Extracto
Antecedentes
La rata topo desnuda (RMN) es una especie resistente de larga vida y el cáncer. Identificación del potencial contra el cáncer y los mecanismos relacionados con la edad es de gran interés y hace que esta especie eminentes para investigar las estrategias contra el cáncer y comprender los mecanismos de envejecimiento. Puesto que se sabe que la RMN expresa más altos de ARNm de hígado-niveles de alfa 2-macroglobulina que los ratones, no se sabe nada acerca de su nivel de estructura, funcionalidad o expresión en la RMN en comparación con el A2M humana.
Resultados
a continuación mostramos un análisis exhaustivo de RMN- y plasma humano A2M, que muestra una predicción diferente en la glicosilación de RMN-A2M, lo que resulta en un mayor peso molecular en comparación con A2M humana. Además, se encontró una mayor concentración de A2M (8,3 ± 0,44 mg /ml
vs
. Y 4,4 ± 0,20 mg /ml) y un contenido total inferior a proteínas plasmáticas (38,7 ± 1,79 mg /ml
vs
. 61,7 ± 3,20 mg /ml) en comparación con NMR humano. RMN-A2M puede ser transformado por metilamina y tripsina lo que resulta en un cambio conformacional similar a A2M humana. RMN-A2M es detectable por un anticuerpo policlonal contra A2M humana. Determinación de la actividad tríptica y anti-tríptica de plasma NMR y humano reveló una actividad anti-tripsina superior del plasma RMN. Por otra parte, se encontró que menos actividad proteolítica en el plasma de RMN en comparación con el plasma humano.
Conclusión
Encontramos transformados RMN-A2M unión a su receptor específico LRP1. Podríamos demostrar la expresión de proteínas inferior de LRP1 en el tejido hepático de RMN en comparación con la expresión humana pero mayor de A2M. Esto fue acompañado por una expresión de la proteína EpCAM superior como la molécula de adhesión central en la progresión del cáncer. RMN-plasma fue capaz de aumentar la adhesión en fibroblastos humanos
in vitro
más probablemente por el aumento de expresión de la proteína CD29. Este es el primer informe, demostrando similitudes así como las diferencias claras entre A2M en plasma NMR y humano. Esto podría estar directamente relacionado con el fenotipo intrigante de la RMN y sugiere que A2M probablemente podría desempeñar un papel importante en la lucha contra el cáncer y los mecanismos anti-envejecimiento en la RMN
Visto:. Thieme R, S Kurz, Kolb M, Debebe T, Holtze S, Morhart M, et al. (2015) Análisis de la alfa-2 macroglobulina de la de larga duración y resistente al cáncer rata topo desnuda y plasma humano. PLoS ONE 10 (6): e0130470. doi: 10.1371 /journal.pone.0130470
Editor Académico: Klaus Roemer, Universidad de la Escuela de Medicina Sarre, Alemania |
Recibido: 10 Marzo, 2015; Aceptado: 20-may de 2015; Publicado: 23 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Thieme et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación: Este trabajo fue apoyado por becas de la Europäischer Sozialfond - www.esf.de FSE (100098250) para GB.. Este trabajo fue apoyado por becas de la Asociación Leibniz (SAW 2012) www.leibniz-gemeinschaft.de/a MP
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La rata topo desnuda (
Heterocephalus glaber
) (RMN) que viven en el este de África es un mamífero construcción de colonias eusocial (O'Rianin et al., 2008 Ecología de la Evolución Social). De esta manera, eusocialidad se ve sobre todo con los insectos como las hormigas, abejas, avispas y otros, la RMN es uno de los mamíferos -principalmente eusocial conocidos raras descritas hasta ahora sólo en la familia
Bathyergidae
. RMN tiene algunas características inusuales en comparación con otros mamíferos. La RMN es una especie de roedores muy vivido largo, que tiene una vida útil de más de 30 años [1]. Esto sugiere mecanismos específicos de envejecimiento, que van acompañados o potencialmente causada por la resistencia del cáncer. Hasta el momento, no hay tumor se observó alguna vez en la RMN [2]. Hay una fuerte evidencia de que la longevidad de RMN se mantiene principalmente por la resistencia del cáncer, ya que la neoplasia es la primera causa de muerte en otras especies de mamíferos como ratones [3]. Hay un interés creciente para llevar en línea de la longevidad y la resistencia del cáncer mediante la identificación de los mecanismos moleculares subyacentes a entender los fenotipos de RMN más fascinantes y extraordinarias.
