Extracto
Los microARN son explotados para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento del cáncer y otras enfermedades. Su alta especificidad de tejido y papel crítico en la oncogénesis proporcionan nuevos biomarcadores para el diagnóstico y clasificación de cáncer, así como los resultados de la predicción de los pacientes. Los microARN firmas se han identificado por muchos tumores humanos, incluyendo el cáncer colorrectal (CCR). En la mayoría de los casos, la enfermedad metastásica es difícil de predecir y evitar con terapias adecuadas. El objetivo de nuestro estudio fue identificar una firma de microARN para CCR metastásico que podría predecir la localización metastásica y diferenciar los órganos diana. Se analizaron los tejidos normales y cancerosas de tres grupos diferentes de pacientes con CRC. microarrays de ARN y análisis de matriz TaqMan se realizaron en 66 pacientes italianos con o sin ganglios linfáticos y /o recurrencias hepáticas. Los datos obtenidos con los dos ensayos se analizaron por separado y luego se cruzaron para identificar una firma metastásico primario CRC. Cinco microRNAs expresados diferencialmente (HSA-miR-21, -103, -93, -31 y -566) fueron validados por QRT-PCR en un segundo grupo de 16 pacientes con metástasis de América.
In situ
La hibridación se realizó en los 16 pacientes americanos, así como en tres distintas tejidos microarray comercial (TMA) que contiene colon normal adyacente, el adenocarcinoma primario, los ganglios linfáticos normales y metastáticos y en el hígado. HSA-miARN-21, -93, -103 y regulación al alza junto con hsa-miR-566 se define regulación a la baja de la firma CCR metastásico, mientras que
In situ
hibridación de datos identificado un perfil invasión linfonodales. Nosotros proporcionamos la firma primeros microARNs que podrían discriminar entre las recurrencias colorrectal a los ganglios linfáticos y el hígado y entre metástasis hepática colorrectal y tumor hepático primario
Visto:. Drusco A, Nuovo GJ, Zanesi N, Di Leva G, F Pichiorri , Volinia S, et al. (2014) Perfiles de microARN de discriminar entre cáncer de colon metástasis. PLoS ONE 9 (6): e96670. doi: 10.1371 /journal.pone.0096670
Editor: Alfons Navarro, Universidad de Barcelona, España |
Recibido: 4 Enero, 2014; Aceptado: April 10, 2014; Publicado: 12 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Drusco et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el NIH subvención U01 microRNAs CA152785 /UCR: biomarcadores de riesgo de cáncer, la detección de tumores, la progresión y tratamiento. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La principal causa de muerte en pacientes con cáncer es la enfermedad metastásica [1]. células de cáncer de difusión ha sido considerada un evento tardío de múltiples etapas durante el desarrollo del tumor. Después de que el crecimiento del tumor primario, genéticamente seleccionadas, las células malignas invaden el tejido local, entran a la sangre y /o vasos linfáticos, son transportados a lugares distantes y colonizar nuevos tejidos de órganos. Evidencias recientes sugieren que la diseminación tumoral podría ser un evento anterior que eventualmente se manifestará después de varios años a partir del diagnóstico [2] - [5]
El cáncer colorrectal es el tercer cáncer más común en el mundo desarrollado después de pulmón y de mama. cáncer: aproximadamente la mitad de los pacientes mueren de la enfermedad metastásica dentro de los 5 años desde el diagnóstico [6]. Los primeros sitios de enfermedad metastásica del cáncer colorrectal son los ganglios linfáticos regionales y el hígado. El examen anatomopatológico de adenocarcinoma de colon no puede predecir con exactitud los pacientes que presentan enfermedad diseminada a los ganglios linfáticos locales y /o lugares distantes. Sin embargo, en el colon, así como en pacientes con cáncer de mama y melanoma, la presencia o la ausencia de ganglios linfáticos invasión pueden influir en el tipo de resección quirúrgica o el tipo de régimen de quimioterapia [7] - [9].
a pesar de metástasis en el hígado a menudo provienen de los cánceres de colon, hay casos en que la metástasis es el primer y único hallazgo en pacientes con un sitio del tumor primario desconocido [10], y la distinción entre las lesiones hepáticas primarias y metástasis hepáticas de diferentes sitios posibles es de valor terapéutico y pronóstico [11].
