Extracto
Antecedentes
Homeodominio interacción proteína-quinasa 2 (HIPK2) es un multifuncional proteína que explota su actividad de quinasa para modular las vías moleculares clave en el cáncer de restringir el crecimiento del tumor e inducir la respuesta a los tratamientos. Por ejemplo, HIPK2 knockdown induce la regulación positiva de la actividad oncogénica inducible por hipoxia factor 1 (HIF-1) que conduce a un hipóxico constitutiva y el fenotipo angiogénico con el aumento de crecimiento del tumor
in vivo
. inhibición HIPK2, por lo tanto, libera vías que conducen a la producción de moléculas pro-inflamatorias tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o prostaglandina E2 (PGE
2). mediadores de la inflamación del tumor producidos distintos de promover el crecimiento del tumor y desarrollo vascular puede permitir la evasión de la respuesta inmune anti-tumorales. Por lo tanto, la disfunción células dendríticas (DCs) inducida por moléculas producidas con el tumor, puede permitir que las células tumorales escapen inmunovigilancia. Aquí evaluamos el mecanismo molecular de PGE
2 de producción después de la depleción HIPK2 y cómo modular la misma.
Metodología /Principales conclusiones
Se demuestra que HIPK2 caída en las células del cáncer de colon como resultado de la ciclooxigenasa -2 (COX-2) y la regulación positiva derivada de COX-2 PGE
2 generación. A nivel molecular, la COX-2 upregulation dependía de la actividad de HIF-1. Hemos informado anteriormente de que el tratamiento de zinc inhibe la actividad de HIF-1. En este caso, la administración de suplementos de zinc a las células HIPK2 empobrecido inhibió inducida por HIF-1 y la expresión de COX-2 y la producción de PGE
2 /VEGF. A nivel de la traducción, países en desarrollo, mientras que los medios de comunicación condicionado de tanto control de siRNA y HIPK2 agotadas las células inhibidas maduración, los medios de comunicación de las células HIPK2 empobrecido tratados sólo con zinc acondicionado restaurado de manera eficiente maduración países en desarrollo, visto como la expresión de moléculas coestimuladoras CD80 y CD86, citoquina IL- 10 de liberación, y la fosforilación de STAT3
Conclusión /Importancia
Estos hallazgos muestran que:. 1) HIPK2 caída inducida por la COX-2 regulación al alza, sobre todo en función de la actividad de HIF-1; 2) tratamiento con zinc downregulated HIF-1 inducida por la COX-2 y se inhibe PGE
2 de producción /VEGF; y 3) el tratamiento de las células de cinc empobrecido HIPK2 restaurado maduración países en desarrollo
Visto:. Garufi A, G Pistritto, Ceci C, Di Renzo L, R Santarelli, Faggioni A, et al. (2012) Orientación de la COX-2 /PGE
2 ruta en células de cáncer HIPK2 Derribo: Impacto en la maduración de las células dendríticas. PLoS ONE 7 (11): e48342. doi: 10.1371 /journal.pone.0048342
Editor: Kjetil Tasken, Universidad de Oslo, Noruega
Recibido: 15 de Junio, 2012; Aceptado: September 24, 2012; Publicado: 7 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Garufi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Asociación italiana para la Investigación del cáncer (AIRC) de GDO (n. ° 11377) y AF (n. 10265). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Homeodominio interacción proteína-quinasa 2 (HIPK2) es una quinasa multifuncional cuya actividad frena la progresión del tumor. HIPK2 fosforila y activa oncosuppressor p53 para la función apoptótica en respuesta a los fármacos [1], [2]. HIPK2 también reprime rutas implicadas en la progresión del tumor, tales como Wnt /β-catenina de señalización, por medio de su función de la actividad y la transcripción represión catalítico [3], [4]. Más recientemente, se encontró que inhibe la HIPK2 1α factor inducible por hipoxia (HIF-1α) subunidad a nivel transcripcional. HIF-1 es un factor de transcripción heterodimérico que induce la transcripción de más de 60 genes implicados en la angiogénesis, metabolismo de la glucosa y la invasión [5]. HIF-1 consta de la subunidad HIF-1β, constitutivamente expresada en las células, y la subunidad HIF-1α sensible al oxígeno. El aumento de los niveles de HIF-1α se encuentran frecuentemente en muchos cánceres humanos y son estimulados por el bajo nivel de oxígeno, sino también por alteraciones genéticas. En este sentido, HIPK2 knockdown induce upregulation HIF-1α con el aumento de la actividad de HIF-1 conduce a la producción de crecimiento endotelial vascular (VEGF), la angiogénesis tumoral y la quimiorresistencia [6], [7]. En un intento de dirigir la actividad de HIF-1, previamente demostrado que los iones de zinc permiten HIF-1α la degradación de proteínas en células de cáncer que conduce a la represión de HIF-1 vía
in vitro
y
in vivo
[8] con la restauración de la quimiosensibilidad [9].