Antes, un puñado de artículos habían sido publicados, dando consejos y ensayos para explicar esos mecanismos en la RMN [4-8]. De esta manera las características sociales y biológicos /bioquímicos se producen aductos. Desde un punto de vista social el modo eusocial de la vida con un cuidado cooperativo de la descendencia y la propagación de las competencias entre las generaciones [2], así como la vida en grupo es ampliamente asociado con una vida más larga [9]. Otro efecto apoyo a la salud se asocia con la vida subterránea. Esos animales están protegidos de los depredadores y condiciones climáticas extremas, lo que favorece la longevidad y una menor tasa de mortalidad [2, 10]. En el nivel celular y bioquímica RMN exhiben varias características únicas antitumorales como el crecimiento celular lento, la inhibición por contacto eficaz, la formación de ácido hialurónico de alto peso molecular en masa y la síntesis de proteínas optimizada [11].
Alfa-2 macroglobulina ( A2M) es una proteína extracelular importante en la sangre. Recientemente, se demostró que los niveles de transcripción A2M que aumentarse en el hígado de RMN en comparación con la de los ratones de 140 veces [12]. Hasta ahora, la proteína de RMN-A2M no se caracteriza más. Su homólogo humano es una proteína homotetramérica de 720 kDa que juega un papel en el mantenimiento de la homeostasis de citoquinas y factores de crecimiento [13]. La función de A2M en los seres humanos es en parte diferente en comparación con los roedores (por ejemplo ratones, ratas y conejos), donde A2M es una importante proteína de fase aguda [14]. En general, A2Ms de diferentes especies están muy bien descritos y caracterizan brevemente en una revisión por Sottrup-Jensen [15]. A2M humana es capaz de unirse a una gama muy amplia de citoquinas, factores de crecimiento, especialmente TGF-ß1, TNF-alfa e IL-1ß y hormonas [16-18]. Otra función importante es la capacidad de inactivar una gran variedad de proteinasas, como la tripsina, quimotripsina, elastasa o metaloproteinasas. Tras la unión de proteinasas, A2M sufre un cambio conformacional importante, lo que resulta en la expresión de sitios de unión del receptor previamente ocultos en su superficie. Esto permite que el llamado "A2M transformado" (A2M *) para unirse a su receptor específico, llamado LRP1 (CD91) [19, 20]. La ligación de LRP1 induce la rápida eliminación mediada por el receptor de los A2M-proteinasa-complejos de la sangre y el tejido [21]. Otras proteínas tales como factores de crecimiento y citocinas se unen reversiblemente a A2M. De este modo, A2M cumple funciones importantes respecto de la homeostasis de los tejidos de esas moléculas [22, 23]. Se sugiere
A2M para jugar un papel importante en el cáncer y el envejecimiento [24, 25]. La concentración en sangre A2M humana se correlaciona negativamente con la edad, la disminución de aproximadamente 4 mg /ml a luz a 1,5 mg /ml en las personas de edad [26]. Por lo tanto, su función en la homeostasis de la sangre y las enfermedades relacionadas con la edad son de gran interés clínico y geriátrico. principales factores responsables de la malignidad implican también adherencias moléculas. Puesto que se sabe que la RMN es resistente cáncer, son de interés perjudicial y se justifica un análisis más profundo de la adhesión de la expresión de moléculas y la función en el RMN. Por ejemplo, se encontró que el nivel de transcripción de la epitelial EpCAM molécula de adhesión que aumentarse en el hígado NMR por 290fold comparación con los ratones, lo que proporciona una fuerte evidencia, que la coherencia y la integridad celular se ve influenciada por la expresión de moléculas de adhesión [12].
en el presente estudio, se analizaron A2M plasma de RMN en comparación con su homólogo humano. Por primera vez, hemos podido demostrar un nivel de proteína plasmática elevada de RMN-A2M y similitudes, así como diferencias distintivas de la estructura molecular y la función en comparación con A2M humana. Además, hemos encontrado sorprendentemente plasma NMR para aumentar la adhesión celular en fibroblastos humanos. Además, describimos y anotado la RMN-A2M en consecuencia a la proteína humana-A2M con modificaciones posteriores a la traducción y podríamos identificar similitudes y diferencias, lo que podría desempeñar un papel en peculiaridades relacionadas con RMN.
