Extracto
La incidencia del cáncer colorrectal (CCR) aumenta con la edad y inicio temprano indica una mayor probabilidad para la predisposición genética para esta enfermedad. La genética somática del desarrollo de tumores en relación con la edad del paciente sigue siendo en su mayoría desconocidos. Hemos examinado el estado de la mutación de cinco genes críticos conocidos de cáncer en relación con la edad al momento del diagnóstico, y se compara la complejidad genómica de los tumores de pacientes jóvenes sin síndromes CRC conocidos con los de pacientes de edad avanzada. Entre 181 pacientes con CRC, estratificados por estado de inestabilidad de microsatélites, se identificaron cambios en la secuencia de ADN en
KRAS gratis (32%),
BRAF gratis (16%),
PIK3CA gratis (4 %),
PTEN gratis (14%) y
TP53 gratis (51%). En pacientes menores de 50 años (n = 45),
PIK3CA mutaciones
No se han observado y
TP53
mutaciones fueron más frecuentes que en los grupos de mayor edad. El índice total mutación genética fue más bajo en los tumores de los pacientes más jóvenes. Por el contrario, la complejidad del genoma, evaluada como número de copias aberraciones, fue mayor en los tumores de los pacientes más jóvenes. Un número comparable de los tumores de los jóvenes (& lt; 50 años) de los pacientes y viejos (& gt; 70 años) era cuádruple negativo para los cuatro marcadores de predicción de genes (
KRAS-BRAF-PIK3CA-PTEN
); Sin embargo, el 16% de los jóvenes frente a sólo el 1% de los pacientes de edad tenían mutaciones tumorales en
PTEN /PIK3CA exclusivamente de
. Esto implica que las pruebas de mutación para la predicción de la respuesta al tratamiento de EGFR puede limitarse a
KRAS
y
BRAF Hoteles en ancianos (& gt; 70 años) de los pacientes. diferencias genéticas distintas que se encuentran en los tumores de pacientes jóvenes y ancianos, quienes son comparables para las variables clínicas y patológicas conocidas, indican que los pacientes jóvenes tienen un perfil de riesgo genético diferente para el desarrollo de CRC que los pacientes mayores
Visto:. M Berg, Danielsen SA, Ahlquist T, Merok MA, Agesen TH, Vatn MH, et al. (2010) Perfiles de ADN Secuencia del Cáncer Colorrectal crítico conjunto de genes
KRAS-BRAF-PIK3CA-PTEN-TP53
relacionados con la edad en el inicio de la enfermedad. PLoS ONE 5 (11): e13978. doi: 10.1371 /journal.pone.0013978
Editor: Kelvin Chan Kwong Yuen, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 21 de junio de 2010; Aceptado: 14 Octubre 2010; Publicado: 12 de noviembre 2010
Derechos de Autor © 2010 Berg et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por becas de la Sociedad de cáncer de Noruega (http://www.kreftforeningen.no/english) a RAL (Número de concesión 95068 /RAL, incluyendo becas de doctorado a SAD, MB y THA, y Post doc subvención a TA), y subvenciones de la noruega Fundación para la Salud y Rehabilitación (http://www.helseogrehab.no/) a través de la EXTRA los fondos (número de concesión HF-52015/002) a la ETE Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la incidencia del cáncer colorrectal (CCR, MIM#114500) ha aumentado en el mundo occidental incluyendo Noruega durante los últimos 50 años [1]. CRC se encuentra típicamente en las personas mayores con una edad media de inicio de síntomas de 70 años, y sólo alrededor del cinco por ciento de todos los casos se diagnostican en pacientes menores de 50 años de edad. síndromes hereditarios como la poliposis adenomatosa familiar (FAP, MIM#175100) y el síndrome de Lynch (HNPCC, MIM#120435) se encuentran en menos del cinco por ciento de todos los CRC [2]. A pesar de la aparición temprana de la enfermedad es generalmente aceptado ser indicativo de un potencial de riesgo genético, la mayoría jóvenes de los casos de aparición esporádica se consideran como hay predisposición genética conocida se encuentra [3]. Pocos estudios se han centrado en el desarrollo de tumores somática en pacientes jóvenes sin síndromes hereditarios conocidos [4] - [6]
