Extracto
microARN (MIR) modular los niveles de expresión de ARNm y las proteínas y por lo tanto puede contribuir a la iniciación y progresión del cáncer . Además de su función intracelular, MIR son liberados de las células y se desprenden en la circulación. Hemos postulado que circulan miRs podrían proporcionar información sobre las rutas alterados durante la progresión del cáncer y pueden indicar las respuestas al tratamiento. Aquí nos centramos en la progresión maligna del cáncer de páncreas. Nos informan de que los cambios en los patrones de expresión de miR durante la progresión de los tejidos normales que invasivos adenocarcinoma pancreático en el p48-Cre /LSL-Kras
modelo de ratón G12D refleja los cambios de miR observados en tejidos de cáncer de páncreas humano. Se encontraron miR-148a /b y miR-375 expresión disminuida mientras que el miR-10, miR-21, miR-100 y miR-155 se incrementaron cuando se comparan los tejidos normales, lesiones premalignas y carcinoma invasivo en el modelo de ratón. prevista del blanco ARNm FGFR1 (miR-10) y MLH1 (miR-155) se encuentran regulados a la baja. La cuantificación de nueve microRNAs en muestras de plasma de pacientes distingue cánceres pancreáticos de otros tipos de cáncer, así como la enfermedad pancreática no canceroso. Por último, el tratamiento de gemcitabina de los animales de control y p48-Cre /LSL-Kras
G12D animales con cáncer de páncreas causada distinto y hasta cambios de 60 veces en miRs que indican efectos de drogas diferenciales sobre los tejidos normales y cancerosas circulantes. Estos hallazgos apoyan la importancia de la detección de MIR en la circulación y sugiere que los MIR que circulan podrían servir como indicadores de la respuesta a los fármacos
Visto:. LaConti JJ, Shivapurkar N, Preet A, Deslattes Mays A, Peran I, Kim SE , et al. (2011) de tejidos y suero microRNAs en el Kras
G12D transgénico modelo animal y en pacientes con cáncer de páncreas. PLoS ONE 6 (6): e20687. doi: 10.1371 /journal.pone.0020687
Editor: Janine Santos, Universidad de Medicina y Odontología de Nueva Jersey, Estados Unidos de América
Recibido: 20 de enero de 2011; Aceptado: May 6, 2011; Publicado: 27 Junio 2011
Derechos de Autor © 2011 LaConti et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado en parte por los Institutos nacionales de Salud de subvención CA108440 (AW), EE.UU. Departamento de Defensa CDMRP (JJL), el Centro Lombardi cáncer (NS), la Fundación Gordon (AW), la Fundación Lustgarten (ATR) y el Centro de Ruesch (JLM y AW). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
microARN (miARN o MIR) son pequeños ARN no codificantes, que juegan un papel importante en el control de las actividades de las vías celulares tanto en la fisiología y la patología (ver por ejemplo [1]). La función distinta de miRs en diferentes tipos de cáncer se ha vuelto más evidente en los últimos años [2], [3], y muchos estudios muestran que las firmas de miR se pueden utilizar para distinguir diferentes tipos de cáncer [4], [5], [6], [7] pronóstico [8], [9], [10], [11], [12], [13] o revelar posibles objetivos [14], así como alteración de las vías de señalización [15]. Lo más sorprendente, una comparación de perfiles de MIR y de mRNA de lesiones de cáncer primarios y metastásicos mostró que miRs proporcionado una firma más fiable y distintivo de mRNAs y se encontró que las firmas de miR eran superiores a los ARNm en la identificación de la fuente de órgano de metástasis de origen desconocido [16] , [17]. Más allá de estos análisis de tejidos normales y enfermos, los informes más recientes han demostrado que las especies de miR pueden ser detectados en la circulación [18] y sugirió que el análisis de muestras de suero para las especies de miR definidos podría ser utilizado para identificar a los pacientes con cáncer [19], [ ,,,0],20], [21], [22], [23], [24], [25], así como otras enfermedades tales como enfermedad cardíaca [26], [27], [28], [29], [30] o diabetes mellitus [31].
secuencias de miRs se conservan con frecuencia a través de especies y especularon que el análisis de miRs en un modelo animal bien definido podría informar estudios con muestras de pacientes. Estamos particularmente interesados en evaluar si esto podría traducirse en la detección y cuantificación de los MIR en la circulación debido a que en última instancia podría revelar activado o alterada vías de la enfermedad basado en el análisis de una muestra de sangre en lugar del análisis de la muestra de tejido enfermo [32] . Además, es probable que los tratamientos de impacto patrones de miR en la circulación y estos patrones pueden también ser útiles en el establecimiento de firmas de los efectos del fármaco.
