Extracto
Antecedentes
El cáncer de páncreas es la cuarta causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en Estados Unidos. Los anticuerpos monoclonales son una opción de tratamiento viable para inhibir el crecimiento del cáncer. de suministro de fármaco específico de tumor se puede lograr la utilización de estos anticuerpos monoclonales como agentes de direccionamiento. Este tipo de terapéutica de diseño está en evolución y con el uso de nanopartículas de oro es un enfoque prometedor para entregar selectivamente agentes quimioterapéuticos para células malignas
.
Las nanopartículas de oro (PNB) son prometedoras extrema en la investigación médica actual. PNB se ha demostrado que las células tumorales kill no invasiva por hipertermia utilizando radiofrecuencia. También se han implementado como agentes de detección temprana debido a sus propiedades únicas de contraste de rayos X; el éxito fue revelado, con clara determinación de los capilares sanguíneos en un modelo preclínico mediante TC (tomografía computarizada). Los parámetros fundamentales para el diseño inteligente de la nanoconjugados están en la vanguardia. El objetivo de este estudio es definir los parámetros de diseño necesarias para dirigir con éxito las células de cáncer de páncreas.
Metodología /Principales conclusiones
Los nanoconjugados descritos en este estudio se caracterizaron con diversas técnicas físico-químicas. Se demuestra que el número de moléculas cetuximab (agente objetivo) en un PNB, el tamaño hidrodinámico de las nanoconjugados, disponible superficie reactiva y la capacidad de los nanoconjugados para secuestrar EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico), todos juegan papeles críticos en la orientación efectiva las células tumorales
in vitro
y
in vivo
en un modelo ortotópico de cáncer de páncreas.
Conclusión
Nuestros resultados sugieren la orientación específica de las células tumorales depende en un número de componentes cruciales 1) agente para la relación de nanopartículas 2) la disponibilidad de área de superficie reactiva de orientación en la nanopartícula 3) la capacidad de la nanoconjugado para unirse a la diana y 4) diámetro hidrodinámico de la nanoconjugado. Creemos que este estudio ayudará a definir los parámetros de diseño para la formulación de mejores estrategias para atender específicamente a los tumores con conjugados de nanopartículas
Visto:. Khan JA, Kudgus RA, Szabolcs A, S Dutta, Wang E, Cao S, et al . (2011) Proyectos de Nanoconjugados eficazmente células diana del cáncer pancreático
in vitro
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En Vivo
. PLoS ONE 6 (6): e20347. doi: 10.1371 /journal.pone.0020347
Editor: Zhang Lin, de la Universidad de Pennsylvania, Estados Unidos de América
Recibido: December 2, 2010; Aceptado: 30 de abril de 2011; Publicado: 27 Junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Khan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud CA135011, CA136494, CA150190 y un MD Anderson Cancer Center de subvención del Desarrollo (UTMD). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer afirma casi el 25% de las muertes anuales. El cáncer de páncreas es la cuarta causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos, tanto en hombres como en mujeres. A pesar de enormes esfuerzos para detectar y tratar el cáncer de páncreas, las tasas de incidencia y mortalidad siguen siendo prácticamente la misma. El diagnóstico precoz y la entrega eficiente de los agentes terapéuticos a las células malignas siguen siendo los dos retos principales en las estrategias de gestión de cáncer [1].
Los anticuerpos monoclonales contra receptores de factores de crecimiento han demostrado ser viables tratamientos para inhibir el crecimiento del cáncer [2] . La utilización de estos anticuerpos monoclonales como agentes de direccionamiento para la entrega específica de tumor está evolucionando como un enfoque prometedor para entregar selectivamente agentes quimioterapéuticos [3]. nanomateriales inorgánicos están siendo estudiados como el vehículo de administración para la administración dirigida de fármacos. nanomateriales de oro son de particular interés debido a las propiedades optoelectrónicas único físico-químicas y, la facilidad de modificación de la síntesis y la superficie [1], [4], [5], [6], [7], [8], [9] , [10], [11], [12], [13].