receptor de la tirosina quinasa de señalización (RTK) es esencial para mantener el metabolismo, la proliferación, la supervivencia y la motilidad. de una célula [7]. Por lo tanto, los errores en los componentes regulados por receptores tirosina quinasas (RTK) se observan comúnmente en los cánceres humanos [8], [9]. Los oncogenes
KRAS gratis (HGNC: 6407),
BRAF gratis (HGNC: 1097), y
PIK3CA gratis (HGNC: 8975) y el gen supresor de tumores
PTEN gratis (HGNC: 9588). se ven afectados en respuesta a citoquinas, factores de crecimiento y hormonas de señalización a través RTK
Tanto
KRAS
y
BRAF
han demostrado tienen mutaciones activantes en ~ 70% de los CCR [10], lo que lleva a ERK autónoma de señalización [11], [12]. Las mutaciones en los componentes de la vía de la PI3-quinasa han sido reportados como mutado en ~ 40% en el CCR [13], y el análisis del paisaje genómico de tumores de CRC han mostrado la vía PI3K de verse afectados de una manera estadísticamente significativa [14]. En dos de estos componentes,
PTEN
y
PIK3CA
, las mutaciones producen la activación constitutiva de la vía PI3K por la acumulación de fosfatidilinositol (3,4,5) trifosfato (PIP
3) , que después cataliza la fosforilación de AKT. El AKT serina-treonina quinasa activada regula una amplia gama de proteínas diana que participan en una variedad de vías de señalización corriente abajo [15]. Entre akts objetivos de abajo es el gen supresor de tumores
TP53 gratis (HGNC: 11998), un factor de transcripción que integra información de muchos tipos diferentes de estrés celular, y ejecutar las respuestas apropiadas aguas abajo de la entrada dada [16].
TP53
se encontró mutado en aproximadamente la mitad de todos los carcinomas colorrectales [17]
estado de MSI en el tumor primario tiene impacto pronóstico en pacientes con CRC [18] -. [20].
KRAS
y
TP53
estado se ha asociado con puntos finales clínicos, el primero sólo con débil asociación en serie más grande y sólo este último si se consideran los subgrupos de mutaciones [21] - [23] . Recientemente, un estudio ha demostrado que
PIK3CA
mutaciones pueden llevar información pronóstica en los estadios tumorales I-III [24]. Este tipo de información no ha sido publicado por
PTEN
mutaciones.
El tratamiento de la enfermedad metastásica orientación EGFR se encuentra para ser eficaz sólo si
KRAS
y
BRAF
no mutado [25]. Sin embargo, incluso entre los pacientes con el tipo salvaje
KRAS
y
BRAF no
todos responden a esta terapia [26,26]. Últimamente, se ha propuesto que esto puede ser debido a mutaciones en
PIK3CA
y
PTEN
, tumores negativos de mutación es decir, sólo cuádruple responderán al tratamiento [26] - [29].
En el presente estudio hemos comparado el estado de mutación de la secuencia de ADN de los genes
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA, PTEN
, y
TP53 Hoteles en muestras tumorales de pacientes menores de 50 años al momento del diagnóstico y sin conocimiento de los síndromes hereditarios, y se estratificó según el estado de MSI y CRC pacientes de edad avanzada.
Resultados
Clinicopathological de datos para toda la serie (n = 181), divididos en tres grupos de edad, se presentan en la Tabla 1.
instability- de microsatélites y la mutación del gen estado
el MSI- y mutación frecuencias del analizadas genes se presentan en la Tabla 1, y un mapa de calor que representa los datos de mutación para todas las muestras se muestran en la Figura 1. en la serie total de, MSI se encontró en 18% de las muestras, que van desde 13% en el & lt; grupo de 50 años a 20% en el & gt; 70 grupo de edad. MSI se asoció significativamente con enfermedad localizada, el cuadro S1. Los genes fueron mutados dentro del rango esperado de frecuencias. las frecuencias de mutación para cada gen de manera independiente, y las frecuencias de las combinaciones de mutaciones en los genes de la prueba, se distribuyen por igual entre todas las etapas. Las diferencias se atribuyen a la edad de inicio se señalan a continuación.