Por lo tanto, existe una necesidad cada vez mayor de nuevos biomarcadores de diagnóstico y pronóstico que podrían discriminar entre el tumor primario y los distintos sitios de la metástasis, así como la predicción de la propensión de metástasis el tumor primario.
los microARN o miRNAs, son pequeñas (19-25 nucleótidos) ARN no codificantes, que regulan la expresión de genes mediante la supresión de la traducción del ARNm post-transcripcional, y /o causar la degradación del ARNm. Están involucrados en la regulación de la mayoría de los procesos fisiológicos [12], y se expresan de forma aberrante en la iniciación y progresión del tumor, la predicción de estado de la enfermedad y el resultado clínico [13], [14]. Curiosamente, las firmas microRNAs son altamente específico de tejido y se pueden utilizar para clasificar los cánceres, y para identificar el tumor primario de una lesión metastásica de origen desconocido [15] - [19].
El objetivo de nuestro estudio fue identificar una firma de microARN que podría permitir la diferenciación entre linfonodales y metástasis hepática en pacientes con carcinoma colo-rectal.
Materiales y Métodos
muestras de tejidos de pacientes
Tres grupos de pacientes fueron considerado en el estudio (Tabla 1).
se seleccionaron tejidos embebidos en parafina procedentes de 66 pacientes con diagnóstico de carcinoma de colon de la la Universidad de Roma "la Sapienza", ed UOC Anatomia Patologica Istologia C /Cardiovascolare, banco de tejidos de acuerdo a la estadificación TNM.
de los 66 pacientes, 18 presentaron un tumor primario de colon con sin metástasis (Cualquier T, N0, M0), 33 tenían cáncer de colon con metástasis en los ganglios linfáticos única (cualquier T, cualquier N, M0) y 15 fueron diagnosticadas con cáncer de colon, ganglios linfáticos y metástasis hepáticas (cualquier T, cualquier N, M1). Se recogieron muestras tumorales separados del tumor primario, los ganglios linfáticos metastásicos y la metástasis hepática para cada paciente y se procesaron para microarrays de tejidos y TaqMan Arrays MicroARN Tarjetas
.
Un segundo grupo de 16 pacientes procedentes de los archivos de la OSU Departamento de Patología se inscribieron en el estudio. Para cada paciente, el tejido normal del colon, adenocarcnoma primario de colon, los ganglios linfáticos metastásicos y metástasis al hígado fueron analizados, así como los correspondientes ganglios linfáticos y el hígado normal, cuando esté disponible. El TMA que se ha generado a partir de estas muestras de pacientes más tres conjuntos de matrices de tejido de EE.UU. Biomax (BN05014 con 24 casos, BC05118 con 50 casos, CO702 con 69 casos) se utilizaron para la hibridación in situ (ISH). casos de EE.UU. Biomax representan el tercer grupo de pacientes incluidos en el estudio con los tejidos normales adyacentes de colon, adenocarcinoma de colon primario con ningún nodo linfático /metástasis a distancia y de colon primario del cáncer de los pacientes con ganglios linfáticos documentados y metástasis de hígado, y el ganglio linfático actual y /o metástasis hepáticas
el proyecto fue aprobado por el italiano (Presidente -. Prof. Aldo ISIDORI, Prof. Lucio Miano, Dott.ssa Amalia Allocca, Dott.ssa Enrica ARDUINI, Dott.ssa Maria Caporale, Prof. Luciano Caprino, Dott.ssa Avia CARABELLI, Prof. Francesco Cognetti, Dott.ssa Anna DALLE ORE, Prof.ssa Marzia DUSE, Dott.ssa Giuseppina DI Giammarco, Dott. Domenico Antonio Ientile, el profesor Giovanni Fabbrini, Profesora Paola FRATI , Dott.ssa Maria Teresa Lupo, el Prof. Franco MANDELLI, Dott. Enrico MARINELLI, Dott.ssa Boza MAURO, el Prof. Paolo MENE ', Dott.ssa Elisabetta SIMONGINI, Prof. Pietro SERRA, profesor Giovanni Spera, Dott. Ettore TIBERI , Avv. Angelo tuzza, Prof.ssa Annarita Vestri, Prof. Vincenzo ZIPARO) y americano (http://orrp.osu.edu/irb/irbforms/) comite ético (Prot.1119 /13, Prot.2007E0748 respectivamente). En concreto, tanto los Commettees, la Universidad Junta Estatal de Ohio Investigación Institucional y il Comitato Etico "La Sapienza", nos exentos de los pacientes el consentimiento informado, ya que, en ambos casos, tejido incluido en parafina fueron archivados de forma anónima muestras, seleccionado en función de su clasificación TNM y los pacientes no eran ya disponible.