en silico análisis de secuencia
búsqueda de secuencias de RMN-A2M en las bases de datos pertinentes resultó en dos secuencias de ARNm disponibles. El primero (Ref.Seq .: NM_001279851.1; Uniprot: E3VX34_HETGA) fue descrito por Szafranski et al. (Entrada de base de datos) y un segundo se predijo mediante secuenciación genómica del genoma RMN (GenBank: JH171302.1; UniProt: G5BPM1_HETGA) [27]. Sólo la transcripción de RMN-A2M había sido verificada y se ha descrito hasta el momento. La existencia de la proteína de RMN-A2M solamente se predijo. La secuencia de RMN-A2M produjo 1475 (Uniprot: E3VX34_HETGA) y 1595 ácidos [27] amino, respectivamente, resultando en una masa molecular calculada de 162.519 kDa y 175.364 kDa, respectivamente. Comparando estos resultados con la secuencia de A2M humana, la secuencia descrita por RMN Szafranski et al. (2010) es más parecida a la de Kim et al. (2011). Por lo tanto, todos los siguientes análisis se realizaron con la secuencia de RMN-A2M más similar en comparación a la humana (UniProt: E3VX34). (Tabla 1)
RMN-A2M tiene una identidad global ARNm de 85% y una similitud de la secuencia de proteína de 98% a A2M humana. El análisis filogenético por ClustalW2 dado lugar a una estrecha relación de la RMN-A2M de rata topo de Ansell y conejillo de Indias A2M (figura 1).
La A2M humana, así como la RMN-A2M tienen una secuencia de péptido de señalización (AA posición 1-23) en el extremo N-terminal, que fue anotado por similitud. La región de cebo, que es una característica de A2M en todas las especies, está situado en la RMN en la posición 688 a 738. Contiene tres sitios de escisión de tripsina a de la arginina 703, 711 y 729 (Tabla 2). El análisis de los sitios de N-glicosilación resultó en 10 ácidos potenciales de N-glicosiladas amino en la posición 55, 70, 263, 396, 410, 870, 992, 1078, 1367 y 1427. De esta manera, las acciones de RMN-A2M 7 N -glycosylation sitios con el A2M humano, que tiene ocho predijeron sitios de N-glicosilación. El sitio de N-glicosilación en la posición 247 de la A2M humana no está presente en la RMN-A2M. Todos los puentes disulfuro en la A2M humana se identifican en la RMN-A2M por similitud (Tabla 2). El potencial iso-glutamil lisina isopeptide reticular en la posición 693 en el A2M humana se puede encontrar en el RMN-A2M en la respectiva posición 694 (Tabla 2). La Cys972 y Gln975 responsable de la unión en el A2M humana tioléstser se encuentran en la posición Cys973 y Gln976 en el RMN-A2M
El análisis filogenético de las secuencias de proteínas A2M se realizó utilizando el ClustalW2 onlinetool (https: //www. .ebi.ac.uk /Herramienta /filogenia /clustalw2phylogeny). Las secuencias de la proteína A2M en comparación eran lectura de la base de datos Uniprot.
Plasma composición
Se realizaron diferentes variaciones de la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) para investigar la distribución de las proteínas de la plasma NMR, en general, y la presencia de rasgos característicos de la RMN-A2M en particular
.
electroforesis en gel de gradiente de poliacrilamida nativa (PAGE nativa) mostró RMN-A2M para funcionar en una posición que parece tener una movilidad eléctrica inferior a A2M en el plasma humano y A2M humana purificada, lo que podría indicar una masa molecular más alta (Fig 2A). Nativo A2M humana es un tetrámero con una masa molecular de 720 kDa. El uso de SDS en gradiente PAGE (4-20%) en condiciones no reducidas RMN-A2M mueve como un dímero con una masa molecular aproximada similar a A2M humana (360 kDa) (Fig 2B). Bajo condiciones reducidas RMN-A2M se escinde a monómeros de 180 kDa similares a A2M humana (Fig 2C). Además, se encontró que la concentración total de proteína del plasma de RMN a ser menor que en el ser humano (38,7 ± 1,79 mg /mL
vs
61,7 ± 3,20 mg /mL;. N = 5) (Fig 2D). El plasma humano parece contener un mayor contenido de inmunoglobulinas (Fig 2A y 2B) y el patrón de proteínas en general parece ser diferente, también. RMN en contraste con plasma humano muestra diferentes bandas de proteínas (distancia entre Alb y IgG) en no reducido SDS-PAGE (entre el marcador 43 kDa y 212 kDa). Al menos en el plasma humano, variantes genéticas de proteínas haptoglobin- y Gc grupo se mueven en esta posición. No obstante, un análisis global de los tres tipos diferentes de electroforesis muestra fuertes intensidades de banda de A2M en el plasma de RMN en comparación con el plasma humano, lo que indica un mayor contenido de A2M en RMN.