La distribución de las mutaciones en el gen conjunto
KRAS-BRAF-PIK3CA-PTEN-TP53
, y el estado de MSI, dentro de cada grupo de edad. El código de colores: azul oscuro = MSI, la luz azul = MSS, rojo = mutación, verde = tipo salvaje, blanco = no detectado
En total, se observaron nueve mutaciones diferentes en
KRAS
, que afectan a los codones 12, 13 y 61. Veintiocho tumores tenían el
BRAF V600E
cambio. Ocho
PIK3CA
se identificaron mutaciones en los exones nueve y veinte. Catorce y quince tumores tenían
PTEN
mutaciones y deleciones, respectivamente. Noventa y tres tumores tenían
TP53
mutaciones. Los detalles de todas las mutaciones observadas, se pueden encontrar en la Tabla S2.
Comparación de los grupos de edad
Las relaciones entre los parámetros clínicos y de mutaciones dentro de cada grupo de edad se dan en la Tabla S1. Para todos los grupos de edad, los tumores MSI-eran más frecuentemente presente en la localización del tumor en el lado derecho. En el grupo de pacientes más antiguo MSI y
BRAF
mutaciones se correlacionaron estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,001). Esta correlación no se encontró en el & lt; grupo de los 50 años. Los tumores MSI dentro de la sección & lt; 50 grupo de edad, el grupo de edad de 51-70 y de & gt; 70 grupo de edad tenía un 17%, 54% y 79%
BRAF
mutaciones, respectivamente (
P
= 0,04). Por otra parte, entre los seis tumores MSI en el. & Lt; 50 grupo de sólo la mitad de las muestras realizadas mutaciones en los genes analizados, mientras que entre los tumores MSI en los otros dos grupos de edad, todas las muestras presentaban una o varias mutaciones
KRAS
se encontraron mutaciones en 57 tumores (32%) en la serie total. Las frecuencias de mutación fueron ligeramente diferentes entre los grupos de edad, Tabla 1. La mayoría de las mutaciones se encontraron en los codones 12 (68%) y 13 (28%) independiente del grupo de edad. El codón 61 mutaciones sólo se encontraron en las muestras de la & gt;.
Grupo de edad de 70 años
KRAS
y
BRAF
mutaciones eran mutuamente excluyentes en la serie total. La frecuencia de mutaciones tumorales, ya sea en
KRAS
o
BRAF
aumentó con la edad del paciente, tanto si se comparan grupos de edad y con la edad como una variable continua.
Sorprendentemente, ninguno de los tumores en la sección & lt; 50 grupo de edad tenía
PIK3CA
mutaciones, mientras que cinco (7%) y tres (4%) se encontraron en el grupo de 51-70 y & gt;. 70 grupo, respectivamente
Dieciocho
PTEN
se identificaron mutaciones en siete de nueve exones (no se observaron mutaciones en el exón 4 y 9). Las mutaciones se observaron en todos los grupos de edad, como fue el caso de
PTEN
supresiones. Las deleciones detectadas por MLPA se encontraron en el ocho por ciento de las muestras en total, y la coexistencia de deleción y alteraciones detectadas por secuenciación fueron encontrados en tres tumores. En general, el 14% de los tumores tenían indicación de deterioro
PTEN
función. La frecuencia de
PTEN
aberraciones no mostró diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de edad; 18%, 10% y 16% en & lt; 50 grupo, 51-70 grupo y & gt;. 70 grupo, respectivamente
El número de
TP53
ha mutado tumores fueron diferentes entre los tres grupos de edad (
P
= 0,02). Esta diferencia también fue significativa cuando se analizan sólo los tumores MSS, (
P = 0,03
). Las mutaciones fueron más prominentes en el dominio de unión de ADN, codificado por los exones 5-8, y sólo un cinco por ciento de las mutaciones se observaron en el exón 4 y el exón 11. Además, en la etiqueta & lt; 50 grupo de edad,
TP53
mutaciones y MSI eran mutuamente excluyentes, e inversamente correlacionados en el gt 51-70 y y;. 70 grupos, respectivamente
complejidad del genoma y la secuencia de mutaciones
Para un subconjunto de las muestras (n = 41) un conjunto de datos de alta resolución de los cambios de número de copias obtenidas por matriz comparativa de datos del genoma de hibridación (aCGH) estaba disponible (Roche NimbleGen, 385 000 oligo matriz de sondas) [30]. Como se publicó anteriormente [30], encontramos la etiqueta & lt; 50 grupo que tiene un número significativamente mayor de las aberraciones que el gt &; 70 grupo, a pesar de que la porción total del genoma con aberraciones fue similar en los dos grupos, la Tabla 2. Un diferencia en la complejidad también se encuentra en el nivel de genes, evaluada como índice de mutación: en el grupo de mayor edad de cada paciente tenía 1,5 mutaciones en promedio, en comparación con 1,0 en el grupo de edad más joven. La distribución de las fases del tumor era un poco sesgada entre los dos grupos. Sin embargo, ni el porcentaje de aberraciones genómicas, ni el número de mutaciones diferían entre las fases del tumor.
