Extracto
La hipoxia es un cambio ambiental importante en muchos tipos de cáncer. nichos hipóxicas pueden ser ocupadas por las células madre de cáncer /progenitoras-como que están asociados con la progresión del tumor y resistencia a la radioterapia y la quimioterapia. Sin embargo, aún no se ha aclarado completamente cómo hipoxia influye en las propiedades madre, de células de cáncer de próstata. En este informe, hemos investigado los efectos de la hipoxia en las líneas celulares de cáncer de próstata humano, PC-3 y DU145. En comparación con la normoxia (20% O
2), 7% de O
2 inducidos expresiones más altas de HIF-1α y HIF-2α, que se asocia con la regulación positiva de Oct3 /4 y Nanog; 1% de O
2 indujo mayores niveles de estos factores. El Upregulated
NANOG
la expresión del ARNm de la hipoxia se confirmó que era predominantemente retrogene
NANOGP8
. Se observaron tasas de crecimiento similares para las células cultivadas en condiciones hipóxicas y de normoxia durante 48 horas; sin embargo, el ensayo de formación de colonias reveló que 48 horas de pretratamiento hipóxico dieron como resultado la formación de más colonias. El tratamiento con 1% de O
2 también extendió el G
0 /G
1 etapa, lo que resulta en más células lado la población, e inducidos expresiones CD44 y ABCG2. La hipoxia también aumentó el número de células positivas para la expresión ABCG2, que fueron encontrados para ser predominantemente CD44
brillante células. En consecuencia, la CD44 ordenados
brillante células expresaron niveles más altos de ABCG2, Oct3 /4 y Nanog de CD44
células oscuras, y el pretratamiento hipóxico aumentaron significativamente la expresión de estos factores. CD44
brillante células bajo normoxia formada significativamente más colonias y esferas en comparación con el CD44
células tenues, y pretratamiento hipóxico incluso aumentaron este efecto. Nuestros datos indican que las células de cáncer de próstata en condiciones de hipoxia poseen mayores propiedades madre-como
Visto: Ma. Y, Liang D, Liu J, K Axcrona, Kvalheim G, Stokke T, et al. (2011) líneas celulares de cáncer de próstata en condiciones de hipoxia presentan una mayor Propiedades Stem-similares. PLoS ONE 6 (12): e29170. doi: 10.1371 /journal.pone.0029170
Editor: G. Dean Tang, la Universidad de Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: August 1, 2011; Aceptado 22 de noviembre de 2011; Publicado: December 28, 2011
Derechos de Autor © 2011 Ma et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Investigación del hospital Radium de Noruega con el número de concesión de 333.005 ZS. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
somáticas tumores, incluyendo el cáncer de próstata, contienen un pequeño subconjunto de células madre similares, llamadas células madre cancerosas, con capacidades de auto-renovación, la diferenciación y la iniciación de nuevos tumores. Se ha demostrado que las células madre de cáncer pueden escapar de la radioterapia y la quimioterapia, y son capaces de formar tumores metastásicos en otros órganos [1], [2]. cáncer de células madre residen preferentemente en microambiente hipóxico-nichos específicos, a menudo existente dentro de los tumores [3], [4]
Los factores inducibles por hipoxia (HIF) son reguladores clave que se encuentran en células de mamífero bajo la tensión de oxígeno baja.; que están involucrados con múltiples funciones, tales como la supervivencia celular, la angiogénesis, y se derivan de mantenimiento celular, y desempeñan papeles esenciales en la homeostasis celular y sistémica en respuesta a la hipoxia [5]. HIF son heterodímeros;
HIF1A gratis (HIF-1α) y
EPAS1 gratis (HIF-2α) son las dos principales isoformas de la subunidad α-y comparten un alto grado de homología de secuencia. Oct3 /4 (también llamado POU5F1) y Nanog son marcadores de células madre embrionarias que son importantes para la transcripción y en el mantenimiento de la auto-renovación de células madre embrionarias y células germinales primordiales. También se han identificado en diferentes tumores somáticas, incluyendo cabeza y cuello, pulmón, colorrectal, de ovario, y cánceres de la próstata [6] - [11]. Comparativamente, las expresiones de estos genes están regulados en todos los tipos de células somáticas diferenciadas,
in vitro
, así como
in vivo
[12], [13].