Aparte de inducir la expresión de VEGF, HIPK2 caída conduce a la biosíntesis de E2 aumento de la prostaglandina (PGE
2) que se correlaciona con el crecimiento del tumor
in vivo
[10]. PGE
2 es la prostaglandina más abundante que se encuentra en el cáncer colorrectal y favorece el crecimiento del tumor mediante la estimulación de la proliferación, angiogénesis, y la invasividad, y mediante la inhibición de la apoptosis [11]. PGE
2 activa los componentes del sistema de señalización Wnt oncogénico que conducen a la estabilización y la activación de β-catenina como factor de transcripción para inducir la expresión de varios genes, incluyendo la ciclooxigenasa-2 (COX-2), c-myc, ciclina D1, y PPAR que están involucrados en la progresión del tumor [12].
la generación de prostaglandinas a través de COX-2 es una vía importante en la patogénesis del cáncer colorrectal, pero también de otros tipos de cáncer [13]. COX-2, una forma inducible de la ciclooxigenasa, cataliza la conversión de ácido araquidónico (AA) para endoperóxido intermedios que se convierten finalmente en prostaglandinas (PGE2, PGD2, PGF2a, PGI2, y TxA2). COX-2 se induce en respuesta a mediadores inflamatorios, factores de crecimiento, activación de oncogenes y promotores tumorales [14]. Por lo tanto, los niveles elevados de COX-2 se han encontrado en muchos tipos de cáncer [15] - [17]. control de la transcripción del gen de la COX-2 depende de la maquinaria molecular que interactúan con el promotor de la COX-2, que parece estar controlada a través de la actividad de diversas vías de señalización [18]. Entre ellos, las vías oncogénicas tales como la señalización de Wnt /β-catenina [19] o HIF-1 [20] pueden aumentar la COX-2 transcripción de genes. Se ha encontrado que activado por HIF-1 de la COX-2 /PGE
2 eje induce VEGF y promueve la angiogénesis [21], que a su vez potencia la HIF-1 actividad transcripcional [22]. Tal diafonía entre las vías de señalización conduce a un bucle autorregulador que es beneficioso para la progresión del tumor. Por lo tanto, la orientación HIF-1 es una estrategia funcional para abolir rutas implicadas en la progresión del tumor, tales como COX-2 /PGE
2 /VEGF.
Las células tumorales a menudo producen moléculas inflamatorias que en el microambiente, otro de promover el crecimiento del tumor y desarrollo vascular, permitir la evasión de la respuesta inmune anti-tumorales [23]. PGE
2, ya que otros factores liberados tumorales, se ha demostrado que suprimir la respuesta inmune y permitir que las células tumorales escapen inmunovigilancia induciendo, por ejemplo, las células dendríticas locales y sistémicos (DCs) disfunción [24], [25]. DC son potentes células presentadoras de antígeno (APC) y como tales tienen un papel crucial en la iniciación de una respuesta inmune. Los países en desarrollo están altamente especializados en la captura de antígeno, procesamiento y presentación, y después de la maduración que expresan moléculas coestimuladoras (es decir, CD80 y CD86), que activa los linfocitos T [26]. Su papel en la obtención de respuestas específicas de tumor y la regresión del tumor posterior ha sido ampliamente demostrado a través de
in vivo
estimulación vacuna o
ex vivo
DC inmunoterapia [26]. Deterioro de la maduración países en desarrollo puede depender de factores-lanzado tumorales inducen la inmunosupresión. Por lo tanto, un defecto en el sistema de DC es uno de los principales factores responsables para el escape del tumor [27], [28].