Asociaciones clínicas
No se encontraron diferencias en la supervivencia comparando los grupos de edad, incluso cuando se ajusta para el estadio del tumor al momento del diagnóstico. Hubo una tendencia de que la proporción de tumores rectales disminuyó con el aumento de la edad (
P
= 0,08), y los pacientes más jóvenes tendieron a tener una etapa de tumor más avanzado que los pacientes de edad avanzada. La prevalencia de los tumores en etapa III-IV fue del 54%, 46% y 36% en las etiquetas & lt; 50, 51-70 y & gt;. 70 grupos, respectivamente
En el conjunto total de la muestra, el estadio del tumor era la variable de pronóstico más potente con respecto a la supervivencia global de tres años, (
P Hotel & lt; 0,001). En el análisis univariado, los pacientes con tumores
TP53
ha mutados tenían peores tasas de supervivencia que los pacientes con tipo salvaje
TP53
, 938 ± 31 días frente a 1016 ± 23 días (
P
= 0,04), respectivamente. Sin embargo, esta diferencia no fue significativa cuando se corrige el estadio del tumor.
TP53
mutaciones eran de mayor significado pronóstico en los tumores derecho unilateral, 1051 ± 26 días frente a 883 ± 65 días para los de tipo salvaje y mutado
TP53
, respectivamente (
P
= 0,005).
Entre los pacientes en el grupo de edad más joven, aquellos con
KRAS
mutación tenían una supervivencia significativamente más corta que los pacientes con
KRAS
muestras de tipo salvaje, 841 ± 101 días frente a 1033 ± 35 días (
P
= 0,02), respectivamente. Ninguno de los otros parámetros de mutación mostró ninguna diferencia estadísticamente significativa en cuanto a supervivencia, ni dentro ni entre los grupos de edad.
Discusión
Hemos encontrado que el estado de la mutación de un conocido conjunto de genes del cáncer varía en CRC pacientes según la edad de aparición de la enfermedad, y proporcionar una prueba más de las diferencias en el desarrollo somático de los tumores en pacientes jóvenes y ancianos.
la inestabilidad de microsatélites estado
en todos los grupos de edad, fue MSI estadísticamente significativa asociada con tumores derecho unilateral, como se esperaba [18], [18], [31,32]. La frecuencia de MSI en la presente serie fue algo mayor que lo reportado en otras partes [33], [34], que se explica mejor por un exceso de azar de los tumores del lado derecho en la serie total. Sin embargo, para el grupo de pacientes menores de 50 años al momento del diagnóstico la frecuencia observada fueron ligeramente inferiores a lo esperado [33], lo que podría explicarse en parte por la exclusión de los pacientes con síndromes conocidos CRC en este estudio.
pacientes menores de 50 años sólo el 50% de las muestras de MSI se mutaron en uno o más de los genes analizados, mientras que en los pacientes mayores de 50 todas las muestras de MSI se muestran alteraciones genéticas. Además,
BRAF
mutaciones no fueron estadísticamente significativamente asociados con MSI en el & lt; grupo de 50 años, al contrario de lo que se esperaba [35]. La mutación en
BRAF
V600E se observó para inducir la baja regulación de los genes de reparación del ADN esenciales [36], con el potencial de inducir MSI en la célula, lo que explica esta correlación. Como
BRAF
mutaciones no se observan en los tumores de pacientes con síndrome de Lynch [37], no podemos excluir que MSI /
BRAF
muestras de tipo salvaje en la presente serie son de síndrome de Lynch sin ser detectado clínicamente pacientes.