Las nanopartículas de oro (PNB) recientemente se han utilizado para matar las células tumorales por hipertermia mediante radiofrecuencia no invasiva [14]. Su utilidad como un agente de contraste también se ha demostrado por una delimitación clara de los capilares sanguíneos en un modelo preclínico por CT (tomografía por ordenador) en comparación con los agentes de contraste a base de yodo convencional [15]. Ambos estudios tienen la esperanza y su utilidad se fomenta aún más por el perfil de seguridad [16], [17].
epidérmico receptor del factor de crecimiento (EGFR) es un objetivo importante en la investigación del cáncer. Se sobreexpresa en una serie de tumores malignos humanos, incluyendo el cáncer de páncreas. EGFR humano es una glicoproteína transmembrana [3], [18], [19], [20]. Consiste en un dominio de unión a ligando extracelular, un dominio transmembrana hidrófobo y un dominio de tirosina quinasa intracelular. la unión a EGFR ligando induce homo receptor /heterodimerización que conduce a la fosforilación de residuos de tirosina. La fosforilación de EGFR, activan el complejo de aguas abajo acontecimientos que conducen a la proliferación, la migración, la invasión de señalización, y la inhibición de la apoptosis de las células del cáncer [21], [22], [23].
El anticuerpo monoclonal anti-EGFR, Cetuximab (C225), es un agente de dirección única para dirigirse a las células de cáncer de EGFR-positivo. Cetuximab fue aprobado por la FDA para el tratamiento de pacientes con cáncer de EGFR positivo colorrectal (CRC) [21], [22], [23]. También ha sido aprobado o está en diferentes fases de los ensayos clínicos en muchos otros tumores malignos, tales como NSCLC (carcinoma de pulmón de células no pequeñas), SCCHN (carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello) y cáncer de páncreas [24], [25] , [26]. Cetuximab es un quimérico G1 human:murine de inmunoglobulina de anticuerpo (IgG1) monoclonal (MoAb). La unión de C225 a EGFR conduce a la internalización del receptor y degradación sin la fosforilación del receptor, lo que inhibe las vías de EGFR-asociado [24], [25], [26].
A pesar de la utilidad de los PNB emergente en la ejecución selectiva fundamental preguntas siguen sin respuesta. ¿Cuáles son los criterios de diseño para la fabricación de nanoconjugados que garanticen un máximo de absorción en las células cancerosas? En esto, utilizamos el cetuximab (C225) como un agente de dirección y el PNB como un sistema modelo. Se demuestra que el número de anticuerpos en un C225 PNB (relación C225:GNP), el tamaño hidrodinámico, el área de superficie reactiva disponible y la capacidad de la nanoconjugado para secuestrar EGFR, todos juegan un papel crítico en la selección de las células tumorales eficazmente
en Opiniones y vitro
in vivo
en un modelo ortotópico de cáncer de páncreas. estudios de captación con el control de isotipo, GNP-IgG, indican que la especificidad de la orientación de las células tumorales es dependiente de la cobertura de la superficie de nanopartículas por C225. la absorción no específica disminuye cuando C225 a PNB relación aumenta las. Estos estudios son fundamentales para el desarrollo de un sistema de suministro eficientes y específicas para el uso clínico futuro.
El trabajo presentado en este documento muestra la caracterización sistemática de nanoconjugados PNB-C225. El potencial de la orientación específica fue investigado, tanto
in vitro
y
in vivo
en un modelo ortotópico de cáncer de páncreas. Nuestros resultados demuestran que la capacidad de radio hidrodinámico, área de superficie reactiva accesible y carga de C225 en PNB desempeñan papeles críticos para la orientación eficaz de las células tumorales. Estos resultados ponen de relieve los principales parámetros a tener en cuenta para un sistema de administración de fármacos a base de nanopartículas prometedor para la futura aplicación clínica.