ARN extracción
ARN total fue extraído de procesamiento de cinco 20 micras de grosor de cada tejido en parafina, utilizando el kit de aislamiento de RecoverAll total de ácidos nucleicos (Ambion#1975) y siguiendo las instrucciones del fabricante.
etiquetado de ARN y la hibridación en chips microarrays miARN se realizaron como se describe anteriormente [20]. Cinco g de cada uno de ARN total de la muestra se hibridó en nuestro microarrays miARN (Estado de Ohio Comprehensive Cancer Center, versión 2.0), que contiene 460 sondas miRNAs maduros, manchado por cuadruplicado (235
Homo sapiens
, 222
Mus musculus
, y tres
Arabidopsis thaliana
). Diferentes sondas se utilizan para reconocer a cada miARN maduro y la mayor parte de los precursores miRNAs. Las señales de hibridación se detectaron con estreptavidina Alexa Fluor 647 conjugados e imágenes escaneadas (Axon 4000B) se cuantificaron utilizando el software Genepix 6.0 (Axon Instruments). Las mismas muestras también se analizaron con tarjetas de RT-PCR (Applied Biosystems).
miARN microarray
Microarrays se analizaron esencialmente como se describe por Liu et al [21]. Cuantiles la normalización y el análisis estadístico se realizó mediante ArrayTools BRB desarrollados por Richard Simon y Amy Peng Lam [22].
diferencialmente expresado miRNAs fueron identificados mediante una prueba t-aleatoria varianza. El t-test random-varianza es una mejora sobre el t-test independiente estándar, ya que permite el intercambio de información entre los genes sobre la variación dentro de la clase sin asumir que todos los genes tienen la misma varianza. Los genes fueron considerados estadísticamente significativos si su valor P fue menor que 0.05. [23].
sistema de múltiples pruebas se controló utilizando la tasa de detección de falsos. miARN nomenclatura se establece en función de la UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/) y el miRBase (http://www.mirbase.org/); en caso de discrepancias se siguió el miRBase.
están disponibles en la página web GEO Los datos en bruto (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE56350) .
TaqMan Arrays MicroARN tarjetas y cuantitativo PCR en tiempo real
PCR en tiempo real se realizó utilizando el TaqMan Arrays panel de microARN humano (versión 1, Applied Biosystems, Foster City, CA) y 50 ng de RNA por puerto para un total de 400 ng. Esta matriz contiene 365 genes miARN objetivos, así como controles endógenos. La normalización se realiza con pequeños ARN nucleares U44 y U48 (snRNA). La expresión de miRNAs maduros individuales fue evaluada por el TaqMan miRNAassay (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), y se normalizó para RNUB6 (Applied Biosystems). están disponibles en la página web GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE56350) los datos en bruto.
La hibridación in situ
hibridación in situ se realizó para microRNAs seleccionados siguiendo un protocolo descrito previamente [24], utilizando Exiqon LNA-5'DIG sondas marcadas. Tres microarrays de tejidos USBiomax (TMA) diapositivas (matriz de tejido normal de colon con 21 casos normales y 3 casos de adenocarcinoma, cáncer de colon y matriz de tejido normal adyacente emparejado con 25 casos, matriz de tejido de cáncer de colon con metástasis y el tejido normal adyacente con 68 casos) y una se usaron portaobjetos con núcleos de tejido de 16 pacientes (OSU TMA). Para cada microRNA seleccionado, TMA se puntuaron según la expresión de microARN relativa de cada núcleo por dos patólogos como se define por el porcentaje de células tumorales positivas y la intensidad de la señal en estas células de cáncer en los casos positivos. Las puntuaciones se generaron cegados a la presencia o ausencia de enfermedad metastásica y la prueba de Mann-Whitney se aplicó para comparar clases
Resultados