Aquí nos hemos centrado en el cáncer de páncreas, que fue diagnosticado en 43.140 pacientes en 2010. El cáncer de páncreas es una enfermedad mortal con una tasa de supervivencia a los 5 años de sólo el 6% [33]. Este pobre resultado se debe a la detección tardía, así como la falta de terapias eficaces [34]. Para identificar informativa MIR, se utilizó un modelo de ratón genéticamente modificado, el p48-Cre /LSL-Kras
modelo G12D, que fue descrito por primera vez por Hingorani
et al.
[35]. Este modelo reproduce fielmente la progresión maligna visto en desarrollo PDAC humano [34], [35] y numerosos estudios con este modelo reducido las células de origen de PDAC [36] y mostró la contribución de los diferentes genes de controladores [37], [38 ], [39] de que el control de la biología y la progresión de esta enfermedad [40]. Utilizamos tejidos recolectados en diferentes etapas de la progresión maligna de este modelo de ratón para evaluar un panel de MIR que se había demostrado que la altura o hacia abajo-regulada en tejidos de cáncer de páncreas humanos y había sido revisado y recopilado recientemente por Seux y colegas [41 ]. a continuación, este análisis fue seguido por la cuantificación del MIR en la circulación de pacientes con cáncer de páncreas o los controles y otros y nos encontramos con los patrones de expresión de miR que distinguían entre los diferentes grupos. miR patrones de expresión en el suero de los animales de experimentación en paralelo los resultados en los pacientes. Por último, el tratamiento de los animales con la gemcitabina medicamento contra el cáncer que está aprobado para el tratamiento de primera línea del cáncer de páncreas [42], mostró un cambio en el patrón distinto niveles de miR en la circulación de los animales con cáncer de páncreas en comparación con los controles.
resultados
expresión de microARN en los tejidos pancreáticos durante Kras
G12D inducida por la progresión maligna
Un panel de miRs constantemente hacia arriba o hacia abajo reguladas a través de diferentes estudios en tejidos de cáncer de páncreas humano en relación con tejidos pancreáticos normales se seleccionan de búsquedas bibliográficas y de base de datos (ver Tabla S1; las referencias [7], [41], [43], [44], [45]). Para este panel de miR establecimos cuantitativa de detección de RT-PCR [46] porque esperábamos una amplia gama de concentraciones de miR al comparar los extractos de tejido frente a muestras de sangre o a través de muestras humanas y murinas.
Muestras de tejido pancreático
Mouse se recogieron a las diferentes edades, desde el modelo de ratón Cre-p48 /LSL-Kras
G12D. epitelio del conducto pancreático en estos animales progreso a través de las lesiones displásicas tempranas y tardías, PanIN (= páncreas carcinoma in situ) durante el período de varios meses a cáncer invasivo y la progresión maligna de este modo mimético de la enfermedad humana [34], [35]. Cada muestra de tejido cosechado se representó por un análisis histológico de los cambios ductales pancreáticas (Figura 1A). tejidos de control contenían 100% de los conductos normales (Figura 1B). Páncreas de ratones más jóvenes (Figura 1C) contenía más de 50% de los conductos con lesiones displásicas de etapa temprana (PanIN-1 o -2). Páncreas de ratones de más edad (Figura 1D) contenía ~ 10% de los conductos con lesiones displásicas de última fase (PanIN-3), además de ~ 50% de los conductos con PanIN-1 o -2. PDAC tejidos contenían sobre todo adenocarcinoma invasivo (Figura 1E).