Resultados
Caracterización de los anticuerpos nanoconjugados con proporciones variables de nanopartículas
con el fin de entender los parámetros necesarios para la orientación específica de nanoconjugados a las células tumorales, se seleccionaron cetuximab (C225) como un agente de dirección. C225 es un anticuerpo monoclonal humano-murino quimérico que se une al dominio extracelular de EGFR [3]. EGFR se sobreexpresa en una serie de tumores malignos humanos, incluyendo el cáncer de páncreas, haciéndolo un objetivo atractivo [18]. Para determinar la valencia óptima de C225 en PNB (el número de moléculas por C225 PNB y por lo tanto la relación C225:GNP) para la captación intracelular, se sintetizó diversas nanoconjugados con múltiples relaciones de C225:GNP. Caracterización de estos nanoconjugados se realizó utilizando varias técnicas fisicoquímicas: UV-Visible espectroscopia (UV-Vis), microscopía electrónica de transmisión (TEM), dispersión de luz dinámica (DLS) y radioyodación de C225 con
125I. Los PNB utilizados en este estudio fueron sintetizados por reducción con borohidruro de sodio de tetracloroaurato [27], [28]. Como se informó anteriormente, la presencia de una banda de resonancia de plasmón superficial en ca. 510 nm confirma la formación de nanopartículas de oro esféricas (Figura S1). La formación de los PNB esféricas y su diámetro de tamaño de 5 nm se confirmó adicionalmente mediante TEM (datos no mostrados).
Los conjugados GNP-C225 se sintetizaron usando esta solución PNB desnuda y purificada como se describe en los materiales y métodos sección. El anticuerpo se une de forma espontánea a través de los PNB Au-S y Au-N de unión [19]. La producción de la GNP-C225 se controló mediante espectroscopia UV-Vis. Es evidente que con la adición de C225 hay un cambio gradual de color rojo en la banda de SPR de oro desnudo, de 510 nm a 519 nm (Figura 1a). Tal desplazamiento hacia el rojo en la banda de SPR de los PNB sugiere la perturbación de la doble capa eléctrica por el anticuerpo que rodea los PNB y por lo tanto indica la unión del anticuerpo a las nanopartículas [29], [30].
a . Cambio en máximos de absorción como una función del aumento de la concentración de C225 en ausencia (esferas) y la presencia de NaCl (triángulos). segundo. La concentración de C225 con destino al PNB como una función del aumento de la concentración de C225, determinada mediante la medición de la concentración de C225 libre marcado con I125 en el sobrenadante, después de la granulación por los conjugados PNB-C225 por ultracentrifugación.
para confirmar aún más la conjugación PNB-C225 desafiamos a los nanoconjugados contra la agregación inducida por la sal (concentración crítica de coagulación). La adición de NaCl 140 mM se ha informado que el resultado de la agregación de partículas desnudas o parcialmente cubiertos, tales agregación conduce a un desplazamiento hacia el rojo dramático en la banda de SPR. Los espectros de absorción de los nanoconjugados se registraron 15 minutos después de la incubación con 140 mM de cloruro de sodio (NaCl). Como era de esperar, los PNB desnudos mostraron un cambio drástico de color rojo en la banda de SPR de 510 nm a alrededor de 600 nm (Figura 1a), que confirma la agregación de nanopartículas descubiertas [31]. la agregación inducida por sal se relaciona directamente con el aumento de la carga de C225 en la superficie PNB, por lo tanto, la banda SPR desapareció por completo en un C225 a PNB de 3 (tres C225 moléculas por PNB) lo que sugiere la ausencia de superficie reactiva disponible a la agregación sal inducida.