Sobre la base de las observaciones anteriores, el objetivo de este estudio fue primero para evaluar la función de la COX-2 en los PGE
2 generación tras el agotamiento HIPK2. Se encontró que HIPK2 caída llevó a inducida por HIF-1 de la COX-2 y la regulación positiva derivada de la COX-2 PGE
2 producción. Curiosamente, el tratamiento zinc downregulated expresión COX-2 y se inhibe PGE
2 generación y sus vías de señalización, así como VEGF HIF-1 inducida. Luego, a nivel funcional, mientras que los medios acondicionados de ambos siRNA control y las células agotadas HIPK2 inhibida maduración países en desarrollo, sólo el medio de células HIPK2 empobrecido tratados con zinc acondicionado, que mostró una fuerte PGE
2 y regulación a la baja de VEGF, eficiente restaurado maduración países en desarrollo.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
el estudio fue aprobado por el Comité ético del Policlínico Umberto I, Universidad la Sapienza, Roma, Italia.
las células, cultura Condiciones, tratamientos y medios acondicionados
RKO humano (cáncer de colon) y la forma estable interferido HIPK2-RKO-siHIPK2 [29] las células se mantuvieron rutinariamente en RPMI-1640 (Life-Tecnología-Invitrogen) medio, mientras HCT116 (cáncer de colon), 293 (células renales embrionarias humanas) y el Doxyclyclin (Dox) MCF7 (cáncer de mama) inducible por células (MCF7indsi /HIPK2) expresando HIPK2 injerencia [30], se mantuvieron rutinariamente en DMEM (Life-Tecnología Invitrogen) medio, que contiene todos los 10% de suero inactivado por calor bovino fetal (FBS), 100 unidades /ml de penicilina /estreptomicina, y glutamina, en 5% de CO
2 incubador humidificado a 37 ° C. Para los suplementos de cinc, las células subconfluentes se trataron con 100 mM ZnCl
2 durante 24 h. Para knockdown HIPK2 inducible, se añadió Dox (1 mg /ml) a las células /HIPK2 MCF7indsi cada 3 días hasta que knockdown HIPK2 se alcanzó con éxito (por lo general en unos 5 días). Después de alcanzar caída HIPK2, las células fueron cultivadas sin Dox durante 5 días adicionales para la reversión de agotamiento HIPK2.
Para obtener el medio condicionado (CM), el control de la RKO siRNA y siHIPK2 agotan las células se sembraron a 6 × 10
5/60 mm2 placa de Petri y se cultivaron hasta 60% de confluencia. A partir de entonces, el medio se reemplazó, y los sobrenadantes (es decir, medio acondicionado) se recogieron 48 h más tarde. Se añadió ZnCl
2 (100 mM) durante 24 h.
La extracción de RNA y transcripción reversa Análisis (RT) -PCR
Las células fueron cosechadas en el reactivo TRIzol (Invitrogen) y el ARN total fue aislado siguiendo las instrucciones del fabricante. ADNc se syntesized de 2 g de RNA total con MuLV el kit de transcriptasa inversa (Applied Biosystems). Semi-RT-PCR cuantitativa se llevó a cabo mediante el uso de Hot-Master Taq polimerasa (Eppendorf) con 2 l de reacción de ADNc y genes oligonucleótidos específicos bajo condiciones de amplificación lineal. PCR se realizó por duplicado en dos conjuntos diferentes de ADNc. Los productos de PCR se corrieron en un gel de agarosa al 2% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio con luz UV. El servicio de limpieza β-actina o genes 28S se utilizaron como estándar interno. Se aplicó el análisis densitométrico de cuantificar los niveles de ARNm específicas en comparación con el estándar interno. Los datos presentados son representativos de al menos tres experimentos independientes.
inmunotransferencia
extractos de células totales se prepararon mediante incubación a 4 ° C durante 30 minutos en tampón de lisis (50 mmol /L de Tris-HCl , pH 7,5, 150 mmol /l de NaCl, 150 mmol /L de KCl, 1 mmol /L de ditiotreitol, 5 mmol /L EDTA, pH 8,0, 1% Nonidet P-40), además de una mezcla de inhibidores de proteasa (Sigma Chemical Company) y inhibidores de la fosfatasa, y se resolvieron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Las proteínas se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore). Las membranas se bloquearon con leche en polvo desnatada al 5% en PBS y se incubaron con anticuerpos primarios que reconocen la COX-2 (Cayman Chemical), β-catenina (Santa Cruz Biotechnology), ciclina D1 (M-20, Santa Cruz, amablemente proporcionados por el Marco Crescenzi , ISS, Roma, Italia), monoclonal de ratón anti-HIF-1α (Novus Productos Biológicos, UCS de diagnóstico, Italia), p-STAT3 (Y705), STAT3 total (de Señalización celular Tecnología), y β-actina (Calbiochem). anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (Bio-Rad) se utilizó en 1:5000. La inmunorreactividad se detectó mediante kit de quimioluminiscencia (kit ECL, Amersham Corporation).