Las mutaciones génicas
frecuencias de mutaciones en
KRAS, BRAF, PIK3CA, PTEN
, y
TP53
se consideraron dentro del rango informado anteriormente de soporte la representatividad de la serie [38].
la coexistencia de
BRAF
y
KRAS
mutaciones se presume que es incompatible con la proliferación, por tanto, una selección negativa por la existencia concurrente de ambas mutaciones [12]. Hicimos confirmar una correlación inversa entre las mutaciones de estos dos genes [39]. Además, un número creciente de tumores, ya sea con
KRAS o BRAF
mutación se observó con el aumento de la edad, de acuerdo con un informe reciente sobre pacientes jóvenes con cáncer colorrectal [6].
En el series totales, los tumores se presentan
BRAF
V600E típicamente fueron
TP53
tipo salvaje y
PTEN
mutado (Tabla S1), que también fue el caso de los tumores dentro de la & gt; 70 grupo de edad. Por lo tanto, "
BRAF
V600E,
TP53
en peso,
PTEN
mut" puede considerarse como una característica de auténticos tumores esporádicos.
en comparación con la frecuencia de 14% informó de
PIK3CA
mutaciones en los carcinomas colorrectales en la base de datos COSMIC [38], la serie actual muestra sólo el 4% mutaciones. Esto puede explicarse en parte por el hecho de que la serie actual se enriquece con muestras de pacientes jóvenes, y sus tumores no tenía
PIK3CA
mutaciones. Sin embargo, esta última observación es en contraste con dos estudios anteriores [6], [40] que los informes de dos /un pacientes menores de 50 años con
PIK3CA
mutaciones. Las diferentes metodologías utilizadas, el tipo de muestra, fijado en formol o tejido fresco congelado, y el tamaño de la serie pueden explicar en parte esta diferencia en la frecuencia de mutación entre los estudios. Mutación en el oncogén
PIK3CA
o el gen supresor de tumores
PTEN
puede dar lugar a una acumulación de PIP
3, y aguas abajo de activación de AKT. Sin embargo, ya que un cambio de secuencia en
PTEN
implica restante alelo de tipo salvaje, la mutación de activación adicional en la misma vía puede ser beneficioso para las células tumorales [41]. Encontramos 32 tumores con alteración (s) en cada uno de
PIK3CA
y /o
PTEN
, incluyendo siete tumores con varios
PTEN
aberraciones. La secuencia entera de codificación de
PTEN
ha sido explorado [42] - [48], pero ninguno de los estudios han investigado los tumores de pacientes jóvenes específicamente. A nuestro entender este es combinar el primer informe
enteros PTEN
datos de la secuencia de codificación con el patrón de eliminación bruta en el CCR de diferentes grupos de edad.
El
TP53
frecuencia de mutación fue significativamente mayor en la sección & lt; 50 grupo de edad, que en los otros grupos de edad, los cuales se explican mejor por la mayor frecuencia de los cánceres rectales lados y que quedan en el & lt; grupo de los 50 años. Como era de esperar,
TP53
mutaciones se asocian con tumores del SMS, y la diferencia significativa entre los grupos de edad seguía siendo válido desde el análisis SMS tumores.
Un índice de mutación se calcula y tumores de pacientes de edad avanzada se encontró que se han acumulado más cambios en la secuencia de genes que los de los pacientes jóvenes (1.5 vs. 1.0) que podrían indicar una diferencia de tiempo en el desarrollo de tumores.
distinto composición genética de los tumores de pacientes jóvenes y ancianos
a partir de los datos aCGH en un subgrupo de 41 muestras, se observó que los pacientes menores de 50 años tenían significativamente más aberraciones en sus tumores que los pacientes & gt; 70 años hicieron,
es decir
. un mayor grado de complejidad genómica. Contrariamente, como se mencionó anteriormente, los tumores de pacientes de edad avanzada tenían el mayor índice de mutación genética, a pesar de que este grupo incluye un menor número de etapas avanzadas. Tomados en conjunto, uno puede especular que entre los pacientes jóvenes no son portadores con predisposición genética que afecta a los genes que codifican proteínas que aseguran la correcta segregación de los cromosomas durante la mitosis, en lugar de las vías específicas.
Bardelli
et al.