La cuantificación de C225 unión a nanopartículas de oro por radioyodado
La unión de C225 al PNB se cuantificó usando radiomarcado
125I-C225. Una concentración fija de PNB se incubó con
125I-C225 a varias relaciones C225:GNP. Los conjugados se centrifugaron a alta velocidad (45.000 g) durante 1 hora para separar el anticuerpo no unido de la nanoconjugados. La eficiencia de la GNP-C225-I
125 Se determinó la unión a continuación, mediante la medición de la emisión de rayos gamma que emanan de la libre y unida
125I-C225 en el sobrenadante y las fracciones de pellets, respectivamente. Como se muestra en la Figura 1b y la Figura S2, había un muy alto porcentaje de unión de C225 (~ 90%) para PNB hasta una relación de 3 (3 C225 moléculas por PNB). Sin embargo, un aumento mínimo en la unión se observa por encima de una proporción de 3. Este pequeño aumento en las concentraciones de anticuerpos altos podría ser debido a la debilidad de las interacciones proteína-proteína no específica entre el anticuerpo unido y libre. Estos datos vuelve a corroborar las observaciones formuladas por espectroscopia UV-Vis se discutió anteriormente; donde se encontró la extensión de la agregación inducida por la sal que sea mínimo en una proporción de 3
administración dirigida de nanopartículas de oro a las células de cáncer de páncreas in vitro
Para entender el papel de la polivalencia en el intracelular absorción por las líneas celulares de cáncer de páncreas humano con la expresión de EGFR variable, se trató AsPC-1, PANC-1 y MiaPaca-2 células con GNP-C225 o el control de isotipo IgG no específica PNB-a diferentes anticuerpos a PNB ratios (Ab:GNP). la expresión de EGFR en estas células sigue el orden AsPC-1≥PANC-1 & gt; MiaPaca-2 [19]. La cantidad de la captación celular de GNP-C225 y GNP-IgG por las diferentes líneas celulares se cuantificó mediante la determinación del contenido de oro en las células a través de análisis por activación neutrónica instrumental (INAA). Las figuras 2a, 2b y 2c representan el contenido de oro de AsPC-1, las células PANC-1 y MiaPaca-2, respectivamente. Es evidente de las figuras que la absorción de los nanoconjugados en las tres líneas celulares aumenta gradualmente con el aumento de la relación C225:GNP (aumento de la valencia). La absorción máxima se observó con la relación de 1,5 (barras negras); más allá de esta relación de la absorción de los nanoconjugados disminuyó gradualmente. La tendencia absorción de los nanoconjugados sigue un patrón similar en las tres líneas de células. También es importante tener en cuenta que el grado de absorción fue mucho menos por las relaciones correspondientes para los controles de isotipo, GNP-IgG (barras grises). Curiosamente, la captación no específica de GNP-IgG disminuyó gradualmente con el aumento de relación de IgG:GNP donde se observó la absorción mínima a la relación de 3. Es probable que en la relación más baja Ab:GNP, el área de superficie reactiva libre disponible en el PNB puede unirse de forma no específica, ya sea a las proteínas séricas o de las membranas celulares o de ambos; que a su vez podría promover la absorción no específica de los nanoconjugados. La adsorción de los componentes del suero se sabe que influyen en la absorción de PNB [32]. Aumento de la relación Ab:GNP deben aumentar la cobertura de anticuerpo de la superficie de la nanopartícula, lo que proporciona área de superficie menos abierta disponible para interacciones no específicas. Reducción de tales interacciones no específicas podrían explicar reducción de la absorción de los conjugados de la GNP-IgG observados en proporciones más altas (Figura 2).
a. AsPC-1 en las células, b. células PANC-1, c. MiaPaca-2 células, tratadas con el PNV-C225 (barras negras) o PNB-IgG (barras grises) preparadas en diferentes proporciones Ab:GNP. eje Y representa la concentración de oro en ppm de masa seca total de células.
La internalización de los nanoconjugados por las células de cáncer de páncreas in vitro
Para confirmar aún más la captación intracelular y la localización de los PNB, análisis TEM se realizó después de tratamiento de las células con los mismos nanoconjugados utilizados para los estudios de captación. La Figura 3 muestra micrografías TEM de células AsPC-1 después del tratamiento con el PNV-C225 en proporciones variables C225:GNP. Imágenes de baja, media y alta magnificación están representados por C225:GNPs proporciones de 0,38, 1,5 y 3,0 (Figura 3). Los nanoconjugados se muestran dentro de las estructuras vesiculares de las células, lo que confirma la captación intracelular de los nanoconjugados. Resultados similares también se obtuvieron con PANC-1 y MiaPaca-2 células (Figuras S3, S4). La absorción diferencial de los PNB por las células cancerosas que tienen diferentes relaciones C225:GNP también podría ser debido a la afinidad diferencial de los nanoconjugados de obligar a EGFR, o el tamaño de los nanoconjugados. Curiosamente, cuando las mismas líneas celulares se trataron con GNP-IgG, el control de isotipo, la mayoría de los PNB se encuentran en la periferia de la membrana celular con la endocitosis mínima (Figura S5). Esto es coherente con un informe reciente que describe la orientación de un tumor sólido con recubierto de transferrina PNB [33].