Transfección y plásmidos
293 células fueron transfectadas mediante el uso de la N, N-bis- (2-hidroxietil) -2amino versión -ethanesulphonic ácido-tamponada salinr (BBS) del procedimiento de fosfato de calcio [31], mientras que RKO y HCT116 se transfectaron usando el método LipofectaminePlus polímero catiónico (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cantidad de plásmido de ADN se igualó en cada muestra por la suplementación con vector vacío y la eficiencia de la transfección se visualizó con el uso de un vector de expresión GFP co-transfectado. Los plásmidos de expresión utilizados fueron: la forma dominante negativa de HIF-1α sin ADN de dominio y dominio de transactivación (pCEP4-HIF-1α-DN) [32] (amablemente proporcionado por BH Jiang, Nanjing Medical University, República Popular China), HIF-1α vinculante vector de expresión (proporcionado amablemente por A. Farsetti, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Roma, Italia) y el vector de expresión de HA-BVS (amablemente proporcionado por WK Rathmell, University of North Carolina en Chapel Hill, EE.UU.).
ARN de interferencia
las células se sembraron a semiconfluence en placas de 35 mm el día antes de la transfección. Control de siRNA y específica siHIF-1α (Dharmacon), o pSUPER-HIPK2 y vectores de control pSUPER [29] fueron transfectadas durante la noche utilizando el reactivo LipofectaminePlus (Invitrogen). 36 h más tarde las células fueron tratadas con 100 mM ZnCl
2 para 24 h. La eficacia de transfección se visualizó con el uso de un vector de expresión de GFP co-transfectadas con un microscopio fluorescente. La eficiencia de la precipitación se confirmó por análisis RT-PCR.
Ensayo ELISA
Las células cultivadas a subconfluencia en 60 mm placas de Petri se cultivaron durante 24 h con 0,5% de FBS antes de añadir medio fresco con 10 % febrero con o sin la COX-2 selectivo inhibidor de NS-398 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EE.UU.) a 50 nM durante 24 h ó 100 mM ZnCl
2 durante 24 h con. PGE
2 y la detección de VEGF en el medio condicionado de células se determinaron por triplicado por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) utilizando, respectivamente, el kit de la prostaglandina E2 EIA (Cayman Chemical) y el kit de inmunoensayo VEGF humano Quantikine (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PGE niveles
2 y VEGF se normalizaron al número de células y se expresaron como pg /10
6 células /ml.
Para la producción de IL-10 por países en desarrollo, el medio acondicionado de control de siRNA y siHIPK2 células agotadas , sin tratar o tratadas con 100 mM ZnCl
2 durante 24 h, se añadieron a la cultura DC en placas de 96 pocillos, 1/1 (vol /vol) con medio que contiene IL-4 y GM-CSF, por 24 h. Epílogo, se añadió TNF-α durante 48 h para la maduración países en desarrollo. a continuación, IL-10 de producción por países en desarrollo se ensayó mediante ELISA utilizando reactivos y estándares (RayBiotech, Inc.) disponibles comercialmente. Se añadieron los sobrenadantes por duplicado a las placas pre-recubiertas adecuadas. Después las placas se lavaron, se añadió anticuerpo de detección conjugado con peroxidasa de rábano picante. El sustrato usado para el desarrollo del color era tetrametilbencidina (TMB). La densidad óptica se midió a 450 nm con un lector de microplacas (Multiskan Ex, Thermo Labsystem). La dosis mínima de detección de IL-10 es típicamente menos de 1 pg /ml.