Nuestro estudio se desarrolló en cuatro etapas, tomando ventaja de.: (I) DNA Microarrays, tarjetas de alta densidad (II) Taqman, (III) Taqman único ensayo QRT-PCR y (IV) la hibridación in situ. Para lograr resultados más robustos, hemos utilizado tres grupos diferentes de pacientes (tabla 1). El primer grupo incluyó 66 pacientes italianos (III Clínica Chirurgica, Universita 'di Roma "La Sapienza", Roma, Italia) con adenocarcinoma de colon: 18 pacientes no tenían ninguna metástasis, 33 habían afectado a los ganglios linfáticos y 15 mostraron metástasis en ambos ganglios linfáticos y el hígado. ARN totales de 18 tumores primarios de colon (T) sin metástasis, 33 tumores de colon primarios (T
N) con recurrencias linfonodales y los correspondientes 33 ganglios linfáticos metastásicos (N
N), 15 tumores primarios de colon (T
L,) de los pacientes con linfonodales y enfermedad metastásica hepática y los correspondientes 15 ganglios linfáticos metastásicos (N
L) y lesiones en el hígado (L), se pusieron a prueba en la plataforma de microarrays a medida que había sido utilizado previamente para establecer microARN cáncer firmas en varios estudios [13], [14], [21], y en TaqMan Arrays microARN Tarjetas (Applied Biosystems). Los datos se normalizaron de acuerdo con los requisitos de la plataforma y se aplicaron las mismas comparaciones entre las clases tanto a los conjuntos de datos por separado. Significativamente fueron identificados miRNAs alterados y los resultados se cruza. Solamente los microARN con un pliegue diferencia de cambio de más de 2 o inferior a 0,5 fueron considerados como los miRNAs pro-metastásicos y anti-metastásicos putativos respectivamente. Doce microARN fueron consistentemente solamente hasta reguladas en la metástasis (HSA-miR-103, -155, -16, -191, -200C, -21, -24, -26a, -26b, -29a, -31 y 93) y dos fueron las reguladas (HSA-miR-328 y -566) (Tabla 2).
La estrategia de doble matriz nos permitió probar las mismas muestras con dos enfoques diferentes técnicas.
Para confirmar aún más la firma "metastásico" identificado, microRNAs seleccionados fueron probados en dieciséis pacientes estadounidenses con cáncer de colon metastásico (OSU Departamento de Patología, Columbus, OH). Para cada paciente, el ARN total de embebidos en parafina núcleos de tejido de colon normal y maligno, los ganglios linfáticos y el hígado, se ensayó por solo QRT-PCR. Se aplicó la prueba de Mann-Whitney para comparar los resultados de la PCR a partir de los diferentes grupos de pacientes.
adenocarcinomas de colon metastásico primarios mostraron una sobreexpresión significativa de hsa-miR-21 (P-valor = 0,0011), -31 (P -valor = 0,0003), -93 (P-valor = 0,0048), -103 (p-valor = 0,0142) y la regulación a la baja de hsa-miR-566 (P-valor = 0,0075) en comparación con el tejido normal adyacente (Tabla 2 ). Por otra parte, el respeto a la normalidad, hsa-miR-21 y -93 fueron upregulated significativamente en la metástasis de hígado con un valor P = 0,020 y P-valor = 0,0002, respectivamente. Hsa-miR-21 también se sobreexpresa significativamente en los ganglios linfáticos metastásicos (p-valor = 0,009) (Fig.1). Estos cinco microRNAs validados no se correlacionaron con la estadificación del tumor.
tejido de colon normal (NORM), los adenocarcinomas de colon (ADENOCA), metástasis linfonodales (POSLYM) y el hígado de colon (LIVERMET) de miR-21 (A), MIR -31 (B), el miR-93 (C), el miR-103 (D) y miR-566 (e). Se aplicó una prueba de Mann-Whitney para comparar los grupos. Los grupos se muestran en el eje x los diagramas de caja ', mientras que los valores de Delta Ct están representados en el eje y. Para cada cuadro, la barra representa la mediana, el área 25
º y 75
percentil y los bigotes de la gráfica los valores más pequeños y más grandes. Cada barra P-valor se corresponde con una comparación: para cada uno de miR la primera barra inferior se refiere a la norma vs comparación ADENOCA; miR-21 segundo trayecto inferior barra de P-valor corresponde a la norma vs comparación POS linfa, mientras que la primera barra superior de ambos miR-21 y -93 corresponde a la norma vs comparación HÍGADO MET.