imágenes de TEM a diferentes aumentos, que muestra la internalización del PNB-C225. Por favor, vea las figuras S3 y S4 para las imágenes que ilustran TEM PNB-C225 internalización por PANC-1 y MiaPaca-2 células.
diámetro hidrodinámico de los nanoconjugados y su capacidad de secuestrar EGFR
en un intento de obtener el mecanismo de absorción diferencial de GNP-C225, la hipótesis de que las diferentes relaciones de C225:GNP poseen capacidad diferencial de obligar a EGFR. Para validar esta hipótesis, se realizó un análisis de transferencia Western. Los diversos conjugados GNP-C225 y GNP-IgG se incubaron con lisados de células AsPC-1 durante 2 h, después se centrifugaron a alta velocidad. El sedimento se lavó una vez y luego el sobrenadante y el sedimento se sometieron a análisis de transferencia Western para detectar la presencia relativa de EGFR en las diferentes fracciones. Los resultados se muestran en la Figura 4a. Esto demuestra claramente que existe una destrucción progresiva de EGFR en el sobrenadante con una proporción cada vez mayor C225:GNP (panel central). También es interesante observar un enriquecimiento de EGFR en la fracción de sedimento (panel superior) alcanzando una meseta a una relación de 1/5 a 2/29, más probable es una función de la C225 de carga en la superficie de pellets. los niveles de beta-actina se utilizaron como controles de carga que demuestran carga igual de proteína en diferentes carriles. También es importante tener en cuenta que cuando los mismos lisados se trataron con GNP-IgG, apenas EGFR detectable se encontró en la fracción de sedimento, la mayoría se encuentra en la fracción sobrenadante, confirmando además la especificidad de unión de GNP-C225 a EGFR. En conjunto, estos datos sugieren que los conjugados GNP-C225 pueden secuestrar específicamente EGFR a partir de los lisados celulares y los aumentos de capacidad secuestrante con un número creciente de moléculas de C225 en la superficie PNB.
a. La unión de la GNP-C225 y el PNB-IgG de EGFR verificada mediante análisis de Western Blot. Los lisados celulares a partir de células AsPC-1 se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con conjugados GNP-C225 y GNP-IgG con diversas relaciones de anticuerpo en la superficie de la partícula. Después de la incubación las muestras se centrifugaron a alta velocidad y se recogió el sobrenadante y el sedimento se lavó una vez y se volvieron a centrifugar; la fracción nanoconjugado fue de 20 veces la concentración del sobrenadante. El sedimento y las fracciones sobrenadantes se cargaron en un gel de SDS-PAGE al 7,5% y se analizaron para EGFR. segundo. diámetro hidrodinámico de GNP-C225 medido por Dynamic Light Scattering Spectroscopy
La capacidad de los nanoconjugados para secuestrar EGFR con una relación C225:GNP de 1,5 a 3 es similar.; sin embargo, la
in vitro
captación intracelular disminuye a medida que cambia la relación de 1,5 a 3. Para explicar la absorción de la disminución de los nanoconjugados con una relación de C225:GNP creciente, se investigó el papel del diámetro hidrodinámico de las nanoconjugados . El diámetro hidrodinámico (HD) de los conjugados se determinó a través de mediciones de espectroscopia de dispersión de luz dinámica (DLS) (Figura 4b). Recientemente, HD ha demostrado ser crítico para la orientación de los puntos cuánticos [34] tumor. Además, también se ha demostrado que la
in vitro
absorción y respuesta celular es dependiente del tamaño de las nanoconjugados. Tras la conjugación con una relación de 0,38 C225:GNP la HD de los PNB aumenta inmediatamente de 7 nm a 21 nm, lo que confirma aún más la unión de C225 a la superficie PNB [35]. La HD se mantiene alrededor de 21 nm hasta una proporción de 2,29 a continuación, aumenta bruscamente en una proporción de 3. Debe observarse en las figuras 1b y S2 que casi todas las moléculas de anticuerpo permanecen unidos a la superficie PNB hasta una relación de 3. Sin embargo, hay es sólo un aumento gradual en la unión por encima de esta relación, más probable es atribuido a la unión no específica. Esta unión no específica de moléculas de anticuerpo puede estar causando la formación de una capa secundaria suelta alrededor de la GNP-C225 que resulta en un fuerte aumento de la HD en proporciones más altas C225:GNP. un fuerte aumento tal en HD también podría ser debido a la heterogeneidad de la muestra. La obtención de un número discreto de moléculas de anticuerpo por PNB es muy difícil de lograr experimentalmente. La relación entre la polivalencia de las nanopartículas con sus diámetros hidrodinámicos necesita de mayor investigación. TEM análisis confirmó que el fuerte aumento en el HD no es debido a la agregación de las nanopartículas. Las micrografías de TEM no mostraron ninguna agregación significativa de las nanopartículas con diferentes proporciones C225:GNP (Figura S6).