[29] informó de que los pacientes con enfermedad metastásica que son "cuádruple negativo" en el
KRAS-BRAF-PIK3CA-PTEN
conjunto de genes tienen la mayor probabilidad de respuesta a las terapias anti-EGFR. Sin embargo, en la actualidad sólo
KRAS
prueba se recomienda antes de la decisión con respecto a dicho tratamiento, y
BRAF
prueba es opcional [49].
En la presente serie de primaria cánceres, las frecuencias de mutación en estos cuatro genes se distribuyen por igual entre todos los estadios tumorales. Por lo tanto, tenemos en la siguiente hipótesis de que el número de respondedores potenciales con base en el conjunto de datos (Figura 2). Al considerar los tumores con alteración de
PTEN
y /o mutado
PIK3CA
exclusivamente, el grupo de edad más joven indicado 16% (n = 7) mutaciones, en comparación con el 1,4% (n = 1) en el más antiguo grupo de edad. Esto implica que para los pacientes de edad avanzada,
KRAS
y
BRAF
estado de la mutación por sí sola revelará el 98% de los pacientes no aptos para la terapia anti-EGFR, en comparación con 71% en los pacientes & lt; 50 años . El efecto de las mutaciones en
PIK3CA
y
PTEN ¿Cuáles son objeto de debate con respecto a la terapia anti-EGFR [26], [28], [29]. No obstante, si su estado mutacional no influye en el efecto del tratamiento con anti-EGFR, se espera que los pacientes más jóvenes a tener una proporción aún mayor de respondedores potenciales para este tipo de tratamiento de los pacientes de mayor edad (Figura 2).
distribución porcentual-racional de las aberraciones de
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA
y
PTEN
y sus combinaciones, en la sección & lt; 50 grupo de edad y & gt; 70 grupo de edad. Los pacientes negativos para todas las mutaciones negativas (cuádruple) son posibles en responder a los anti-EGFR-terapia. (Modificado de Bardelli
et al.
[
29
]) guía empresas
Asociación de datos clínicos
La serie muestra consecutiva de los carcinomas colorrectales de un solo hospital mostró la distribución general de los datos clínico-patológicos como se esperaba para una cohorte de Noruega [1]. La proporción de los cánceres rectales disminuyó con el aumento de la edad de inicio, mientras que la tendencia opuesta se observó para los tumores derecho unilateral, según lo informado por otros [50], [51]. Por otra parte, una mayor parte de los pacientes diagnosticados antes de los 50 años tenía la enfermedad en estadio más avanzado en comparación con los grupos de mayor edad. Esto puede reflejar que el CRC es inesperado en los adultos jóvenes y los síntomas se descuidan tanto por el paciente y el médico [52]. Informes de jóvenes pacientes con cáncer colorrectal se diferencia con respecto a la agresividad de la enfermedad, y por lo tanto los resultados [3], [52], [53]. Sin embargo, en el presente estudio, la supervivencia global de tres años fue igual en los tres grupos de edad, incluso cuando se ajusta por el estadio del tumor. Esto podría indicar una enfermedad más agresiva en pacientes jóvenes, ya que se espera que las personas mayores que tienen una tasa de mortalidad más alta. Además, el observado mayor grado de complejidad genómica en los tumores de pacientes de edad avanzada frente a joven también puede ser indicativo de una diferencia en la agresividad. Cabe señalar, que los jóvenes pacientes incluidos no son conocidos portadores de síndromes de cáncer colorrectal de acuerdo con criterios clínicos solamente.
El valor pronóstico y predictivo de
TP53
sigue siendo controvertida [54]. En nuestros pacientes conjunto de datos con
TP53
mutaciones tenían una supervivencia significativamente más corta que los pacientes de tipo salvaje. Por otra parte, para los pacientes con tumores del lado derecho o MSI
TP53
mutaciones mostró aún mayor valor pronóstico, en línea con los resultados reportados por el
TP53
-CRc colaborativa grupo de estudio [55].
en un estudio reciente,
No se encontraron mutaciones PIK3CA
para servir como marcadores sustitutos de la mala supervivencia en pacientes con cáncer de colon [24]. Como pocas
No se observaron mutaciones PIK3CA
en nuestro conjunto de la muestra, no hemos podido confirmar estos resultados. Sin embargo, no se encontraron mutaciones sólo en muestras de pacientes de mayor edad, y no estaban presentes en los pacientes con metástasis a distancia, y sólo unos pocos en pacientes en estadio III. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que
PIK3CA
mutaciones son importantes para la tumorigénesis en pacientes de edad avanzada, pero no sirven como un marcador para la capacidad de metástasis.