Generación de células dendríticas derivadas de monocitos (DC) y la maduración países en desarrollo
Para generar las DC derivadas de monocitos, humana células mononucleares de sangre periférica (PBMC), obtenidas de donantes sanos (menos de consentimiento informado) se aislaron por centrifugación en gradiente de Fycoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Suecia) a partir de capas leucocitarias. + monocitos CD14 se seleccionaron positivamente usando microperlas magnéticas anti-CD14 MAb conjugados (Miltenyi Biotec, Auburn, California, EE.UU.). Los monocitos purificados se cultivaron a una densidad de 10
6 células /3 ml en placas de 12 pocillos durante 6 días en RPMI 1640 (Euroclone) que contenía suero de ternera fetal al 10% (FCS), 2 mM L-glutamina, 100 U /ml de penicilina G, 100 mg /ml de estreptomicina y el factor de colonias de granulocitos-macrófagos humano recombinante estimulante (GM-CSF, 50 ng /ml) y la interleucina 4 (IL-4, 20 ng /ml) (Miltenyi Biotec) para generar el DC inmaduras (iDC). Las citoquinas se reponen cada día junto con medio fresco 20%. Para la activación IDC, humana recombinante TNF-α (20 ng /ml; Miltenyi Biotec) se añadió en el día 6 durante 48 horas para inducir la maduración países en desarrollo
Análisis de DC fenotipo por citometría de flujo
. Los monocitos purificados se cultivaron durante 6 días con GM-CSF e IL-4, con o sin 20% (vol /vol) de medio acondicionado (CM) de células cancerosas no tratadas o tratadas con 100 mM de zinc durante 24 h o con anticuerpo monoclonal VEGF (R & amp; D Systems, Inc.) (amablemente proporcionados por F. Spinella, Instituto Nacional del cáncer Regina Elena, Roma, Italia). Epílogo, se añadió TNF-α por 48 h para maduración países en desarrollo y el fenotipo DC analizadas por citometría de flujo. Ficoeritrina (PE) conjugado con anticuerpos anti-CD86 conjugados con FITC (Becton Dickinson, San Diego, CA) se utilizaron para tinción de la superficie celular anti-CD80 y. Las células se incubaron con los anticuerpos durante 30 minutos a 4 ° C y se lavaron dos veces en PBS antes de los análisis. DC fueron cerrada en función de sus propiedades FSC y SSC. controles de isotipo apropiados se incluyeron y 5.000 viable DC fueron adquiridas para cada experimento. La citometría de flujo adquisición se realiza con un citofluorımetro EPICS XL Coulter (Hialeah, FL).
Análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron menos que se indique lo menos tres veces. Todos los resultados experimentales se expresaron como la media aritmética y se muestran la desviación estándar (S.D.) de las mediciones. Estudiante de
t-test
se utilizó para la significación estadística de las diferencias entre los grupos de tratamiento. El análisis estadístico se realizó mediante análisis de la varianza en el 5% (p & lt; 0,05) o 1% (p & lt; 0,01).
(A) HIPK2 y COX-2 perfil de expresión génica en tumores primarios. El
diagramas de caja
representan HIPK2 (
panel izquierdo
) y la COX-2 (
panel de la derecha
) niveles de mRNA en muestras de 1) dos puntos, 2) el recto y 3 ) de adenocarcinoma de colon tumores primarios. * P & lt; 0,001. análisis (B) Semi-RT-PCR cuantitativa de HIPK2 y COX-2 expresión génica en células RKO de forma estable interferido para la función HIPK2 (siHIPK2) o con la no diana ARN de interferencia (siRNA). 28S se utilizó como control interno. análisis (C) Representante RT-PCR de células HCT116 transfectadas con pSuper-HIPK2 (siHIPK2) o control pSuper (siRNA) vector para 48 h. 28S se utilizó como control interno. (D, panel izquierdo) analiza Representante RT-PCR de células MCF7-indsi /HIPK2 tratados con Dox (DOX +) durante 5 días (para knockdown HIPK2) y después se cultivaron sin Dox (DOX-) durante 5 días adicionales (para la recuperación HIPK2) . (D, panel derecho) El análisis densitométrico de HIPK2 y los niveles de COX-2 (como en el panel de la izquierda) se realizó y los valores normalizados a los niveles de ARNm 28S se representaron. * P = 0,001. (E) los extractos de células totales de RKOsiHIPK2 y células siRNA de control se analizaron por inmunotransferencia Western para evaluar la COX-2 niveles de proteína. β-actina se utilizó como control de carga de proteínas.