Entrega del PNB-C225 en un modelo ortotópico de cáncer de páncreas
Para investigar más a fondo la capacidad de estos nanoconjugados para dirigirse específicamente a las células tumorales
in vivo
, se utilizó un modelo de cáncer de páncreas ortotópico. El modelo se genera después de la implantación quirúrgica de células AsPC-1 que expresan luciferasa en el páncreas de ratones desnudos y se dejó crecer durante 12 días. Cada tercio días los ratones fueron inyectados con 200 l de ketamina y 100 l de luciferina y la imagen para la progresión del crecimiento tumoral por measurments bioluminiscencia. Este modelo ortotópico trata de imitar la patogénesis de cáncer de páncreas humano [36] y permite que las células tumorales a experimentar los efectos de la microambiente en el páncreas. En el día 12, GNP-C225 y el PNB-IgG se administraron por vía intraperitoneal para estudiar la captación y distribución de nanoconjugados que tienen diferentes relaciones Ab:GNP tumor. Los ratones se sacrificaron 24 h después de la inyección nanoconjugado y se recogieron los tumores y otros órganos vitales para la determinación de contenido de oro por INAA. La figura 5a muestra un ejemplo representativo de una imagen de bioluminiscencia de los ratones 12 días después de la implantación ortotópica de las células tumorales en el páncreas (panel superior) de. bioluminiscencia Strong sugiere la formación y crecimiento de un tumor en el páncreas. El crecimiento del tumor se confirmó adicionalmente mediante la medición del tamaño del tumor en el final de los experimentos después de sacrificar los ratones (panel inferior). El tamaño del tumor se mide utilizando la fórmula ab
2/2 (a = longitud, b = ancho) fue ~62 mm
3 cuando se administraron nanoconjugados para los estudios de biodistribución. La figura 5b muestra la captación tumoral de GNP-C225 y GNP-IgG en relaciones variables Ab:GNP como una función del contenido de oro determinado por INAA. El
in vivo
y
in vitro
captación tumoral en los nanoconjugados siguió un patrón similar. El análisis estadístico usando el ensayo t de Student de dos colas demostró que la absorción de la GNP-C225 con un ratio de 0,76 y 1,5 fueron significativamente más alta que la proporción de 3 (p & lt; 0,05). Por otra parte, la captación de los conjugados PNB-C225 fue significativamente mayor (p & lt; 0,05) que el control de isotipo, GNP-IgG en todas las proporciones, excepto 3. Como se mencionó anteriormente, el HD del PNB-C225 se mantuvo constante a partir de una relación de 0,38 a 2,29 (alrededor de 21 nm), pero incrementado dramáticamente en una proporción de 3 (134 nm). En teoría, el más grande de los HD nanoconjugados en una proporción de 3 podría contribuir a la difusión inferior y en la reducción a su vez en la captación de [37]. Esto ilustra que el HD es un factor crítico para
in vivo
absorción y por lo tanto un factor clave para la orientación activa. Para investigar más el intratumoral (dentro de las células, o en la vasculatura o en la cápsula exterior del tejido tumoral) la ubicación de los nanoconjugados, se realizó TEM en los tejidos tumorales que se muestran en la figura 5a, que se obtuvieron después de sacrificar los ratones 24 h después de la administración intraperitoneal de diferentes nanoconjugados. La figura 6 muestra la ubicación de los PNB en diferentes áreas de los tejidos tumorales en caso de GNP-C225 (C225:GNP 3,0 grupos tratados (Figura 6a y b) y 1,5 (Figura 6c). Es evidente que los PNB son el interior de las células ( la Figura 6a, los paneles izquierdo y derecho son imágenes de la misma área, diferente de aumento), así como la cápsula que cubre el tejido tumoral (Figura 6b, a la izquierda y el panel de la derecha son imágenes de la misma área, diferentes aumentos). Sin embargo, los nanoconjugados son en su mayoría localizadas fuera del tejido tumoral en el caso del grupo tratado PNB-IgG (IgG:GNP 1,5) (Figura S7).