(A) La cuantificación de las alteraciones histopatológicas en el páncreas de ratones controles o G12D p48-Cre /Kras
. Las muestras se separaron en los controles, las lesiones displásicas etapa temprana (PanIN-1 y -2), lesiones displásicas de última fase (PanIN-3 presente) y adenocarcinoma del conducto pancreático invasiva (PDAC). (B a E) imágenes de histopatología representativos de cada uno de los grupos: (B) páncreas normal, (C) PanIN-1 y -2 (temprano), (D) PanIN-3 (tarde) y (E) PDAC. Se muestra la media ± error estándar de la% del tejido pancreático con las lesiones respectivas (n = 3 animales para cada grupo). 0, no se detectaron
El análisis de la expresión de miRs individuales mostró tres tendencias principales (Figura 2A-C):. En primer lugar, la expresión de miR-10, miR-16, miR-21, miR 100 y miR-155 aumentó a principios de lesiones PanIN relativas al control y mantenimiento de una alta expresión en la década de los tejidos PanIN y adenocarcinoma. (Figura 2A) En segundo lugar, miR-22, miR-148a /b, miR-212 y miR-375 fueron altamente expresado en los tejidos de control y su expresión se redujo en PanIN (Figura 2C), así como en los tejidos de adenocarcinoma. En tercer lugar, la expresión de miR-29b, miR-34a /c, miR-141, miR-199, miR-210c y miR-301a no cambió significativamente durante la progresión maligna (Figura 2B).
(A- C) Los niveles de expresión de miRs individuales en el control y tejidos pancreáticos en diferentes etapas de la transformación maligna. Los niveles de MIR se agruparon como el aumento de (A), constante (B), o disminuyendo (C) en base a una comparación de los niveles en cada grupo (n = 3 por grupo). Media ± error estándar se muestra para cada expresión de miR. (D) La agrupación jerárquica de los tejidos del ratón sobre la base de la expresión de miR. Distintos grupos se indican con el azul y el cuadro amarillo. (E) La agrupación jerárquica de MIR en función de sus niveles de expresión. MIR que se expresa en altos niveles en el control (caja azul) frente a los tejidos PDAC (caja amarilla) se indican. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001; control frente a principios de PanIN, PanIN tarde, o PDAC. #: Au & gt; 0,85 y p = 0,06, ##: au & gt; 0,85 y p & lt; 0,05, ###: au & gt; 0,90 y p & lt; 0,01. (Au, la probabilidad de aproximadamente imparcial).
agrupación diferenciada dentro del MIR y de los tejidos pancreáticos con diferentes estadios de la enfermedad
Un agrupamiento no supervisado de los tejidos de ratón en función de sus niveles de expresión de miR identificado tres grupos distintos (Figura 2D). Los tejidos de control separados de todos los demás tejidos en una agrupación de su propio (caja azul). Cinco de seis tejidos clasificados como lesiones in situ (PanIN) se agruparon juntos en un segundo grupo. adenocarcinoma invasivo y uno de los finales de los tejidos PanIN segregados en un clúster adicional (caja amarilla). Por lo tanto, el conjunto de miRs analiza aquí es suficiente para distinguir las diferentes etapas de mutantes Kras inducida por la progresión maligna pancreática.
agrupamiento no supervisado de los MIR individuales se realizó para determinar qué MIR se comportan de forma paralela y por lo tanto puede servir como firmas comunes coincidentes con el estadio de la enfermedad (Figura 2E). Un grupo (cuadro amarillo) contenía los MIR que mostraron la más alta expresión en los tejidos de adenocarcinoma y los más bajos en los tejidos de control. Un grupo separado (caja azul) mostró un patrón de expresión de miR recíproca, con los más altos niveles en los tejidos de control y los niveles más bajos de adenocarcinoma. Estas agrupaciones sugieren que un subconjunto de miRs puede definir la clasificación de un tejido que corroboran trabajos anteriores de otras personas con diferentes muestras de cáncer humano [16], [17].
Una comparación de los resultados en el modelo de ratón (Figura 1 & amp del ; 2) con los estudios publicados en los cánceres pancreáticos humanos muestra los mismos cambios cualitativos para la mayoría de doce miRs analizados en los dos ámbitos (Tabla S1; las referencias [7], [43], [44], [45]): Siete miRs regulados positivamente en cáncer en comparación con los tejidos normales en el modelo de ratón también se upregulated en los cánceres humanos. De los cinco MIR se encuentran regulados negativamente en el modelo de ratón, cuatro también se downregulated o no mostraron cambios en los estudios con muestras humanas. Sólo el miR-212 se reguló en humanos y regulado por disminución en las muestras PDAC ratón. Es tentador especular que la discordancia de miR-212 entre las muestras de ratón PDAC humanos y puede indicar las diferencias entre especies de las interacciones epitelio-estroma durante la progresión maligna [47]. En general, la estrecha coincidencia de MIR cambios en los tejidos pancreáticos malignos a través de especies ya través de diferentes estudios sugiere que adenocarcinoma pancreático clínica está bien representada por la p48-Cre /LSL-Kras
modelo animal G12D.