NANOG
, también llamado
NANOG1
, tiene varios pseudogenes, y entre ellos
NANOGP8
tarde se ha confirmado que se trata de un retrogene. Tanto
NANOG1
y
NANOGP8
expresiones han sido identificados en diferentes tipos de células del cáncer [14], [15], incluyendo las células de cáncer de próstata [16].
Varios marcadores de superficie se han utilizado para aislar las células madre /progenitoras cáncer putativos. En el cáncer de próstata, las células progenitoras tempranas están asociadas con varios marcadores de superficie específicos, tales como CD44, CD133, y CXCR4 [17] - [19]. tecnología población Side también se ha utilizado para aislar células madre de cáncer con la capacidad de bombear Hoechst 33342 [20]. Flujo de salida del colorante se atribuye a los miembros de la familia de casete de unión a ATP, tales como (proteína de resistencia al cáncer de mama, BCRP) ABCG2. La regulación al alza de ABCG2 también es responsable de la resistencia quimioterapéutico en ciertas células del cáncer [21]. En los cánceres de mama y próstata, estudios previos han identificado CD44
+ o CD117
+ /ABCG2
+ células con características madre-como, como el aumento de las propiedades clonogénico /tumorigénicas, mayores expresiones de genes stemness, y más fuerte capacidad para formar tumores en modelos animales [19], [22], [23].
La hipoxia ayuda a las células madre embrionarias para mantener la troncalidad y las tensiones de oxígeno más altas conducen a las células en proliferación y diferenciación, que son más susceptibles a la convencional modalidades de tratamiento [24], [25]. Resultados similares se han observado en las células adultas, como adipocitos, fibroblastos, y varios tipos de células del cáncer [26] - [28]. Sin embargo, los efectos de la hipoxia en las células de cáncer de próstata no han sido completamente aclarada. Por lo tanto, en este estudio hemos examinado la líneas celulares de cáncer de próstata PC-3 y DU145 a diferentes tensiones de oxígeno con el fin de comprender mejor el efecto de la hipoxia sobre las propiedades madre-como de las células. factores stemness, Oct3 /4 y Nanog, se expresaron en niveles más altos en las células en cultivo hipóxico y estas células exhiben potenciales de formación de colonias elevada en comparación con las células bajo condiciones de normoxia. Por otra parte, la upregulated
NANOG
la expresión de ARNm en condiciones de hipoxia fue confirmada deriva principalmente de la retrogene
NANOGP8
. En estas líneas celulares de cáncer de próstata, la hipoxia también aumentó la fracción de células de población lateral, extendió el G
0 /G
1 etapa y dio lugar a mayores niveles de expresiones ABCG2 y CD44. Experimentos adicionales demostraron que CD44
brillante células mostraron significativamente mayor troncalidad, según lo verificado por el ensayo de formación de colonias, ensayo de crecimiento esfera, y la expresión del factor stemness análisis.
Materiales y Métodos
Cultivo celular
líneas celulares de cáncer de próstata humano, PC-3 y DU145, fueron adquiridos de ATCC (American Type Culture Collection, EE.UU.) y se mantuvieron en nuestro laboratorio para este estudio. Para el cultivo celular convencional, las células se sembraron en frascos de cultivo con medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina. Los cultivos se mantuvieron a 37 ° C en un incubador humidificado en una atmósfera de 20% de O
2, 5% de CO
2, y el 75% de N
2.
El XVIVO cerrado Incubación sistema (sistema XVIVO 300 C, BioSpherix, Nueva York, EE.UU.) se utilizó en este estudio con el fin de mantener con precisión diferentes tensiones de oxígeno en diferentes cámaras. Después de 24 horas de cultivo en cultivo celular convencional (que permite las células se unan a los frascos), las células se transfirieron a diferentes cámaras con 1% O
2, 5% de CO
2, y 94% N
2; 7% de O
2, 5% de CO
2, y 88% de N
2; o el 20% de O
2, 5% de CO
2 y 75% N
2 por períodos variables de tiempo antes de ser cosechadas para el análisis adicional.