Conclusión
Tenemos encontrado claras diferencias en la composición genética de los carcinomas de pacientes jóvenes y ancianos. Los tumores de pacientes jóvenes que no son portadores de síndromes conocidos CRC hereditarias tienen menos mutaciones de genes, pero más número de copias aberraciones de todo el genoma. Estos datos sugieren que algunos pacientes jóvenes pueden tener un mayor riesgo potencial de cáncer causado por alteraciones en el gen (s) que participan en el mantenimiento de la segregación cromosómica correcta.
Materiales y Métodos
Ética declaración
escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los sujetos incluidos. Los bancos de datos genéticos de investigación se registran de acuerdo con la legislación nacional y los estudios de investigación han sido aprobados por el Comité Regional de Ética de Investigación Médica (REK Sudeste: 1.2005.1629; REK del Sur, 2003: S-02126)
Los pacientes. y muestras de tumores
un total de 181 pacientes fueron incluidos en el estudio,
es decir
una serie consecutiva de 132 pacientes enriquecido con una serie de 49 pacientes con la enfermedad en la edad joven (& lt; 50 años ). Cada serie se describen en los párrafos siguientes. Se recogieron de forma prospectiva los datos clínicos. Los datos de defunciones fueron recuperados de cualquiera de los registros de los hospitales o desde el registro de la población noruega. Los datos clínicos y patológicos de estas dos series se muestran en la Tabla S3.
serie consecutiva (n = 132).
Los pacientes sometidos a resección electiva del adenocarcinoma colorrectal en 2005-2007 en el Hospital Universitario de Oslo , Aker, Oslo, fueron incluidos. Los pacientes con FAP-o síndrome de Lynch se excluyeron sobre la base de criterios clínicos. El tejido tumoral se tomaron muestras inmediatamente después de la resección de la muestra y al instante congelado en nitrógeno líquido. Todas las muestras de tejido fueron evaluados por un patólogo para establecer el grado de diferenciación del contenido celular de carcinoma y tumor.
serie de aparición temprana (n = 49).
Las muestras de un biobanco de un multihospitalario estudio (INFAC-estudio - los individuos con riesgo familiar de cáncer), incluyendo el hospital de la Universidad de Oslo, Aker, Oslo y otros cinco hospitales de la misma región geográfica de Noruega inscrito 2003-2008, se incluyeron en el presente estudio. Los criterios de inclusión en el estudio fueron INFAC-edad & lt; 55 años, con exclusión de los que cumplieron los criterios de todos los síndromes conocidos CRC. El tejido tumoral y correspondientes muestras de mucosa normales se tomaron de la pieza resecada en la sala de operaciones y se incubaron con prontitud en RNAlater. El tejido se transfirió a tubos nuevos después de 36-72 horas, y se almacena a menos 80 ° C hasta su uso. Se extrajo el ADN de tejidos normales y cancerosos, y se utiliza para el análisis.
muestras incluidas en el análisis de CGH.
Para un subconjunto de los pacientes (n = 41) los datos de los análisis se aCGH disponible. Este subconjunto incluyó 24 pacientes menores de 50 años y 17 mayores de 70 años al momento del diagnóstico primario. Los datos clínicos y de mutaciones en estos pacientes se presentan en la Tabla S2.
Agrupación de los pacientes según la edad.
Los pacientes de la serie de inicio temprano se incluyeron para enriquecer el número de pacientes de inicio precoz en el conjunto total de la muestra. Los pacientes fueron seleccionados de la serie de inicio temprano para que coincida con los pacientes menores de 55 años en la serie consecutiva con respecto al género, edad mediana, el estadio del tumor y la localización, el cuadro S3. A partir de entonces, las muestras de las dos series se combinaron y se dividieron en tres grupos de edad; cuales son menores de 50 años, 51 a 70 años y de más de 70 años, conocido como & lt; 50, 51-70 y & gt; 70, respectivamente. La edad media al diagnóstico primario fue de 70 años en la serie consecutiva, y que fue elegido como punto de corte para el grupo de mayor edad. El corte para el grupo de edad más joven se fijó en 50 años, desde la aparición temprana puede deberse a factores genéticos heredados, y sólo ~ 5% de todos los CRC son diagnosticados antes de los 50 años de edad. Los tumores en el colon proximal al ángulo esplénico se definieron como del lado derecho: los que están en los dos puntos restantes fueron considerados como del lado izquierdo, mientras que el recto se definió como 15 cm del margen anal cuando se mide con un proctoscopio rígido. La enfermedad localizada fue definida por la UICC etapas AJCC /I y II y enfermedad regional para las etapas III y IV.