a. las imágenes de bioluminiscencia en el día 12 que representa la presencia del tumor (panel superior) y una cámara digital imágenes (panel inferior) de las masas tumorales extirpados después de la terminación de los ratones anteriores. los ratones fueron sacrificados en el día 13, 24 horas después de los tratamientos nanoconjugado. b.
en tumoral in vivo
captación del PNB-C225 y el PNB-IgG conjuga en relaciones variables de anticuerpo; 24 h después de la inyección intraperitoneal de los conjugados en un modelo ortotópico de cáncer de páncreas. La absorción se determinó midiendo la concentración de oro en los tumores por INAA. eje Y representa la concentración de oro en ppm.
a y b. GNP-C225 con la relación de 3,0 de Ab:GNP se muestra a la izquierda en un bajo aumento para mostrar una gran superficie del tejido tumoral y en la derecha se aumenta la ampliación para dilucidar la internalización de los propios conjugados. do. GNP-C225 con la relación de 1,5 Ab:GNP se muestra a la izquierda en la ampliación baja para mostrar una gran superficie de tejido tumoral y en la derecha se aumenta la magnificación para revelar los conjugados a sí mismos en el interior del espacio celular.
La presencia de conjugados inyectados en otros órganos importantes también se determinó mediante INAA (Figura S8). la captación de oro también se encuentra en otros órganos, como el bazo, el hígado, el pulmón, el riñón y el cerebro [38], [39].
Discusión
administración dirigida de nanomateriales inorgánicos es un área esencial de la investigación de la nanomedicina. propiedades fisicoquímicas únicas de los nanomateriales inorgánicos se pueden utilizar para varias aplicaciones biomédicas, tales como la detección /diagnóstico, terapia y formación de imágenes. Por lo tanto, es importante para definir los parámetros de diseño para entregar específicamente nanoconjugados a las células de interés. Hay varios factores clave que pueden definir el éxito de la ejecución selectiva; (I) la selección de un modelo adecuado para estudiar el enfoque de prestación; (Ii) la selección de un agente de la orientación eficaz; (Iii) la optimización del número de agentes por nanopartículas de orientación; (Iv) la disponibilidad de área reactivo libre en la superficie de las partículas que pueden iniciar la unión no específica; (V) la capacidad del agente de dirección para secuestrar el objetivo y (vi) el tamaño hidrodinámico de las nanoconjugados.
La mayoría de las estrategias de entrega es probado en modelos no ortotópico tumores donde se generan fuera del sitio original. Una importante ventaja de este modelo es tumores son fáciles de desarrollar y el crecimiento puede monitorizarse mediante la medición manual con pinzas de diapositivas. Una desventaja de este modelo es que las células tumorales no experimentan un verdadero microambiente tumoral. En contraste, el modelo ortotópico implanta células tumorales en el órgano de origen del tumor, lo que hace que un modelo más realista. Por lo tanto, seleccionamos el modelo ortotópico para estudiar los parámetros de diseño necesarios para nanoconjugados para apuntar con éxito y específicamente un tumor.