tumores, las células inflamatorias y del estroma se encuentran dispersos entre las células epiteliales benignas y malignas, y de forma variable contribuyen a la celularidad de la lesión. Es, por lo tanto, esencial para entender qué tipo de célula expresa un microARN específico. Para este propósito, en experimentos de hibridación in situ se llevaron a cabo en las TMA con adenocarcinomas primarios, los ganglios linfáticos metastáticos, metástasis hepática y tejidos normales. Hsa-miR-21, -93, -103 y -566 sondas se hibridó en OSU TMA y USBiomax TMA diapositivas. Dos patólogos independientes anotó cada núcleo de deslizamiento cegado para el sitio de la biopsia de núcleo y a la historia de clasificación clínica, teniendo en cuenta la intensidad de señal de las células malignas de colon en comparación con las células adyacentes epiteliales normales y no epiteliales (Fig.2). HSA-miR-21 (valor de p & lt; 0,0001) y -103 (p-valor = 0,0009) fueron significativamente sobre-expresada en los tumores y cánceres metastáticos en comparación con los normales (Figura 2: A, B). Una prueba de Chi-cuadrado reveló una tendencia lineal para ambos, hsa-miR-21 (valor de p & lt; 0,0001) y hsa-miR-103 (valor de p & lt; 0,0001): estaban regulados por incremento cada vez que progresa de lo normal, al adenocarcinoma y para metástasis (la figura 3, la figura 4). Sin embargo, mientras que hsa-miR-103 se sobreexpresa significativamente en la metástasis de hígado en comparación con los adenocarcinomas y los ganglios linfáticos positivos, hsa-miR-21 no mostró ninguna diferencia significativa entre las tres clases. ISH de hsa-miR-93 confirmó su regulación al alza en los tumores y metástasis hepáticas, que muestra una diferencia significativa entre las normales y, o bien adenocarcinomas (valor de p = 0,0345) o metástasis hepática (p-valor = 0,007) y entre los adenocarcinomas y metástasis hepáticas (P -valor = 0,043). No se encontraron diferencias significativas al comparar las normales y adenocarcinomas frente a los ganglios linfáticos positivos (Fig. 2C y Fig.5). Por lo tanto, hsa-miR-93 patrón de expresión podría diferenciar colon normal de adenocarcinoma primario, y de colon normal y adenocarcinoma primario de la metástasis de hígado, pero no de invasión secundaria lymphnodal tumoral. Hsa-miR-566 se sobreexpresa por igual en el tejido normal adyacente del colon, las células malignas de adenocarcinoma primario de hígado y las células metastásicas del colon (Fig. 2D). Sin embargo, los ganglios linfáticos positivos mostraron una señal significativamente más débil en relación a los controles normales (p-valor = 0,002) y adenocarcinoma (p-valor = 0,043), lo que sugiere que la pérdida de hsa-miR-566 puede facilitar la invasión ganglionar en el cáncer de colon.
con el tejido normal de colon (NORM), los adenocarcinomas de colon (ADENOCA), metástasis linfonodales (POSLYM) y el hígado de colon (LIVERMET) de miR-21 (a), el miR-103 (B), el miR-93 ( C), el miR-566 (D) y miR-200c (e). Se aplicó una prueba de Mann-Whitney para comparar los grupos. Los grupos se muestran en el eje x los diagramas de caja ', mientras que los valores promedio de puntuación están representados en el eje y. Para cada cuadro, la barra representa la mediana, el área 25
º y 75
percentil y los bigotes de la gráfica los valores más pequeños y más grandes. Cada barra P-valor se corresponde con una comparación: de miR-21, -103, -93 y -200C la primera barra inferior corresponde a la norma vs comparación ADENOCA; miR-21, -103 y -93 primeras barras superiores se refieren a la norma vs comparación HÍGADO MET, mientras que miR-566 y -200C barra superior muestra la NORMA vs comparación POS linfáticos; miR-566 y miR-200c barras inferiores indican la ADENOCA vs POS linfa y la NORMA vs comparación POS GANGLIO respectivamente.
Como se ha documentado en la literatura, el miR-21 mostraron una señal débil con respecto a la normal del colon adenocarcinoma (p-valor = 0,0011) y se expresa altamente en la metástasis. MiR-21 se detectó expresión sólo en el adenocarcinoma primario y las células malignas metastásicas.
En el colon normal en la flecha está apuntando a la falta de expresión de miR-103 en las células epiteliales. En el tumor primario en la flecha está apuntando a la mayor expresión de miR-103 en el adenocarcinoma invasivo. La flecha en la recurrencia del hígado y los dos flechas en las metástasis de ganglios linfáticos están mostrando un incremento en la expresión dramática de miR-103 en los epitelios adenocarcinoma metastásico.