NMR, plasma humana (30μg) y se purificó A2M humana (2.5μg) se separaron mediante PAGE nativo (4-20%) (A) y SDS-PAGE (4-20%) en condiciones no reductoras (B) y la reducción de las condiciones de (C). La concentración de proteína de plasma humano de RMN y se determinó según Bradford (** - P & lt; 0,01) (D). Los extractos de proteína a partir de hígado humano y de RMN (20 g cada uno) fueron separados por SDS-PAGE (4-20%) (E) y se sometieron a análisis de transferencia de Western usando anticuerpo A2M un policlonal de conejo anti-humano (5 mg /ml) y una monoclonal de ratón ß-subunidad específica de anticuerpos anti-LRP1 humana (10μg /ml) (F). (A2M alfa-2 macroglobulina, Alb-albúmina, inmunoglobulina IgG, TRF-transferrina).
La proteína más abundante en el plasma RMN es la albúmina como en el plasma humano. La transferrina con una masa molecular de 80 kDa en los seres humanos era menos migratorio en RMN, lo que indica diferentes masas molares o variaciones en la glicosilación.
Las proteínas y análisis de inmunotransferencia de extractos de hígado de RMN y los seres humanos revelaron un alto número de masa molecular baja proteínas para ambas especies. Una diferencia notable es la aparición de una especie de proteína de alta masa molecular en RMN del hígado (Fig 2E). Esta banda de proteína se demostró reaccionar con anticuerpos contra A2M humana por Western blot (Figura 2F) que muestra una mayor cantidad de proteínas en el extracto de hígado A2M RMN que en humano. En contraste, se detectó una menor cantidad de LRP1 inmunorreactiva en el extracto de hígado humano en comparación con RMN (Figura 2E).
activación A2M
A2M se sabe que se produce en dos estados conformacionales diferentes. La unión de proteinasas, resulta en un cambio conformacional hacia una estructura más compacta de la proteína.
In vitro
, tal transición conformacional de A2M se puede obtener también por el tratamiento de A2M con metilamina, que se conoce para escindir enlace tioéster de A2M y por lo tanto provocando un cambio conformacional importante similar al tratamiento con proteinasa. El cambio conformacional puede ser visualizado por el llamado-PAGE tasa (Fig 3A). Este método permite la discriminación entre las dos formas diferentes de A2M, la desaceleración (forma nativa) y la rápida migración (forma activada con el enlace tioéster escindido) la forma, que se dice que es causada por cambios en globularity [28]. La unión de tripsina, así como la reacción con metilamina mostró patrón de movimiento similares, dependiendo de la integridad de la cambio conformacional, en tanto, RMN y plasma humano. En general, A2M de RMN mostró ser reactivos con metilamina y tripsina mostrando de esta manera las propiedades funcionales similares a los de su análogo humano. Sin embargo, la convertibilidad conformacional parece ser más compleja en la RMN-A2M se indica por la aparición de bandas de proteínas entre las posiciones de las formas lentas y rápidas de A2M humana.
electroforesis TASA se realizó utilizando 50 mg nativa y RMN plasma humano y 50 g de metilamina y plasma tratado con tripsina, respectivamente. A2M humana aislada sirvió como control. Metilamina, así como desplazamiento humano tripsina y RMN-A2M de la desaceleración de la forma en rápido movimiento. Para visualizar las bandas de proteínas respectivas se tiñó el gel con Coomassie (A). LRP1 purificado (100 a 500 ng) fue descubierto a una membrana de nitrocelulosa y se incubaron con 10 mg /ml humano o plasma de RMN. BSA sirve como control negativo. A2M unión a LRP1 se detectó mediante un anticuerpo policlonal de conejo anti-humano A2M (5 mg /ml) (B). Para bloquear la unión de A2M a LRP1 el LRP1 manchado se pre-incubó con 1,5 M RAP para 30 min antes de la adición de plasma humano o NMR (C). (☐ - forma nativa /lenta de A2M, ◆-transformado /forma rápida de A2M).
A2M A2M de unión de RMN y de plasma humano
receptor
Humano A2M * (transformado ) es conocido para unirse específicamente a LRP1 soluble o inmovilizado. Para que LRP1 humana purificada fue descubierto a una membrana de nitrocelulosa y se incubaron con plasma humano o RMN, respectivamente (Fig 3B). Como se ve, A2M * desde ambas especies se unen al receptor inmovilizado indica la presencia de dominios de unión al receptor en RMN-A2M. En contraste, no se observó unión a la albúmina inmovilizada corroborando la especificidad de la interacción. El receptor de la proteína asociada-RAP es conocido para bloquear la unión de diversos ligandos a LRP1. De hecho, se encontró que RAP para disminuir la interacción de RMN-A2M * a LRP1 (figura 3C). Los resultados indican que A2M de NMR contiene región conservada en el dominio C-terminal capaz de unirse a LRP1 humana.
cuantificación A2M y detección inmunológica
A se usó SDS-PAGE 7% para evaluar la concentración de A2M en plasma de RMN y humano. Purificada A2M humano sirvió como estándar interno. Los geles de Coomassie azul fueron teñidos escaneados y analizados utilizando el software ImageJ. 30 g de RMN y de proteína de plasma humano, respectivamente, se cargaron a los geles. La generación de una curva estándar con purificada A2M humana, la concentración A2M calculado en plasma de RMN y de humano fue de 8,3 ± 0,44 mg /ml y 4,4 ± 0,20 mg /ml, respectivamente (n = 5). Correspondientemente, A2M representa 6,9 ± 0,37% de contenido total de proteínas de plasma en los seres humanos y 15,3 ± 0,70% de contenido total de proteínas de plasma en la NMR (Fig 4A). Además, la inmunorreactividad de RMN-A2M se comprobó usando el anticuerpo un ratón monoclonal específico conformación anti-humano A2M (alfa-1), conocido para reconocer un epítopo espacial C-terminal expuesto sólo en transformado A2M (Fig 4B) y un conejo policlonal anticuerpo anti-humano A2M (Fig 4C). Para probar el anticuerpo monoclonal, las muestras se corrieron en geles de gradiente obligatoria nativas antes de la transferencia, porque SDS es conocido para modificar la estructura espacial de A2M. Como se ve, el anticuerpo monoclonal detecta la transformada humana A2M (A2M *), pero no se observó reactividad hacia RMN-A2M (Fig 4B). Por otro lado, el anticuerpo policlonal de conejo detecta como era de esperar humana, así RMN-A2M (Fig 4C), este último con reactividad obviamente inferior debido a que aproximadamente 3Fold se necesita la cantidad de RMN-A2M de plasma para obtener una intensidad de señal inmunológica comparable como con A2M humana (Fig 4C). Estos resultados corroboran los datos obtenidos por análisis densitométrico de las bandas de proteínas teñidas (Fig 4A).
La determinación de A2M en muestras de plasma se realizó por electroforesis en 7% de SDS-gel usando RMN y de plasma humano, 30 mg cada y A2M humana purificada (1 a 2,5 mg). A2M se cuantificó por tinción con Coomassie usando aislado A2M humana para preparar una curva de calibración (A). análisis de Western blot utilizando un gradiente de PAGE nativa (4-20%) se aplicó para detectar la forma transformada de A2M utilizando el anticuerpo alfa-1 (B) y un 7% no reductor SDS-PAGE para detectar A2M con un anticuerpo policlonal usando 9 y 3 g de RMN o 3 mg plasma humano y 250 ng aislado A2M humana (C).