Hemos seleccionado cetuximab como un agente de orientación nanopartículas de oro y como el andamiaje para la orientación de entrega. Una de las principales ventajas de la utilización de nanopartículas de oro es su formación de enlaces estables con biomoléculas tales como organothiols, organoamines, proteínas y anticuerpos [5]. Hemos demostrado la unión significativa de cetuximab a PNB hasta una relación de 3. (C225:GNP = 3) más allá del cual sólo se observa un aumento marginal en la unión. Este aumento marginal podría ser debido a la falta de área de superficie reactiva libre que quede en los PNB. La naturaleza de la unión entre el oro y las proteínas ha sido el objeto de una intensa investigación en los últimos decenios. Se acepta ahora generalmente que existen tres tipos principales de interacciones que se producen entre una proteína /anticuerpo y una nanopartícula de oro; (I) las interacciones electrostáticas de PNB con carga negativa con proteínas con carga positiva; (Ii) las interacciones covalentes entre los grupos tiol /amina presentes dentro de los residuos de aminoácidos en anticuerpos y los PNB; y (iii) las interacciones hidrofóbicas entre las proteínas y los PNB [19], [40]. El uso de la espectroscopia de fotoelectrones de rayos X y análisis termogravimétrico Hemos demostrado anteriormente que utiliza cetuximab tiol y amina funcionalidades que se unen a la superficie de las nanopartículas de oro [19], [40].
También es imprescindible para validar los parámetros de diseño para diferentes líneas celulares con expresión variable del receptor diana. Esto es particularmente importante teniendo en cuenta la heterogeneidad de los tumores. En estos estudios se emplearon tres líneas celulares de cáncer de páncreas diferentes con expresión variable de EGFR. Se demostró además que la absorción intracelular de GNP-C225 no depende sólo del número de moléculas de cetuximab, pero también depende de su capacidad para unirse EGFR, así como el tamaño hidrodinámico de las nanoconjugados. También es evidente que la captación no específica se puede minimizar
in vitro
mediante la optimización de la cobertura de la agente de dirección sobre la superficie de la nanopartícula. Máxima absorción específica de GNP-C225 se observa cuando hay tres C225 moléculas en un PNB a pesar de que la absorción total se reduce. Estos datos demuestra aún más la importancia combinado de la cantidad de agentes por partícula y el tamaño hidrodinámico de las nanoconjugados orientación. Esto también se refleja en la diferencia entre la captación de PBI-C225 y la absorción no específica de la GNP-IgG.
Recientemente, varios grupos se han centrado en la comprensión de los parámetros de diseño para dirigir de manera eficiente con tumores nanoconjugados en un modelo preclínico. También se ha informado de que un nanoconjugado con un tamaño de & lt; 100 nm se dirige eficazmente células tumorales [41]. liposomas de anticuerpos dirigidos se han encontrado para ejercer una mayor eficacia sobre sus contrapartes que no son objeto [42]. Además, la entrega de siRNA utilizando nanopartículas poliméricas transferencia orientada demostró mejor eficacia a pesar de que su absorción cinética, biodistribución y el tumor fue similar [43]. Observaciones similares también se hicieron en un estudio de nanopartículas de oro recubiertas de transferrina; se demostró que el contenido de ligando en las nanopartículas son importantes para la orientación [33]. A continuación, se explora un modelo ortotópico de cáncer de páncreas y, a su vez, demuestran el papel fundamental que el número de moléculas de anticuerpos en el PNG, la capacidad de los nanoconjugados para unirse al receptor de destino, la disponibilidad de la superficie reactiva para la interacción no específica . y el tamaño hidrodinámico de las nanoconjugados todo el juego en el diseño eficiente
Tomados en conjunto nuestros datos sugieren que la orientación específica de las células tumorales depende de una serie de factores importantes; 1) agente de relación de nanopartículas de orientación; 2) la disponibilidad de la superficie reactiva en la nanopartícula; 3) la capacidad de la nanoconjugado para unirse a la diana y 4) de diámetro hidrodinámico del nanoconjugado. Por lo tanto, el diseño inteligente de una selección adecuada de las células tumorales requiere la optimización de estos factores cruciales. Creemos que este estudio ayudará a definir los parámetros de diseño para la formulación de mejores estrategias para atender específicamente a los tumores con conjugados de nanopartículas.
Materiales y Métodos
Síntesis y caracterización de anticuerpos conjugados PNB-