Semicuantitativo PCR con transcripción inversa (RT PCR)
el ARN total se extrajo de las células cultivadas utilizando el kit RNeasy (Qiagen, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Para eliminar cualquier ADN, DNasa I se utilizó en el procedimiento de aislamiento de ARN. concentraciones de la muestra de ARN se cuantificaron utilizando un espectrofotómetro (Nanodrop ND-1000, EE.UU.) a OD260 /280.
ADN complementario (ADNc) se sintetizó posteriormente de 5 mg de ARN total utilizando el Multiscribe transcriptasa inversa (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las condiciones para la transcripción inversa fueron: 25 ° C durante 10 minutos, 37 ° C durante 12 minutos, 85 ° C durante 5 minutos, seguido por mantenimiento a 4 ° C. cDNA se almacenó a -70 ° C para su posterior análisis de PCR
amplificación por PCR de ADNc se realizó usando un sistema de PCR (DOPPIO VWR, Reino Unido) y el siguiente programa:. desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 minutos; seguido de 30 ciclos (28 ciclos para GAPDH) de recocido a 60 ° C durante 30 segundos, y extensión a 72 ° C durante 30 segundos; seguido de la terminación con una etapa de elongación de 10 minutos a 72 ° C. Los cebadores utilizados para RT-PCR fueron: para Nanog, F 5'-ATGCCTCACACGGAGACTGT-3 'y 5'-R AGGGCTGTCCTGAATAAGCA-3', la amplificación de un fragmento de 66 pb; para Oct3 /4, F-5 'ACATGTGTAAGCTGCGGCC-3' y 5'-R GTTGTGCATAGTCGCTGCTTG-3 ', la amplificación de un fragmento de 297 pb; para HIF-1α, F 5'-AGTGTACCCTAACTAGCCGAGGAA-3 'y 5'-R CTGAGGTTGGTTACTGTTGGTATCA-3', la amplificación de un fragmento de 113 pb; para HIF-2α, F 5'-GACCAGCAGATGGACAACTTGTAC-3 'y 5'-R CAGAAAGATCATGTCGCCATCTT-3', la amplificación de un fragmento de 84 pb; y para GAPDH, F 5'-CCTCAAGATCATCAGCAATGC-3 'y 5'-R TGGTCATGAGTCCTTCCACG-3', la amplificación de un producto de 101 pb. Los experimentos se repitieron al menos tres veces
Los productos de PCR amplificados se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 7,5%, se tiñeron con GelRed (Molecular Probes, Invitrogen), y se visualizaron con un sistema de imagen Syngene (G:. CAJA Syngene , EE.UU.).
Las expresiones de ARNm de
NANOG1
y
NANOGP8
se mide por PCR cuantitativa usando un sistema de detección de secuencias ABI TaqMan 7900 (Applied Biosystems). Los cebadores específicos y las sondas publicados [29] se utilizaron en este estudio. Para
NANOG1
: cebador directo fue 5'-CGCCCTGCCTAGAAAAGACATTT -3 ', cebador inverso fue 5'-AGAAGCCGTCTCTGGCTATAGATAA -3', y la sonda fue CTGCTAAGGACAACATTGAT;
NANOGP8
: cebador directo fue 5'-CGCCCTGCCTAGAAAAGACATTT-3 ', cebador inverso era 5'-ACGAGTTTGGATATCTTTAGGGTTTAGAATC-3', y la sonda fue CCTTGGCTGCCGTCTCTG. Todos los cebadores y las sondas marcadas con FAM-MGB se obtuvieron de Applied Biosystems. El GAPDH se utilizó como los valores de Ct en el 20% de O
2 de control interno y se utilizaron como calibradores para evaluar
NANOG1 Opiniones y
NANOGP8
niveles de expresión en respuesta a la hipoxia. Los experimentos se realizaron por duplicado. Los niveles de expresión de la
NANOG1
y
NANOGP8
fueron analizados a través del método ΔΔCt [29].