Resultados y Discusión
correlación inversa entre la baja y la alta HIPK2 la COX-2 niveles de expresión en células de cáncer
Para hacerse una idea de la
in vivo
relación entre la COX-2 y HIPK2 se realizó un
in silico-
análisis de co-expresión comparación de diferentes estudios de microarrays de varios tejidos normales y tumorales de colon de la Oncomine integrada herramienta de investigación de base de datos de cáncer (http://www.oncomine.org). Los análisis de conjuntos de datos obtenidos a partir de muestras de tejidos normales y adenocarcinomas primarios de colon revelaron una correlación inversa entre HIPK2 y COX-2 de expresión. Así, la expresión HIPK2 fue alta en tejidos normales y significativamente reducida en adenocarcinomas de colon, mientras que la COX-2 expresión fue baja en tejidos normales y aumentó significativamente en adenocarcinomas de colon (Fig. 1A). A continuación tratamos de investigar si HIPK2 jugó un papel en la regulación de la COX-2. Como se muestra en la Fig. 1B, el aumento se observaron COX-2 niveles de expresión en células de cáncer de colon RKO de forma estable para la función interferido HIPK2 (siHIPK2) [29], en comparación con las células control siRNA. Similar correlación inversa entre la baja HIPK2 y los altos niveles de COX-2 se encontró en las células de cáncer de colon HCT116 sometidos a depleción transitoria HIPK2 por siRNA (Fig. 1C), lo que implica un papel para HIPK2 en COX-2 expresión de ARNm en células de cáncer. A fin de confirmar este hallazgo, nos aprovechamos de los Dox-inducible células de cáncer de mama MCF7 (MCF7indsi /HIPK2), donde DOX tratamiento induce HIPK2 regulación a la baja [30], la obtención de resultados esencialmente similares. Así, el tratamiento Dox (Dox +) reducción de la expresión de ARNm que HIPK2 significativamente correlacionada con la COX-2 upregulation, como también lo demuestra el análisis densitométrico (Fig. 1D). Posteriormente, la reversión del agotamiento de la eliminación HIPK2 Dox (Dox -), restauró los niveles de COX-2 de expresión génica de manera similar a los que empiezan la COX-2 niveles de control de las células, como también lo demuestran los análisis densitométricos (Figura 1D.). A continuación, inmunotransferencia mostró un incremento en los niveles de proteína COX-2 en las células agotadas HIPK2-RKO, en comparación con las células control siRNA (Fig. 1E). Estos resultados muestran, por primera vez, una correlación inversa entre HIPK2 y COX-2 de expresión en células de cáncer de colon que fue confirmado curiosamente sondeando el conjunto de datos Oncomine de los tejidos normales y cancerosas, lo que indica que esta podría ser una firma típica cáncer. Por otra parte, el efecto de la COX-2 upregulation en las células de cáncer de mama después de la inhibición HIPK2 puede también ser tomada en consideración.
(A) analiza Representante de RT-PCR de células RKO-siRNA y RKO-siHIPK2 de control transfectadas con HIF -1α dominante negativo (HIF-1αDN) durante 36 h. Se muestran la COX-2 mRNA y los niveles de VEGF. β-actina se utilizó como control interno. análisis (B) RT-PCR de células RKO-siHIPK2 fueron transfectadas con siRNA para la caída de HIF-1α o control siRNA. Después de la transfección de ARN total fue extraído y RT-PCR se realizó para evaluar HIF-1α, COX-2 y la expresión de VEGF niveles. β-actina se utilizó como control interno. Se muestra un experimento representativo de tres experimentos independientes. análisis (C, panel izquierdo) RT-PCR de células RKO-siHIPK2 transfectadas con vector de expresión de VHL (+) o con el vector vacío (-). Después de la transfección de ARN total fue extraído y RT-PCR se realizó para evaluar la COX-2 y la expresión de VEGF niveles. β-actina se utilizó como control interno. (C, panel derecho) Análisis densitométrico de los niveles de COX-2 y VEGF (como en el panel de la izquierda) se realizó y los valores normalizados de ß-actina niveles de mRNA se representaron. * P = 0,001. (D) 293 células fueron transfectadas con vector de expresión de HIF-1α (+) o con el vector vacío (-). Después de la transfección de ARN total fue extraído y RT-PCR se realizó para evaluar HIF-1α, COX-2 y la expresión de VEGF niveles. β-actina se utilizó como control interno. Se muestra un experimento representativo de tres experimentos independientes.