La inducción de la transición epitelio-mesenquimal transición (EMT) ha sido considerada como un paso importante en el desarrollo del cáncer metastásico. Recientemente, se ha demostrado que hsa-miR-103/107 regula a la baja indirectamente miembros de la familia miR-200, y que tal patrón se asocia con el fenotipo mesenquimal en líneas celulares de cáncer de mama [24].
En nuestro estudio, la plataforma de microarrays y Taqman ensayo, tanto aislados hsa-miR-103 y miR-HSA-200c. Quisimos entender si, como en el cáncer de mama metastásico, estos dos miRNAs se correlacionaron inversamente en el cáncer metastásico de colon. Aunque no es significativo por QRT-PCR, TMA se hibridaron con la sonda de hsa-miR-200c y anotó (Fig. 2E). En comparación con las normales, se detectó una mayor intensidad de señal en los adenocarcinomas (valor P = 0,0023) y los ganglios linfáticos positivos (P-valor = 0,0006). Una correlación positiva significativa entre hsa-miR-103 y miR-HSA-200c estaba presente en la metástasis de los ganglios linfáticos (P-valor = 0,0225), pero no en los adenocarcinomas o metástasis hepática. Por lo tanto, hsa-miR-103 y HSA-200c no estaban inversamente correlacionados y no regulan la EMT en el cáncer de colon metastásico
in vivo
, pero ambos fueron sobreexpresados en los tumores y metástasis de ganglios linfáticos. No investigamos hsa-miR-107 o cualquier otro miembro de la familia de miR-200 debido a la EMT no era relevante para el objetivo de nuestro estudio.
Curiosamente, hsa-miR-31 ISH (datos no mostrados) reveló una señal muy fuerte en las células inflamatorias que rodean los tumores. Se observó una tinción más débil en el tumor y las células de colon normales, pero sólo unos pocos hsa-miR-31 linfocitos que expresan estaban presentes en los ganglios linfáticos normales, lo que sugiere que hsa-miR-31 upregulation dio como resultado principalmente de la inflamatoria en lugar de desde el componente maligno de la tumoral
la Tabla 1 presenta el número de casos con estadificación TNM, que se analizaron en cada paso de nuestro estudio técnico.; La Tabla 2 muestra las firmas de microARN obtenidos con cada procedimiento técnico.
Discusión
La edición de 2009 del AJCC ha publicado una nueva clasificación TNM del cáncer de colon, en el cual, las subclases se han añadido a la (N) estadificación de la enfermedad ganglionar. Otros autores han propuesto para sustituir a esta categoría N con el número de ganglios linfáticos positivos, y varias publicaciones quirúrgicas han sugerido una linfadenectomía más radical para definir mejor pronóstico con el fin de mejorar la supervivencia del cáncer de colon pacientes [26] - [29]. invasión ganglionar es un paso crítico para la definición de los pacientes con cáncer de colon pronóstico y el tratamiento. Sin embargo, el 25% de los pacientes con ganglios linfáticos negativos experimentar recurrencia y no todos los pacientes con ganglios linfáticos positivos tienen un mal pronóstico [30] - [32].
Por otro lado, el tumor se esparce primaria en el hígado, es la causa principal de la progresión de la enfermedad en pacientes con cáncer colorrectal, con el 15-30% de los pacientes que presentan lesiones hepáticas sincrónicas en el momento de la cirugía colorrectal primario, y, mostrando las recurrencias metacronos después de la resección hepática agresiva [33] - [35].
Por lo tanto, es esencial para identificar nuevos biomarcadores moleculares que, junto con el sistema de estadificación TNM, pueden mejorar el diagnóstico y la clasificación de los pacientes con cáncer de colon metastásico.
el objetivo de este estudio fue identificar una firma de microARN para el cáncer de colon metastásico que podrían discriminar entre los ganglios linfáticos y metástasis hepáticas.
en la literatura, la mayoría de las firmas de cáncer reportados microRNAs se han identificado y validado en las mismas muestras de tejido. Para aumentar la fiabilidad de los datos, con la excepción de los dos primeros análisis, cada paso de validación se realizó en un grupo diferente de pacientes.