Expresión de miR genes diana y mIR en tejidos pancreáticos de ratón
los estudios recientes han demostrado que la actividad predominante de mIR (84%) es su impacto en el ARNm diana estado de los niveles [48]. Para assss esto en el modelo de ratón, se identificaron objetivos de mRNA candidatos de una lista imparcial de menores de ARNm expresado en cánceres pancreáticos humanos y se iguala con el panel de miR estudiado aquí (Tabla S3). El conjunto de búsqueda de genes regulados negativamente en el cáncer de páncreas contiene MLH1 como un objetivo previsto para el miR-155, y FGFR1 como una diana de miR-10. En una comparación de los tejidos normales y cancerosas cosechadas a partir de la expresión de ARNm modelos de ratón de MLH1 y de FGFR1 mostró una significativa relación inversa miR-155 y miR-10, respectivamente (Figura 3).
Los tejidos de p48-Cre /Kras
ratones G12D con adenocarcinoma pancreático ductal invasivo (PDAC) y el páncreas normal, se utilizó para la expresión de miR-10 y miR-155 en relación con los respectivos ARNm diana candidatos, FGFR1 y MLH1 utilizando RT-PCR cuantitativa. La media ± SEM de n = 3 en cada grupo; ***, P & lt; 0,001 normales frente a cáncer de
efecto del tratamiento con gemcitabina en el que circulan MIR en el modelo animal
La presencia de tejidos enfermos puede ser indicado por alterados concentraions miR en el. circulación (véase la Introducción). Como una extensión lógica, las concentraciones de miR en la circulación también podrían servir como marcadores de fácil acceso de la eficacia del tratamiento e incluso indicar vías alteradas por un tratamiento dado. Pusimos a prueba esta hipótesis en el modelo de ratón PDAC en relación con los animales control sin cáncer. Gemcitabina es un fármaco de primera línea que se utiliza en el tratamiento de pacientes con cáncer de páncreas y se administró durante una semana a animales con PDAC y para los animales de control de la misma edad. El programa de dosis y el tratamiento fueron adaptadas de otros estudios que han demostrado eficacia durante un largo periodo de tratamiento [49], [50]. Una pequeña muestra de sangre (& lt; 0,1 ml) se elaboró antes de la iniciación del tratamiento para comparar los niveles séricos de miR antes y después del tratamiento a través de estos dos grupos de animales. La presencia de PDAC en los p48-Cre /Kras
animales G12D se confirmó por análisis histológico de los tejidos pancreáticos al final del estudio. Se seleccionaron seis MIR que se encontraron upregulated y dos que se regulan a la baja en los tejidos PDAC relación con los controles (ver Figura 2). A & gt; rango de concentración de 10.000 veces de estos ocho miRs fue encontrado en la circulación de los animales (Figura 4A). Antes del tratamiento (Figura 4A, barras blancas), los niveles séricos de miR-10 y miR-155 se elevaron & gt; 2 veces (p & lt; 0,05) en el PDAC (rojo) frente al grupo de control (negro). Por el contrario, los niveles séricos de miR-21, miR-148b y miR-375, donde indistinguibles entre los grupos. tratamiento de gemcitabina (Figura 4A, barras rellenas) redujo los niveles séricos de miR-10, miR-21 y miR-155 en animales con PDAC y en los controles de 6 a 60 veces (p & lt; 0,05 a & lt; 0,01; Figura 4B) . Los niveles séricos de miR-100 y miR-375 se redujeron en un & gt; 2 veces después del tratamiento, aunque sólo los controles mostraron diferencias estadísticamente significativas (p & lt; 0,05). los niveles séricos de miR-148b no fueron alterados por el tratamiento y miR-16 aumentaron los niveles & gt; 5 veces después del tratamiento. Es de destacar que el tratamiento con gemcitabina de animales con PDAC reducción de los niveles séricos de miR-21, miR-10 y miR-155 por un adicional de 2, 3 y 6 veces por debajo de la reducción observada en los animales control, aunque sólo el miR 155 alcanzó significación estadística en la comparación de PDAC y de control (Figura 4B; p & lt; 0,05). Estos datos sugieren que el control de miRs apropiados en la circulación puede distinguir los efectos del fármaco sobre los tejidos enfermos de los efectos del fármaco sobre los tejidos no diana sanos.