Mejora de la COX-2 expresión en células HIPK2 de derribo a través de HIF-1α
Uno de los mecanismos que mejoran la COX-2 transcripción es a través de HIF-1 actividad [20]. knockdown HIPK2 induce la actividad de HIF-1, visto como un aumento de la transcripción de genes VEGF y la angiogénesis, por derepressing promotor HIF-1α transcripción [6]. Con el fin de examinar si HIF-1α está involucrado en COX-2 expresión, se realizaron varios enfoques genéticos. RKO de forma estable para la función interfirió HIPK2 (siHIPK2) eran principalmente utilizado y la eficacia de transfección se controló con el uso de un vector GFP co-transfectadas largo de los experimentos. Para explorar el efecto de HIF-1α en la transcripción del gen de la COX-2, primer lugar hemos realizado experimentos de pérdida de función con un HIF-1α dominante negativo (HIF-1αDN) construir sin unión al ADN y el dominio de transactivación que inhibe la HIF-1 actividad [32]. RT-PCR análisis mostró que la expresión de HIF-1αDN reduce notablemente los niveles de COX-2 en células RKO-siHIPK2 (Fig. 2A), lo que sugiere HIF-1 dependiente de la transcripción regulación de la COX-2. Este efecto fue acompañado con el observado en HIF-1 VEGF gen diana (Fig. 2A). Entonces, el agotamiento de HIF-1α en las células RKO-siHIPK2 por interferencia siRNA específico mostró que HIF-1α downregulation inhibió tanto la COX-2 y el gen VEGF expresión (Fig. 2B). Como un enfoque adicional para inhibir la actividad de HIF-1, overexpressed proteína von Hippel-Lindau (VHL) que se ha demostrado que inhiben la actividad de HIF-1 por la orientación HIF-1α para la degradación proteasomal [33]. Como se muestra en la Fig. 2C, VHL sobreexpresión en células RKO-siHIPK2 inducidas eficiente COX-2, así como la regulación por disminución de VEGF, como se evidencia por análisis densitométrico. Finalmente, para confirmar adicionalmente el efecto de HIF-1 en la regulación de la COX-2, transfectadas vector de expresión de HIF-1α en células 293 la observación de que había una mejora significativa tanto de la expresión del ARNm de la COX-2 y VEGF, en comparación con las células control (Fig . 2D). Tomados en conjunto, estos resultados proporcionan una fuerte evidencia de que la COX-2 regulación al alza, tras HIPK2-desmontables, dependía, al menos en parte, de la actividad de HIF-1 según ha confirmado el efecto observado en el gen VEGF HIF-1- objetivo.
293 células (a) se transfectaron con el vector de expresión de HIF-1α (+) o con el vector vacío (-). células HIF-1a-transfectadas se trataron con ZnCl
2 (100 M). 24 h después del tratamiento, se recogieron las células en dividió en dos para ambos ARN y análisis de proteínas. RT-PCR se realizó para evaluar la COX-2 y los niveles de expresión de VEGF (panel superior). 28S se utilizó como control interno. extractos celulares totales se analizaron por inmunotransferencia (I.B.) para evaluar los niveles de proteína HIF-1α. L. C. (Control de carga). (B) células RKO-siHIPK2 fueron tratados con ZnCl
2 (100 mM) durante 24 h. Después de la transfección de ARN total fue extraído y RT-PCR se realizó para evaluar la COX-2 y la expresión de VEGF niveles. β-actina se utilizó como control interno. Se muestra un experimento representativo de tres experimentos independientes. (C) los extractos totales de células de RKOsiHIPK2 no tratada o tratada con ZnCl
2 (100 mM) durante 24 h se analizaron por inmunotransferencia Western para evaluar la COX-2 niveles de proteína. β-actina se utilizó como control de carga de proteínas.
Zinc regula a la baja la COX-2 niveles de expresión en células HIPK2 Empobrecido
Hemos demostrado anteriormente que los suplementos de iones de zinc en células de cáncer de próstata de forma constitutiva o hipóxicas en células de glioblastoma angiogénicos regula a la baja la expresión de HIF-1α, en consecuencia, inhibir la actividad de HIF-1 [8]. Este hallazgo fue motivada siguiente por un genoma en todo el análisis donde zinc en efecto contrarresta los perfiles de expresión génica inducida por la hipoxia activado por HIF-1 [34]. Aquí primera sobreexpresa HIF-1α en células 293 y se analizaron los niveles de mRNA por RT-PCR semicuantitativa antes y después del tratamiento con cinc. Como se muestra en la Fig. 3A, inducida por HIF-1 de la COX-2 y la expresión génica de VEGF se inhibió de manera eficiente por tratamiento con cinc. La sobreexpresión de HIF-1α y su regulación a la baja sobre los tratamientos de zinc, como se informó anteriormente [8], se muestran mediante inmunotransferencia (I.B.) (Fig. 3A, panel inferior). Entonces, el tratamiento de zinc de las células RKO-siHIPK2 mostró una reducción significativa tanto de la expresión del gen COX-2 y el ARNm de VEGF por análisis de RT-PCR (Fig. 3B). En consecuencia, inmunotransferencia confirmó la COX-2 regulación a la baja en las células HIPK2 agotados después del tratamiento de zinc (Fig. 3C). Es de destacar que en nuestras manos tratamiento zinc (100 m para 24 h) no afectó la viabilidad celular (datos no presentados). Debido a que la COX-2 es a menudo upregulated en tumores que llevan a la agresividad del tumor y mal pronóstico [14], la orientación de la COX-2 puede ser un logro importante en la terapia del cáncer. Por lo tanto, la COX-2 inhibidores selectivos han mostrado efectos antitumorales potentes en varios modelos animales diferentes de cáncer colorrectal; de acuerdo, la supresión de los COX-2 gen da lugar a una marcada disminución de la carga de adenoma tanto en intestino delgado y grueso en
Apc
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ratones mutantes y en
Apc
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ratones [35]. Sin embargo los inhibidores selectivos de COX-2 mostraron ser altamente eficaz en la prevención de la recurrencia de pólipos, los efectos secundarios cardiovasculares adversos asociados por estos fármacos pueden afectar a los ensayos clínicos aleatorios apropiados [36], [37]. Por lo tanto, es obligatorio para desarrollar nuevos enfoques para orientar la función de la COX-2. En este sentido, el uso de zinc en la regulación negativa inducida por HIF-1 la expresión COX-2 puede representar un interesante punto de partida para superar los efectos adversos de al menos algunos inhibidores específicos de la COX-2; Por otra parte, actuando sobre la actividad de HIF-1 de zinc puede afectar a varias vías de señalización interconectadas. Por último, si el zinc podría inhibir la COX-2 también independientemente de HIF-1 tiene que ser estudiada posteriormente.