plataformas de microarrays y tarjetas cruzado de datos identificado catorce microRNAs expresados diferencialmente, de los cuales cinco fueron validados por QRT-PCR. Hsa-miR-21, -31, -93, -103 se upregulated en tumores primarios en comparación a la normalidad, mientras que hsa-miR-566 se downregulated. Hsa-miR-93 y -31 también se upregulated en la metástasis de hígado, pero no en los ganglios linfáticos positivos para la metástasis, mientras que hsa-miR-21 sobre-expresión fue evidente en ambos, el hígado y los ganglios linfáticos de metástasis. Con la excepción de hsa-miR-31, hibridación in situ (ISH) de adenocarcinomas de colon y el correspondiente tejido normal adyacente, así como sus microarrays de tejidos nodales y metástasis de hígado, confirmado las firmas identificadas por las tarjetas y los análisis de QRTPCR. Hsa-miR-31 se ha encontrado mal regulada en varios tumores epiteliales primarias en las que, de acuerdo con la localización del tumor, que parece desencadenar diferentes vías de cáncer: es hasta reguladas en algunos carcinomas [36] - [41], y las reguladas en otros [42] - [45]. Tal dualidad, se ha encontrado en los tumores invasivos, así: en líneas celulares de cáncer de colon, invasión es promovido por hsa-miR-31 sobreexpresión [46], [47], mientras que, en líneas celulares de cáncer de mama, sus bajos niveles promueven una un comportamiento más agresivo [42], que se correlaciona con un pronóstico más pobre paciente.
funciones selectivas de hsa-miR-31 incluyen la angiogénesis, donde su regulación positiva aumenta la sangre, pero no los vasos linfáticos que brotan [48], y la inflamación aguda [49]. Se encontró que hsa-miR-31 es en su mayoría hasta reguladas en las células inflamatorias peritumoral, en comparación con el cáncer y las células normales. Por lo tanto, hsa-miR-31 de la desregulación en los tumores agresivos primarios es una evidencia indiscutible, pero la interacción de sus funciones entre el contexto metastásico inflamatoria, tumoral y neoangiogenic, necesidades, aún así, no se han dilucidado.
HSA-mir -21 es otra microRNA multitarea que ha sido implicado en la inflamación [50] - [53], la enfermedad inmune [54] - [57], el desarrollo [58] - [61], angiogénesis [62], [63], el cáncer y metástasis [18], [64] - [82]. Varios estudios han, de hecho, informó su sobre-expresión en diferentes tipos de tumores, incluyendo el carcinoma colorrectal, en la que sus niveles se correlacionan con la progresión clínica, la supervivencia pobre y el resultado terapéutico [83], [84].
De acuerdo con nuestros estudios previos y los de los demás, QRT-PCR validado hsa-miR-21 regulación al alza en los adenocarcinomas de colon y metástasis en comparación a la normalidad. En situ hibridación de datos mostraron una tendencia: hsa-miR-21 niveles fueron los más bajos en el tejido normal, y cada vez mayor en el adenocarcinoma y la metástasis, por su parte, se observó una expresión similar en células de cáncer nodos y recurrencias de hígado, lo que sugiere que hsa-miR 21 regulación al alza podría predecir una enfermedad metastásica avanzada.
al igual que se han descrito por otros autores en el carcinoma hepatocelular altos niveles de hsa-miR-21 y -93 HSA-miR-31, [39], [85] , [86] y, por lo tanto, no pueden ser considerados como una firma diagnóstico diferencial entre metástasis hepática y carcinoma hepatocelular
los datos ISH para hsa-miR-93 se superponen completamente los resultados QRT-PCR:. una intensa tinción se detectó en adenocarcinomas de colon primarios y metástasis de hígado. Inducida por la sobre expresión de hsa-miR-93 se mostró: ser tumorigénico in vitro e in vivo, para promover la supervivencia, pero no la proliferación, y para mejorar la neoangiogénesis [87]. Por otra parte, el aumento de hsa-miR-93 niveles, se correlacionan con la progresión y la disminución de la supervivencia de los pacientes en el carcinoma de ovario seroso [88] y, puede predecir la recaída del cáncer de mama [89].