(A) miR-niveles en muestras de suero recogidas antes (barras blancas) y después de un tratamiento de una semana con gemcitabina (5 dosis de 40 mg /kg). (B) Relación entre las concentraciones séricas antes /después del tratamiento con gemcitabina. La línea punteada indica una diferencia de dos veces. *, P & lt; 0,05; **, P & lt;. 0.01
miRs en la circulación de pacientes con otros tipos de cáncer de páncreas y
Nueve miRs diferentes se aislaron y se cuantificaron a partir de muestras de plasma de pacientes con cáncer de páncreas, otro cánceres gastrointestinales, y controles sin cáncer. Los diagnósticos de los pacientes se resumen en la Tabla S2. miR-100a y miR-10 fueron significativamente superiores en los pacientes con cáncer de páncreas en comparación con los controles sin cáncer, mientras que un número de los otros MIR (miR-16, 21, 155, 199, 221, y 223) mostró una tendencia de aumento de la expresión que no alcanzó significación estadística (Figura 5A). Otro subconjunto de miRs mostró significativas diferencias de expresión entre cáncer de páncreas y pacientes con cáncer de colon, pero no en relación con los pacientes con otros cánceres gastrointestinales. Los patrones de expresión de los diferentes miRs circulantes sugieren que algunos son mejores en distinguir entre pacientes con cáncer y sin cáncer, mientras que otros mejores distinguir los órganos enfermos.
Las muestras eran de pacientes con cáncer de páncreas, los controles no cancerosas, y los pacientes con otros tipos de cáncer GI. (A) Las concentraciones de nueve miRs detectados en la circulación muestra diferencias individuales entre los grupos de pacientes. Tenga en cuenta los diferentes rangos de las escalas de los ejes Y. (B) Análisis de los bosques al azar no supervisado comparando el cáncer de páncreas (círculos negros) frente a los controles sin cáncer con enfermedad pancreática (triángulo blanco), los controles no cancerosas sin enfermedad pancreática (círculos blancos), el cáncer del tracto gastrointestinal superior (círculos azules), cánceres de colon ( círculos rojos), y cánceres de hígado (círculos amarillos). Un círculo en rojo son la mayoría de los cánceres de páncreas. Las flechas indican dos muestras de pacientes con cáncer duodenal. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001. Características de los pacientes se presentan en la Tabla S2.
En un análisis aleatorio forestal sin supervisión que considera la expresión de los nueve miRs aisladas de la circulación, cinco de los seis pacientes con cáncer de páncreas agrupados juntos en un grupo separado de la mayoría de los otros pacientes (Figura 5B). Esto confirma que el patrón de expresión combinada de estos nueve miRs en la circulación fue suficiente para identificar a los pacientes con cáncer de páncreas como separado de pacientes con otros tipos de cáncer GI y controles. Destacan las dos muestras de pacientes con neoplasias duodenales (flechas) que agrupan más cerca de los pacientes con cáncer de páncreas, posiblemente debido a la participación de páncreas sin ser detectados en el momento del muestreo. Además, las muestras de los pacientes con controles de la enfermedad pancreática no cancerosas y no cancerosas agrupados indican que el panel de la expresión de miR es específico para el cáncer de páncreas en lugar de cualquier enfermedad se origina en el páncreas.
Discusión
El mutante Kras
G12D impulsada por el modelo de cáncer de páncreas ha sido bien caracterizado en numerosos niveles moleculares y biológicos [35], [36], [37], [38], [39]. Nuestro análisis de las muestras de tejido muestra que algunos cambios de miR asociados con el cáncer de páncreas invasivo ya son evidentes durante las primeras etapas de la enfermedad (Figura 2). Más sorprendente fue el grado en que cambios en la expresión de miR en el modelo animal imitaban miR expresión cambios observados en el cáncer pancreático humano (ver Tabla S1). De hecho, un subconjunto de miRs que incluye miR-10 y miR-155 se upregulated en tejidos de cáncer de páncreas de los pacientes y ratones, así como en las respectivas muestras de sangre. Por lo tanto, este estudio proporciona evidencia de que la similitud entre las especies de expresión de miR en el contexto de cáncer de páncreas está relativamente conservada, muy probablemente debido a la mutante Kras como un iniciador principal de esta patología [42]
.
La comparativa análisis de la expresión de miR durante la progresión maligna en el modelo de ratón nos permite extraer algunas conclusiones sobre miRs relevantes en la circulación que pueden indicar la presencia de lesiones precursoras. Habbe et al. [51] informó sobre los niveles de expresión de MIR en humanos intraductal papilar mucinoso neoplasias tejidos (TPMI), y concluyó que el miR-155 es aumentada y un posible biomarcador de la enfermedad de los tejidos pre-invasiva. Encontramos miR-155 que se upregulated en los conjuntos que contienen lesiones PanIN en el modelo de ratón y también encontró miR-155 upregulated en muestras de plasma de pacientes con cáncer pancreático. Otros estudios que evalúan circula a conclusiones similares miR-21, miR-210, miR-155 y miR-196a en diferentes grupos de pacientes con cáncer de páncreas se han basado en el potencial diagnóstico de MIR [52]. TPMI, neoplasia quística mucinosa (MCN), y PanIN representan tres lesiones precursoras conocidas del PDAC. Estos tres tipos de premalignancies tienen muchas similitudes genéticas y patológicas, sino también algunas de las características que permiten diferenciarlos [53]. Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que los niveles plasmáticos de miR-155 pueden de hecho representar un biomarcador que indica la presencia de lesiones PanIN.
MIR similares cambios en los tejidos y en la circulación nos sugieren que miRs se liberan de los tejidos enfermos de una manera continua posiblemente a través de los exosomas [54], [55] aunque puede haber mecanismos de liberación específicas que pueden favorecer algunas miRs sobre los demás [56]. Aquí nos centramos en su mayoría MIR que se elevan en los tejidos enfermos en lugar de aquellos cuya expresión se reduce o se pierde. Pensamos que la pérdida de un determinado MIR sólo tendrán impacto en los niveles de estado estable en la circulación si el órgano enfermo es la principal fuente de la MIR presente en la circulación. P.ej. miR-148a /b y miR-375 se downregulated muy fuertemente en el cáncer de páncreas con respecto a los tejidos normales de páncreas. miR-375 se ha demostrado que desempeñan un papel importante en el desarrollo de islotes pancreáticos [57], y la función, así como en el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa [58], [59] y hay que destacar que uno de los primeros síntomas de PDAC se puede adulto la aparición de diabetes mellitus. miR-148 se puede reprimir la expresión de DNMT3b través de una región en su secuencia de codificación [60] y por lo tanto puede afectar a los mecanismos de reparación del ADN
A pesar de a & gt;. reducción de 100 veces de miR-375 y miR-148a /b durante la transformación maligna de los tejidos pancreáticos, llama la atención que sus niveles de suero no se redujeron en los animales con PDAC (véase la Figura 2C y 4A). Esto sugiere que la contribución de páncreas a sus niveles séricos es pequeño. Es probable que esto también es cierto para el miR-21 donde el aumento de los niveles tisulares de & gt; 100 veces durante la transformación maligna pancreática en el modelo animal no se reflejan en el aumento de los niveles séricos (véase la Figura 2A y 4A). Por el contrario, el miR-10 y miR-155 niveles en suero se incrementan durante la transformación maligna de páncreas en ratones y en pacientes que apoyan la noción de que el órgano enfermo es un contribuyente importante a los niveles séricos de estos MIR (véase la Figura 4A y 5A).
estudios recientes del laboratorio de Bartel han demostrado que la actividad predominante de miRs es para disminuir los niveles de ARNm diana y se encontró que más del 84% de los efectos de miR en la producción de proteínas se debe a este agotamiento de ARNm diana [48]. Por lo tanto, miRs que están regulados al alza en la circulación de sujetos enfermos pueden coincidir con niveles reducidos de ARNm diana en el tejido enfermo de origen. Además, la hipótesis de que miRs encontró que aumentarse en la circulación de pacientes podría estar presente en niveles mucho más altos en los tissés enfermas debido a la dilución sobre su vertimiento en el torrente sanguíneo. Se identificaron los objetivos de mRNA candidatos y una lista imparcial de los ARNm insuficientemente expresado de cáncer de páncreas en comparación con los tejidos normales compilados a partir de diferentes estudios devueltos 154 ARNm que podrían ser cancerosas objetivos pertinentes MIR. Estos fueron comparados con el panel de miR estudiado aquí (Tabla S3).
El conjunto de genes de volver de este análisis contiene
MLH1
ha predicho como un objetivo para el miR-155. De hecho, la sobreexpresión de miR-155 en las líneas celulares dio como resultado la baja regulación de hMSH2, hMSH6 y el hMLH1. Además, se informó de una correlación inversa entre los niveles de expresión de miR-155 y las proteínas MLH1 o MSH2 para los cánceres colorrectales humanos [61]. MLH1 es una proteína de reparación de falta de coincidencia que contribuye a la acumulación de errores genéticos en el contexto de cáncer de páncreas familiar y algunos casos esporádicos [34]. se encontró que su mRNA downregulated en muestras de cáncer de páncreas y de una fracción de la pérdida de expresión de MLH1 mRNA en los cánceres de páncreas se ha atribuido a la hipermetilación del promotor [62]. Se ha observado una relación inversa significativa entre la expresión de miR-155 y mRNA MLH1 en la comparación de los tejidos normales y cancerosas (Figura 3A). Además, FGFR1 ARNm se encontró en downregulated adenocarcinoma pancreático humano (Tabla S3) y se observó una regulación a la baja significativa en el modelo de ratón PDAC relativa a los tejidos normales (Figura 3B). Estos hallazgos con miR-10 y miR-155 y su objetivo predicho ARNm MLH1 y FGFR1 apoyan la idea de una posible función reguladora de estos MIR durante la progresión maligna.
En otra serie de estudios en animales con potencial clínico directa aplicación, hemos probado si MIR podría indicar la eficacia del fármaco. El intervalo de concentraciones circulantes de miRs monitoreados en estos experimentos es & gt; 10.000 veces y el impacto del tratamiento farmacológico no tenía relación con la concentración de pre-tratamiento de las ocho miRs monitorizados (Figura 4A). Después de que se encontró que el tratamiento con gemcitabina miR-16 aumento en el suero por 5 veces en PDAC, así como animales de control. la expresión de miR-16 se asocia con la apoptosis [63], la supresión del crecimiento a través de p53 [64] y la supresión de tumores [65]. El aumento de este miR-16 en los de cáncer de circulación y control de los animales coincide con la actividad citotóxica del fármaco en los tejidos sanos. En contraste con este aumento, los niveles séricos de miR-148b no se vieron afectados después del tratamiento con medicamentos y suero de miR-10 y miR-155 se redujeron al máximo (de 30 y 60 veces) después del tratamiento con gemcitabina. Estos dos miRs se habían encontrado niveles elevados en el suero de animales PDAC relación con los controles antes de la iniciación del tratamiento con fármacos. Por otra parte, los niveles séricos de miR-10 y miR-155 en los animales tratados con PDAC cayeron por debajo de los niveles en suero de los animales de control tratados (Figura 4A & amp; B) que sugieren como indicadores potenciales de los efectos específicos del tumor del tratamiento. En general, los resultados de este entorno experimental apoyan el concepto de eficacia selectiva de cáncer de páncreas Gemcitabina aunque los efectos sobre la homeostasis de otros tejidos sanos también se hicieron evidentes.
Conclusión
MIR cambios en los tejidos y la circulación muestran notables similitudes entre el cáncer de páncreas en pacientes y el p48-Cre /Kras
G12D modelo de ratón de la enfermedad. Más allá de la mimcry de patología molecular humana en el modelo de ratón, los MIR firma identificados aquí pueden también servir como indicadores informativos de la eficacia del fármaco en el desarrollo de la sustancia o combinación de terapias individuales que se necesitan desesperadamente [42] de esta devastadora enfermedad.
Materiales y Métodos
ratón análisis de tejidos
protocolos de los estudios con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales de la Universidad de Georgetown y el empleo Comisión (GUACUC#08-028). La p48-Cre /LSL-Kras
modelo G12D ratón se ha descrito anteriormente [35]. En el control, a finales PanIN y grupos de adenocarcinoma, los ratones fueron sacrificados a los 16 meses de edad. Los controles no tenía las KRAS
G12D o el alelo p48-CRE. Para el grupo PanIN temprana, los ratones en un mes de edad fueron tratados con caerulin y se sacrificaron a los cuatro meses de edad siguiendo un protocolo establecido [66]. Páncreas se dividía en dos desde la cola hasta la cabeza con una mitad fija en formalina y la otra mitad se congeló en nitrógeno líquido. Un patólogo obtuvo la calificación más alta por PanIN lóbulo de todos los lóbulos contados en un representante de H & amp; E de diapositivas de páncreas de cada ratón [35] manchada. "Normal" incluye cualquier cambio normal y reactiva ductal. PanIN-1 y -2 se combinaron en una sola categoría de "primeros" lesiones mientras que los tejidos con PanIN-3 fueron incluidos en una categoría separada de las lesiones "tarde", debido a la alta probabilidad de progresión maligna.
miR y la expresión de ARNm en el ratón de páncreas
tejido
ARN total fue extraído de los tejidos utilizando el reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) como se describe por el fabricante. miRs se aislaron más lejos de la ARN total usando un kit de aislamiento de miR (SA Biosciences, Frederick, MD). El MIR fue convertido a cDNA utilizando poli TIZÓN seguido de cebado universal, con el Kit de miR la primera cadena y se cuantificó usando pre-diseñado de miR qPCR específica (SA Biosciences, Frederick, MD) en un sistema HT Real-Time PCR ABI 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA). la cuantificación de ARNm se describe en [46]. En resumen, el cDNA se sintetizó usando el ARN total extraído y el Kit de Síntesis de ADNc iScript, de acuerdo con el protocolo del fabricante (Bio-Rad Laboratories). QRT-PCR se realizó usando iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories) en un iCycler (BioRad) con: 95 ° C durante 3 min seguido de 40 ciclos (95 ° C durante 20 s, 60 ° C durante 30 seg y 72 ° C durante 40 seg) y la etapa de curva de fusión (95 ° C durante 1 min, 55 ° C durante 1 min, el aumento de gradiente de temperatura de 50 ° C por 0,5 ° C cada 10 segundos en los 80 ciclos siguientes). MLH1 cebador directo: GCGGCACCCACTTCCAGTCC; Reverso: CGGAGAGTCTCATGGCACCGC. FGFR1 cebador directo: GTAGCTCCCTACTGGACATCC; cebador inverso:. GCATAGCGAACCTTGTAGCCTC
Detección y cuantificación de miR en muestras de sangre humana y de ratón
muestras de sangre humana se obtuvieron de la biorepositorio del Centro de Cáncer Lombardi que recoge muestras de cáncer y no cáncer en anónimos pacientes con fines de investigación. Se analizaron de forma anónima los datos. la sangre de ratón (& lt; 0,1 ml) se recogieron a través de sangrado submandibular utilizando una lanceta [67]. Las muestras de suero o plasma se mezclaron en una proporción de 1:10 con el reactivo de lisis Qiazol y se agitó. El lisado se extrajo con CHCl3 y la fase acuosa se procesa adicionalmente para el ARN total utilizando el kit miRNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA) y enriquecido para los genes miARN usando el kit de aislamiento de RT2 qPCR-Grade miRNA, MA-01 (SABiosciences).
tratamiento de gemcitabina de animales
la gemcitabina se obtuvo de la farmacia del hospital y se administró a 22-23 meses de edad p48-Cre /Kras
G12D o la edad coincide con los animales de control a los 40 mg /kg en 5 dosis en el transcurso de una semana. Esta dosis de 200 mg /kg /semana se basó en Refs. [49], [50]. Se extrajo sangre antes de iniciar el tratamiento (& lt; 0,1 ml) y un día después de la última dosis. La presencia de PDAC se confirmó en el G12D p48-Cre /Kras
mediante análisis histológico postmortem
Análisis de los datos
Los métodos de procesamiento de datos se codifican en R (http: //www. .R-project.org). La agrupación jerárquica se realizó basado en la media centrada y reducido los niveles de expresión de miR.