(A) PGE
2 producción fue ensayada por ELISA en RKO-siRNA control de las células dejan sin tratar y en agotadas las células HIPK2 (siHIPK2) antes y después ZnCl
2 de tratamiento (100 M durante 24 h) y después del tratamiento con COX-2 inhibidor específico NS-398 (50 nM) durante 24 h. PGE
2 producción se representa como /10
6 células pg. Columnas, con una media de dos experimentos independientes realizados por duplicado, ± S.D.. * P & lt; 0,001. (B) los extractos totales de células de control de las células RKO-siRNA dejaron sin tratar y células HIPK2 empobrecido (siHIPK2) antes y después ZnCl
2 de tratamiento (100 M durante 24 h) se analizaron por inmunotransferencia Western para evaluar la COX-2, β- catenina, y ciclina D1 niveles de proteína. β-actina se utilizó como control de carga de proteínas. (C) La producción de VEGF se ensayó mediante ELISA en células de control RKO-siRNA y en células HIPK2 empobrecido (siHIPK2) antes y después ZnCl
2 de tratamiento (100 M durante 24 h). la producción de VEGF se representa como /10
6 células pg. Columnas, con una media de dos experimentos independientes realizados por duplicado, ± S.D.. * P & lt;. 0.001
zinc inhibe PGE
2 vías de señalización en las células HIPK2 empobrecido
Una vez establecido que el zinc puede regular a la baja los niveles de COX-2 en células HIPK2 agotado, nos a continuación trató de evaluar PGE
2 modulación. ensayo de ELISA mostró que la cantidad correspondiente de PGE
2 producido por HIPK2 empobrecido en comparación con las células de control, como se informó anteriormente [10], fue significativamente inhibido por la suplementación de zinc (Fig. 4A). Curiosamente, inducida por el zinc PGE
2 inhibición fue tan eficiente como la COX-2 inhibidor de NS-398 (Fig. 4A) específico. De acuerdo, inmunotransferencia Western mostró una fuerte reducción de la COX-2 niveles de proteína después del tratamiento de zinc (Fig. 4B), como se informó anteriormente. Por otra parte, los mayores niveles de β-catenina y de su ciclina objetivo D1 en las células HIPK2 agotado, como se informó anteriormente [3], [4], fueron marcadamente inhibida por el tratamiento de zinc (Fig. 4B), que paralela a la anterior PGE
2 inhibición. Esta es una interesante correlación, porque PGE
2 se ha demostrado que activan la β-catenina como factor de transcripción para inducir la expresión de varios genes, entre ellos COX-2 y ciclina D1, generando un bucle autorregulador positivo que favorece la progresión del tumor [12 ], [38].
(a) el microscopio óptico que muestra el control diferenciado de los países en desarrollo (Mock, el panel 1) y la inhibición de la morfología de las CD diferenciadas en presencia del CM de control de siRNA (panel 2) o células HIPK2 empobrecido ( siHIPK2) (panel 3); esta inhibición no tuvo lugar sólo si los países en desarrollo, donde se cultivan en presencia de CM del tratado con zinc siHIPK2-CM (panel 5) en comparación con las células control CM de siRNA tratados con zinc (panel 4). Se muestra un experimento representativo de tres experimentos independientes. microfotografía de aumento, 10 ×. (B) Análisis de marcadores de superficie maduración países en desarrollo, CD80 y CD86, usando citometría de flujo. DC Mock: controlar madura países en desarrollo; DC + siRNA-CM: maduración países en desarrollo, en presencia de CM de células de control siRNA; Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig.