóxico para las células HeLa que a las células MCF7 [31], hemos observado algunas diferencias en la sensibilidad de las diferentes líneas celulares de cáncer a los ARNip identificados. Esto puede ser debido a diferencias en los niveles de expresión de los genes diana o genes relacionados con funciones redundantes.
En particular, la expresión ectópica de Bcl-2 no para rescatar las células MCF7 de la citotoxicidad inducida por todos los siRNAs identificados excepto KIF21A siRNA. Incluso en las células KIF21A-agotado, ectópico Bcl-2 reduce la muerte celular sólo en parte de 60 a 40%. La insensibilidad a la Bcl-2 sugiere la implicación de los mecanismos de muerte celular alternativos en lugar de la apoptosis clásica. Esta idea fue apoyada fuertemente por la observación posterior que el agotamiento de las siete proteínas causó cierto grado de desestabilización lisosomales, un sello distintivo de la vía de la muerte celular lisosomal [3], [32]. Es, sin embargo, no inmediatamente obvio cómo el agotamiento de las proteínas identificadas conduce a lisosomales interrupción.
De los kinesins identificados, KIF11, también llamada proteína de huso de quinesina Eg5 o, se ha estudiado más ampliamente, especialmente en el contexto del cáncer [33]. KIF11 forma un homotetrámero que es responsable de la formación del huso durante la mitosis [18]. En consecuencia y en consonancia con otros estudios [28], [29], el agotamiento de las células MCF7 KIF11 detenidas en la fase del ciclo celular G2 /M. inhibición KIF11 También se ha informado para matar las células de carcinoma de ovario humano y de leucemia a través de la vía intrínseca de apoptosis de una manera Bcl-2 sensible a [28], [34]. Por el contrario, KIF11 siRNA causado Bcl-2-insensible muerte no apoptótica en células MCF7 que probablemente el resultado de la desestabilización de los lisosomas y la posterior liberación de las catepsinas de cisteína en el citosol. inhibición KIF11 puede desencadenar la vía de la muerte celular lisosomal también en otros tipos de células ya que el agotamiento lisosoma estabilizador de Hsp70 protege a las células de mieloma contra la citotoxicidad inducida por dimethylenastron, un inhibidor farmacológico de KIF11 [29].
De manera similar a KIF11, de KIF21A causado permeabilización excesiva lisosomal y la muerte celular. Cabe señalar que la muerte celular inducida por el agotamiento KIF21A ya comenzó ~ 50 h después de la transfección y podría por lo tanto han afectado a otros mediciones de la función lisosomal en este estudio (Tabla 1). KIF21A se une a la big1 factor de intercambio de nucleótidos guanina [35], lo que ayuda a mantener la organización del aparato de Golgi [36]. Por lo tanto, el agotamiento KIF21A podría afectar el tráfico de los componentes lisosomales desde el aparato de Golgi en el compartimento endo-lisosomal causando por ello la disfunción lisosomal. De lo contrario, prácticamente no se sabe nada acerca KIF21A y nuestros resultados alentar fuertemente un nuevo examen de su papel en las células normales y cancerosas.
El tercer quinesina identificados en nuestra pantalla, KIF20A (también llamado Rabkinesin-6, RAB6KIFL o MKlp2) se ha informado que es esencial para la citocinesis en células HeLa en las que sus resultados de inhibición en la formación de células multinucleadas [19], [37], y para la supervivencia de células de cáncer pancreático por un mecanismo que no implican el bloqueo de la citocinesis [30]. De manera similar a las células de cáncer de páncreas, células MCF7-agotado KIF20A no detención en mitosis o mostrar un fenotipo multinucleadas que sugiere que otros kinesins pueden haber tomado su función mitótica en estas células. En su lugar, KIF20A agotamiento dio como resultado la acumulación de células MCF7 en la fase G1 del ciclo celular y la muerte celular causada lisosomal. La muerte celular fue precedida por un aumento de volumen lisosomal, la actividad catepsina cisteína y la acumulación de dextrano y desestabilización de las membranas lisosómicas. Los efectos observados en el compartimiento de endo-lisosomal puede estar relacionado con otra función ya se ha informado de KIF20A, a saber, su participación en el tráfico de vesículas relacionadas con el aparato de Golgi a la membrana plasmática a través de una interacción con Rab6 [30], [38].
el agotamiento de la última kinesin identificado, KIF25, causó agregación lisosomal periférica y un aumento del volumen lisosomal, un fenotipo que se asemeja causado por drogas microtúbulos perturbar [7]. desregulado tráfico y el aumento de volumen de los lisosomas pueden haber contribuido a la permeabilización lisosomal como lisosomas agrandados son propensos a la ruptura [39]. KIF25 agotamiento también causó la formación de fibras de estrés de actina, que puede ser debido a alteraciones en la señalización Rho como ya se observó en los microtúbulos desestabilización [40]. Estas primeras pistas sobre la función de KIF25 en el tráfico lisosomal y la biología del cáncer merecen un estudio más detallado de esta persona en gran parte desconocida de la familia kinesin.
Además de los Kinesins microtúbulos que interactúan, se identificaron tres proteínas de unión a la actina, MYH1, MYO1G y TPM2, como las proteínas esenciales para la supervivencia de las células cancerosas. MYH1, también llamada miosina de cadena pesada de 2 × (-MyHC-2X), es parte del sarcómero en las fibras del músculo esquelético rápido [41]. Sus funciones en las células no musculares son prácticamente desconocidas, pero pueden ayudar a organizar las fibras de actina y con ello afectar el tráfico dependiente de actina o fondeadero orgánulo. De acuerdo con esto, las células MCF7-agotado MYH1 mostraron un aumento en las fibras de estrés de actina y la agregación lisosomal periférica acompañados de un compartimento lisosomal expandido y permeabilización lisosomal. Además, el agotamiento MYH1 causó inhibición de la degradación de la autofagia y la acumulación de vacuolas autofágicos iniciales indicativos de la fusión autofagosoma-lisosoma defectuoso, que puede ser debido a la mala colocación de los lisosomas
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El segundo miosina identificado, MYO1G, se enriquece en la membrana plasmática de las células hematopoyéticas donde se ha sugerido para mejorar la elasticidad celular [42], [43]. Como otros miosinas de clase I [15], MYO1G también pueden estar involucrados en el tráfico de vesículas. Sin embargo, ni la localización lisosomal ni acumulación de dextrano cambiado en células MYO1G-agotado, y los otros efectos lisosomales eran más suaves que después de la depleción de los otros éxitos identificados. MYO1G agotamiento tenía, sin embargo, un fuerte efecto inhibidor sobre el flujo de autofagia, lo que podría ser el resultado de los cambios observados en las fibras de actina. Recientemente, se encontró MYH9 /NMHC-II A de estar involucrado en la formación de autofagosoma durante la hambruna [44], y nuestros resultados indican que el papel de myosins adicionales, especialmente MYH1 y MYO1G, en la autofagia debe investigarse más.
la única proteína no automotor identificado en nuestra pantalla era TPM2, que forma filamentos a lo largo de las fibras de actina y controla la contracción muscular mediante el bloqueo de la interacción actina-miosina. En las células no musculares, TPM2 y otros tropomyosins se cree que para estabilizar los filamentos de actina y regular las funciones de actina, incluyendo la motilidad celular y de orgánulos y el transporte de vesículas [16]. TPM2 agotamiento causado la agregación lisosomal periférica que indica que TPM2 puede, de hecho, la función en el tráfico dependiente de actina lisosomal. Esto es consistente con los datos que muestran que la microinyección de anticuerpos TPM1 y TPM2 inhibe el transporte de gránulos intracelulares [45].
lisosomales cambios deletéreos observados en el agotamiento de KIF25, TPM2 y MYH1 pueden estar relacionadas con su aparente función en lisosomal el tráfico, pero sigue siendo menos claro cómo la baja regulación de las otras proteínas perturbado lisosomas. Es posible que su agotamiento tuvo efectos sutiles sobre la trata lisosomal, tales como cambios en el tráfico de corto alcance de los lisosomas o el tráfico de una subpoblación lisosoma, que no eran detectables con los métodos utilizados. Por otra parte, el transporte de lípidos o proteínas que promueven la integridad lisosomal, tales como proteínas de la membrana lisosomal, Hsp70 y esfingomielinasa ácida [5], [23], podría haber sido alterado. De forma más indirecta, su agotamiento puede causar cambios en el citoesqueleto que dañan a otros orgánulos celulares y por lo tanto activan cascadas de señalización que activan la permeabilización lisosomal.
Las proteínas identificadas pueden ser dianas adecuadas para la terapia del cáncer como las células cancerosas se sensibilizan a la muerte celular lisosomal [ ,,,0],4], [5]. Varios inhibidores de KIF11, que se regula positivamente en una amplia gama de cánceres (Oncomine, http://www.oncomine.org), ya están en ensayos clínicos como fármacos contra el cáncer [9], y un inhibidor de KIF20A ha sido recientemente identificado [46]. Estos inhibidores se desarrollaron como bloqueadores mitóticas, pero nuestros resultados indican que su actividad anti-cáncer puede también resultar de la interrupción lisosomal. También encontramos que el agotamiento de los siete hits mejorada la toxicidad de la foto-oxidación y de los fármacos lisosomas interrumpir siramesine, etopósido y cisplatino. Se observó sinergismo fuerte con todos los medicamentos después de la depleción de KIF11, KIF21A y TPM2 mientras regulación a la baja de las otras proteínas fue sinérgica solamente con algunos de los medicamentos, posiblemente reflejando las diferencias en el mecanismo de interrupción lisosomal o la captación del fármaco. En consecuencia, la combinación de la inhibición de la proteína motor con otros tratamientos lisosomas interrumpir parece ser una estrategia prometedora para la terapia del cáncer. Esto es especialmente debe ser probado para los inhibidores de KIF11 ya disponibles, que tienen solamente modestos efectos anticancerígenos como agentes únicos [9].
Además de las conexiones de cáncer estudiados aquí, nuestros resultados proporcionan pistas sobre la etiología de la