anti-proteolítica y la actividad proteolítica de plasma humano
y RMN
plasma de todos los mamíferos y lo más probable RMN contiene diferentes inhibidores de proteinasa y enzimas proteolíticas implicadas en las rutas específicas como la coagulación de la sangre /fibrinolisis y el sistema del complemento o servir funciones generales. Se sabe que se une e inactiva A2M proteinasas de todas las clases y especificidades. Por lo tanto, era de interés para analizar la actividad anti-proteolítica de plasma entero mediante el uso de tripsina como enzima de referencia. La capacidad de tripsina inhibidora se midió mediante el cálculo de la cantidad de plasma capaz de inhibir 0,05 g de tripsina. Como se muestra en la figura 5, la capacidad inhibidora en un menor contenido de proteína (2,5 a 20 mg) fue mayor en humanos que en el plasma de RMN, representada por la IC
50 de 17,08 g de humano y 25,11 g de plasma de RMN. Sin embargo, a concentraciones de proteína de plasma más altas se observó una actividad inhibidora global superior en el plasma de RMN en comparación con el plasma humano. Hubo actividad tríptico menos residual en el plasma RMN (8,06%) en comparación con el plasma humano (17,22%) mediante el uso de proteínas de plasma de 100 mg para inhibir 0,05 mg de tripsina (Figura 5A y 5B).
La inactivación de 0,05 g tripsina se valoró con cantidades crecientes de plasma NMR (B) correspondiente a 1 a 100 g de proteína humana (a) o y se mide por la conversión de BAPNA de p-nitroanilina a 405 nm. La actividad tríptica intrínseca de plasma NMR y humano se determinó midiendo la conversión de BAPNA de p-nitroanilina inducida por 1-100 proteína plasmática g (C). (* P & lt; 0,05) guía empresas
La actividad proteolítica intrínseca de plasma humano y de RMN se determinó mediante la escisión del BAPNA a la p-nitroanilina. RMN de plasma tiene una actividad proteolítica endógena significativamente menor que el plasma humano (Figura 5C). Reflejando 100 g plasma NMR menos proteolíticamente activo (aproximadamente 40%) que la cantidad equivalente de plasma humano. Esto podría ser explicado por la mayor concentración del inhibidor de proteinasa principal A2M.
Las moléculas de adhesión en tratamiento RMN-A2M
Los datos de secuenciación de nueva generación ya se ha indicado una alta expresión de moléculas de adhesión en el hígado RMN [12 ]. Podríamos corroborar estos resultados a nivel de proteínas y se encontró más alta expresión de la proteína EpCAM en el extracto de hígado humano en comparación con RMN (Figura 6A). Siguiente la hipótesis de que los componentes del plasma NMR pueden modular la expresión de moléculas de adhesión celular y por lo tanto la adhesión celular. Por lo tanto, analizamos la propiedad de adherencia de los fibroblastos humanos cultivados en un ensayo de tripsinización-adhesión llamada. El medio de cultivo de fibroblastos humanos se complementó con plasma NMR 0,3 o 1%. La suplementación con PBS o plasma humano 1% sirvieron como controles. Se observó un aumento significativo en la adhesión celular a la suplementación con 1% RMN plasma (Fig 6B). Para orientar la pregunta, que las moléculas de adhesión podrían ser responsables de la mayor adhesión, se analizaron CD29, CD44 y EpCAM mediante análisis de transferencia western en los controles y en 0,3 y 1% de plasma NMR trataron fibroblastos humanos. Se observó un aumento en la cantidad de proteína CD29 cuando los fibroblastos fueron tratados con plasma de RMN 0,3 y 1%. Por otro lado, los niveles de CD44 no cambiaron con el mismo tratamiento. EpCAM se expresó en una cantidad muy baja en los fibroblastos pero redujo aún más en tratamiento plasma RMN (figura 6C).
La determinación de la proteína EpCAM en muestras de hígado de RMN y humanos se analizaron por electroforesis en SDS-10% gel utilizando 20 g de proteína en combinación con inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-EpCAM humana de ratón monoclonal (a). Los fibroblastos humanos se cultivaron en medio suplementado con plasma NMR 0,3 o 1% durante 24 horas y, los controles se complementaron con PBS (CTR) o plasma humano 1% (hu)), respectivamente. Las células fueron tratadas por una solución de tripsina /EDTA durante exactamente 1 min, se lavaron y las células adherentes restantes fueron teñidas por la solución de Gentiana. La absorbancia del colorante liberada es directamente proporcional al número de células adherentes (B) (** - P & lt; 0,01; * - 0,05). El análisis de transferencia Western de CD29, CD44, EpCAM y GAPDH se llevó a cabo por electroforesis en 8% SDS-gel usando 10 a 25 g de proteína después de la suplementación plasma 0,3 o 1% de RMN durante 24 h. CD29, CD44, EpCAM y GAPDH se detectaron con anticuerpos monoclonales respectivos (C).