inestabilidad de microsatélites análisis
Para todos los pacientes, se analizó el tumor y el tejido normal o de sangre correspondiente utilizando los marcadores de Bethesda [56]. El análisis se realizó según lo descrito por Wu
et al.
[57]. Alto grado de inestabilidad de microsatélites (MSI-H) en el ADN del tumor, en comparación con el ADN normal correspondiente, se definió si dos o más marcadores mostraron perfil pico aberrante después de análisis de los fragmentos. Si tanto la muestra normal y la muestra de tumor de un paciente mostraron el mismo patrón para todos los marcadores, el tumor fue considerado microsatélites estables (MSS). Análisis
mutación KRAS para, BRAF, PIK3CA, PTEN y TP53
en
BRAF
y
KRAS
, la activación de mutaciones en las posiciones conocidas para llevar con frecuencia alteraciones son reportados [11], [58]. En el
PIK3CA
mutaciones genéticas en el cáncer colorrectal se agrupan en los exones 9 y 20 [59], y por
TP53
y
PTEN
mutaciones son reportados a lo largo de toda la secuencia de codificación [ ,,,0],17], [60].
en
TP53
y
PTEN
, la secuencia total de codificación se amplificó en las reacciones de PCR múltiple, utilizando el multiplex PCR kit según lo recomendado por el vendedor (QIAGEN, GmbH, Hilden, Alemania) [30], [60]. singleplex reacciones de PCR usando Taq HotStar (QIAGEN) se utilizaron para ampliar
PIK3CA
,
KRAS Opiniones y
BRAF
amplicones [10], [59], [61]. En
se amplificaron PIK3CA
exones 9 y 20, en
KRAS
, los exones 2 y 3, incluyendo los codones mutados frecuencia 12, 13 y 61, y en
BRAF
exón 15, que incluye la mutación en el codón 600, se amplificaron. Cebadores, condiciones y detalles de fragmentos de ejecución se describen en la Tabla S4.
Los productos de PCR se purificaron usando columnas Sephadex (Millipore, Billerica, MA, Estados Unidos y GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Reino Unido) antes de la incorporación del colorante marcado ddNTP de y la secuencia en el 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) [30]. En los casos en que se detectó una mutación, un nuevo producto de PCR independientes se sometió a secuenciación para confirmar el resultado.
Multiplex ligadura dependientes de la sonda de amplificación (MLPA) de PTEN
kit
Salsa MLPA P225- B2 PTEN (MRC Holanda, Amsterdam, Países Bajos) se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del distribuidor. En total, 25 sondas cubren la
PTEN
gen, un mínimo de dos sondas para cada uno de los nueve exones. Además, 10 sondas situadas en otra parte en el cromosoma 10, y las sondas de referencia adicionales 12 situados en otros cromosomas sirve como controles. Los fragmentos amplificados se analizaron en un analizador de ADN 3730 (Applied Biosystems). Los datos en bruto se analizaron con Coffalyzer® (MRC Holanda) con la configuración predeterminada. Los puntos de corte de 1,2 y 0,8 se utilizaron para la puntuación de las ganancias y pérdidas, respectivamente, además de la evaluación individual de la trama de cada muestra. Esta puntuación se determina de acuerdo con el siguiente cálculo: ganancia de una copia o pérdida de 60% de las células en un tumor triploide es igual a 1,2 y 0,8, respectivamente. Al menos dos sondas vecinos, situados en el mismo exón, con ganancia o pérdida concomitante, fueron confinados para la asignación de número de copia aberrante en una región.
Los análisis estadísticos
Las variables clínicas fueron probados para las asociaciones con resultados de mutaciones para todos los genes analizados, y todos los genes fueron probados para las asociaciones inter-relacionales. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el paquete de software SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Se utilizó la prueba exacta de Fisher para las variables de tabulación cruzada.