Sin embargo, el microARN validado solamente hasta reguladas identificado en nuestra firma que podría discriminar entre la metástasis hepática del colon y el carcinoma hepatocelular primario fue hsa-miR-103. La relevancia de este miARN en el cáncer se ha evaluado en páncreas, vejiga, esófago, estómago y mama tumores [29], [90] - [93]. Los altos niveles de hsa-miR-103 se correlacionaron con pobres supervivencia en cáncer de esófago y están asociados a la enfermedad metastásica en cáncer de mama y gástrico. En particular, se detectó hsa-miR-103 upregulation en pacientes con cáncer gástrico que llevan ganglios linfáticos positivos. Del mismo modo, en nuestro estudio, QRT-PCR detectó hsa-miR-103 sobreexpresión en tumores primarios, así como linfáticos metastásicos y el hígado. Una vez más, ISH dio información nos más específicos de células de origen: si bien, no hubo diferencias significativas entre los tumores primarios y los ganglios linfáticos positivos, metástasis hepática mostró los niveles más altos de hsa-miR-103 expresión
. nuestro estudio, aunque no es validado por QRT-PCR, hsa-miR-200c fue uno de los microARN seleccionada por plataformas de microarrays y tarjetas. Recientemente, HSA-mir-103/107 niveles fueron encontrados inversamente correlacionados con hsa-miR-200c en la regulación de la transición epitelio-mesenquimal transición en cáncer de mama [25]. Para probar si podríamos establecer la misma correlación en el cáncer de colon, se realizó de ISH de TMA de colon con una sonda de miR-200c. No se observó ninguna correlación inversa entre los dos miRNAs. Los dos estaban sobreexpresados, pero, hsa-miR-200c estaba fuertemente regulado hasta en metástasis ganglionar linfático en comparación con el colon normal, adenocarcinomas y las recurrencias hepáticas. Esto sugiere que hsa-miR-103 y miR-HSA-200c no controlan la EMT en el cáncer de colon, y que se requieren altos niveles de hsa-miR-200c para la invasión ganglionar.
HSA-mir-200c hígado puntuaciones de la metástasis ISH mostraron una alta variabilidad, que cubre los valores medios de los tejidos normales, los adenocarcinomas y los ganglios linfáticos positivos. Regulación a la baja de hsa-miR-200c se ha propuesto como una firma distintiva de cáncer primario de hígado (carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma intrahepático y angiosarcoma hepático) de la metástasis hepática de origen epitelial [86], [94], mientras que su regulación por incremento en el adenocarcinoma de colon ha sido asociado a un mal pronóstico [95]. En nuestro estudio, la regulación positiva hsa-miR-200c en la metástasis ganglionar fue confirmada por ISH, pero no fue validado por QRT-PCR. Este hallazgo se debe principalmente a los procedimientos experimentales y técnicas. En primer lugar, hemos utilizado diferentes grupos de pacientes para la validación, el cual, aunque proporciona datos finales más fiable, presentó más variabilidad en el procedimiento experimental. En segundo lugar, los ARN procedentes de nuestros primeros microarrays grupo de pacientes, no fueron extraídos de tejidos embebidos en parafina microdissected y contenían proporciones variables de cáncer y el tejido circundante benigna, mientras que los ARN y tejidos analizados en el QRT-PCR e ISH fueron tejido microdissected núcleos con una importante componente cáncer. Sin embargo, QRT-PCR no puede diferenciar de las células benignas y /o no, mientras que ISH puede discriminar entre los diferentes tipos de células. Otros autores validados sus datos en los mismos pacientes, y el ARN se extrajo a partir de todo el tejido. Por otra parte, a lo mejor de nuestro conocimiento, en la literatura no hay ningún estudio que informó una escala tan grande de microARN ISH. Hemos demostrado que la hipertensión sistólica aislada puede proporcionar información específica de células muy útil, lo que sugiere microRNAs adicionales
in vivo
funciones para las posteriores investigaciones.
Una novedad importante de nuestra firma era hsa-miR-566. Al parecer, las reguladas sólo en los adenocarcinomas con respecto a los controles y los tejidos del colon metastásico de QRT-PCR, hsa-miR-566 digoxigenina sonda marcada, se detectó débilmente en ganglios positivos células cancerosas, e igualmente expresa en el colon normal, así como los adenocarcinomas y la metástasis de hígado, apoyando la idea de que la hipertensión sistólica aislada puede darnos detalles más informativo que microarrays o QRT-PCR. Por desgracia, en la literatura, no hay ningún estudio que informó participación hsa-miR-566 en el cáncer, o la descripción de sus funciones biológicas, que podrían ayudar a la discusión de nuestros datos.