Discusión
En el presente estudio se realizó un análisis comparativo de los componentes del plasma de la larga vida RMN de roedores con la de los seres humanos. Debido a varias peculiaridades de la RMN, como la resistencia al cáncer y la longevidad de estas investigaciones son de gran interés científico. De nuestros resultados sugieren que algunas características distintivas podrían al menos en parte, explicar las propiedades inusuales de la RMN.
Recientes análisis de la expresión génica en el hígado de los ratones que demuestra RMN y 660 genes sobreexpresados significativamente 5fold [12]. La mayor expresión prominente estaba relacionada con la proteinasa A2M inhibidor de plasma y proteínas implicadas en la interacción célula-célula y el mecanismo de defensa ROS. Para dilucidar los mecanismos resistentes de cáncer se compararon dos especies de larga vida, la RMN y los seres humanos, para ilustrar posibles mecanismos anticancerígenos para el bienestar humano.
En un estudio anterior hemos demostrado que el envejecimiento se acompaña con una significativa disminución del nivel de A2M en la sangre [26]. En la actualidad, numerosos estudios describen la función destacada de A2M en la regulación de la homeostasis celular y tisular. Esta proteína es único, ya que inhibe las proteinasas de todas las clases, está involucrado en el metabolismo de los factores de crecimiento y citoquinas relacionadas con la enfermedad y en la patogénesis de diversas enfermedades tales como cáncer, enfermedad de Alzheimer, la infección y la inflamación [24, 29-31] .
Estos resultados nos llevó a centrarse en el análisis de las propiedades estructurales y funcionales de A2M de ambas especies basándose en la hipótesis de que los datos de RMN pueden proporcionar contribuciones sustanciales para identificar las estrategias contra el cáncer en los seres humanos.
Varias funciones de A2M están mediadas a través de la unión a su receptor, LRP1. Esta enorme proteína de transmembrana (600 kDa) está implicada en la patogénesis de la aterosclerosis, la migración de células de cáncer y la invasión, el metabolismo de lípidos, así como liquidación de Alzheimer ß amiloide [32-35]. LRP1 se une a más de 30 diferentes ligandos y muestra el sistema de despacho más rápido y más eficaz de ligandos de proteínas de la sangre y los tejidos. Recientemente, se ha demostrado que las formas de leptina complejos con A2M y se elimina de la sangre por endocitosis mediada por receptor a través de LRP1. La simulación por ordenador de esta interacción ternaria reveló que la concentración estacionaria de la leptina en plasma se ve fuertemente afectado por el nivel de A2M [36]. Esto es de importancia debido a otros factores de crecimiento como el TGF-ß1 y VEGF causalmente involucrados en la progresión del tumor también se unen a A2M y se borran por el mismo mecanismo. Además, LRP1 actúan como co-receptor para numerosos receptores de señal que implican en la vía Wnt /ß-catenina, el sistema uPA /uPAR y otros [37]. Como un importante inhibidor de metaloproteinasas y regulador del sistema activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) en el cáncer asociado a un tumor, A2M controla la migración de células tumorales y la invasión [38]. Estos pocos ejemplos pueden mostrar la importancia del eje de A2M-LRP1 en la regulación de la homeostasis de los tejidos y la sangre.
Por primera vez, hemos identificado A2M en RMN por comparación directa con A2M humana y por métodos inmunológicos. Se encontró que el plasma RMN contiene aproximadamente de dos a tres veces más alto nivel de A2M en comparación con el plasma humano. Prueba de reactividad cruzada de RMN-A2M con un panel de anticuerpos monoclonales anti-A2M humanos pero no hemos podido ver ninguna reactividad. Incluso la unión al receptor-dominio (RBD) de anticuerpos específicos, la alfa-1, se sabe que reaccionan solamente con A2M transformado, no mostró ninguna unión. Recientemente, hemos encontrado que este anticuerpo reconoce las secuencias de péptidos de consenso, S1349-R-S1351 ... D1330-E-P-K1333, dos epítopos separados que comprenden un epítopo conformacional en el RBD de A2M humana [39]. La ausencia de unión a RMN-A2M fue más probablemente debido a los amino intercambios de ácido dentro del epítopo de división para N1350-R-P1352 ... D1331-GP-K1334 en RMN, en sustitución de 3 de 7 aminoácidos en las posiciones 1, 3 y 5 de la epítopo. En contraste, la unión de RMN-A2M a su receptor específico (LRP1) como probado experimentalmente era de esperar, ya que los dos residuos de lisina esenciales en la posición 1395 y 1402 (NMR: Lys1393 y Lys1400) y la lupa estabilización Cys1355 y Cys1471 de humano A2M (RMN: Cys1353 y Cys1368) están presentes en la RMN-A2M [40]. El predijeron ocho hojas beta y una hélice alfa se pueden encontrar por similitud en la RMN-A2M [20]. La mayoría de las estructuras que se encuentran en el A2M humano también estaban presentes en la RMN (puentes disulfuro, N-glicosilación, cebo-región, sitios de unión a tripsina). Sin embargo, la predicción de los sitios de N-glicosilación en la RMN-A2M reveló dos sitios adicionales (Tabla 2). Mientras que la A2M humana tiene 8 sitios de N-glicosilación, la proteína tiene NMR 10. Esto podría ser una explicación para el mayor peso molecular de RMN-A2M visto en la PAGE nativa (Fig 1A), ya que esto no puede ser explicado únicamente por la RMN-A2M composición de aminoácidos. Sin embargo, también otras modificaciones, como la O-glicosilación puede contribuir a este fenómeno, ya que juntas glycosylations son las modificaciones que se producen en su mayoría y más complejos en los eucariotas con un modo específico de la especie.
Un posible mecanismo responsable de la extrema resistencia cáncer en RMN se demostró anteriormente [5]. Se identificó un hialuronano de alto peso molecular en masa (HA), que es secretada por los fibroblastos de RMN, pero no por los fibroblastos de seres humanos o ratones. Mientras estas células producidas HA se les impidió malignidad. El derribo de la enzima sintetizadora de HA (HAS2) o sobreexpresión de la enzima degradante (HYAL2) dio como resultado el aumento de la malignidad de los fibroblastos de RMN. La textura, la composición y la estabilidad de la matriz extracelular están determinando características distintivas en la malignidad. El principal receptor de HA en el ratón humano y es CD44. El bloqueo de CD44 hizo que las células cultivadas de RMN para crecer más rápido [5]. Recientemente, se demostró que LRP1 se une a CD44 y por lo tanto regula las propiedades adhesivas de las células tumorales [41]. Nuestros resultados que RMN-A2M se une a LRP1 y que esta unión fue interferido por RAP puede arrojar luz sobre el posible papel de A2M en esta interacción. El cultivo de fibroblastos humanos con 1% de plasma de RMN mostró un aumento en la adhesión de estas células en comparación con la adición de plasma humano. Un análisis de transferencia Western muestra CD29 para ser aumentado con la administración de suplementos plasma RMN (figura 6C). No hemos podido observar los cambios en la expresión de CD44 en los fibroblastos humanos sobre el tratamiento de RMN de plasma que explicarían el aumento observado en la adhesión celular. Una razón podría ser que las otras moléculas de adhesión celular tales como el CD29 de la integrina. La función principal de los miembros de familia de las integrinas es mediar la adhesión célula-matriz-célula y. RMN-plasma aumentó la expresión de CD29, que por lo tanto podría estabilizar estas interacciones representación de fibroblastos menos sensible a tripsinización. EpCAM (CD326) se expresa por el epitelio de los individuos sanos, pero sobreexpresa en la mayoría de los carcinomas. En la mayoría de los tumores de alta expresión EpCAM se asoció con metástasis y mal pronóstico. Sin embargo, para diferentes tipos de tumores se han reportado resultados contradictorios [42]. Sin embargo, se ha informado de que la activación de ß-catenina induce la transcripción EpCAM través de la unión de factor de transcripción TCF /Lef para el promotor EpCAM [43]. Esto es de interés, ya que podíamos mostrar que recientemente A2M inhibe la vía Wnt /beta-catenina en las células tumorales [24]. Esto podría explicar el efecto inhibidor de A2M en la expresión de EpCAM (Figura 6C).
Por lo tanto, hemos deducido que un factor principal responsable del aumento de la adhesión celular tras la exposición plasmática de RMN de los fibroblastos humanos podría ser A2M.