inmunotransferencia
Las células se lavan rápidamente con hielo solución salina fría tamponada con fosfato (PBS) y se rasparon en tampón RIPA (25 mM Tris HCl pH 7,6, NaCl 100 mM, 1% de NP40, 1% desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS; Thermo Scientific Pierce, Alemania), con inhibidores de la proteasa (0,1 M aprotinina, PMSF 1,0 mM, leupeptina 1 mM, pepstatina 1 mM) que se añade inmediatamente antes de su uso. Las muestras se centrifugaron a 15.000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C y los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos. Las concentraciones de proteína se midieron con un ensayo de proteínas Bio-Rad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se calentaron con un calentador de sobremesa (modelo 111002, Boekel Scientific, EE.UU.) a 100 ° C durante 5 minutos en tampón SDS de carga (500 mM Tris-HCl pH 6,8; 10% de glicerol, 2% SDS, 0,6 M DTT, 0,05% de azul de bromofenol), y luego una cantidad igual de proteína (50 mg) por cada muestra se sometió a 10% SDS-PAGE y se transfirieron a membrana de transferencia de difluoruro de polivinilideno (BIO-RAD, EE.UU.). Las membranas se bloquearon con leche en polvo no grasa 5% en TBS-Tween durante 60 minutos a temperatura ambiente y después se incubaron con los anticuerpos primarios en dilución óptima en TBST /5% de leche durante la noche a 4 ° C. Los anticuerpos optimizados utilizados en este estudio fueron: HIF-1α (1 mg /ml MAB1536, R & amp; D), HIF-2α (1 g /ml MAB2886, I + amp; D) de amplificador, GAPDH (0,2 g /ml AF5718, R &; D ), Oct3 /4 (1 mg /ml MAB1759, R & amp; D), Nanog (1 mg /ml AF1997, R & amp; D), y ABCG2 (0,5 mg /ml B7059, Sigma-Aldrich). Las membranas fueron incubadas con anticuerpos y inmunocomplejos secundarios conjugados con HRP se visualizaron por quimioluminiscencia potenciada (GE Healthcare, Reino Unido). Western Blot experimentos se repitieron al menos tres veces.
bloque celular
Las células fueron cultivadas a 80% de confluencia y después se digirieron con tripsina al 0,25% y EDTA (Invitrogen, EE.UU.), cosechado, y se centrifugó a 2000 rpm durante 10 minutos. Los sobrenadantes se desecharon, se añadieron 3 gotas de plasma y 2 gotas de trombina a la sedimentación, y los contenidos se mezclaron cuidadosamente por rotación del tubo. Un minuto después, la mezcla se coaguló y se añadió 4% de formalina tamponada al tubo para la fijación. a continuación, se colocó la masa coagulada en el papel de lino y se utiliza para construir un bloque de parafina mediante el procedimiento convencional.
inmunocitoquímica
bloques de celdas se cortaron en secciones de parafina de 4 micras, que luego se desparafinaron utilizando PT -Link aparato. A continuación, las secciones se aclararon con tampón DAKO de lavado, se incubó con peróxido de hidrógeno durante 5 minutos, y después se incubaron con el anticuerpo primario durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos utilizados y su concentración fueron: HIF-1α (ratón, 1:200; número de catálogo: NB100-150, Novus), HIF-2α (conejo, 1:100; número de catálogo: NB100-122, Novus), Oct3 /4, (cabra, 10 mg /ml; número de catálogo: AF1759, R & amp; D) y Nanog (cabra, 5 mg /ml; número de catálogo: AF1997, R & amp; D)
Después de otro enjuague con Dako. tampón de lavado, se añadió ratón /conejo reactivo EnVision FLEX + Enlazador y las muestras se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido de incubación con EnVision + FLEX HRP durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las muestras con anticuerpos primarios de cabra se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con IgG de ratón anti-cabra antes de la adición de ratón reactivo EnVision FLEX + Enlazador y EnVision + FLEX HRP como se describe anteriormente. Se enjuagaron las secciones, reacción de color se desarrolló con el reactivo DAB, contratinción en hematoxilina durante 20 segundos, deshidratado, y se montaron bajo cubierta de vidrio se desliza en preparación para la evaluación por microscopía.
conteo celular (tasa de proliferación celular)
la proliferación celular se evaluó contando el número de células utilizando el teléfono Contador Electrónica condesa Automatizado (Invitrogen, EE.UU.). Después de tripsinización, se recogieron las células flotantes para crear una suspensión de células que no contenían grupos de células obvias. En cada preparación, 10 l de suspensión de células se mezclaron con 0,4% de tripano colorante azul (01:01) antes de ser cargados en un portaobjetos de cámara de recuento de células para el recuento celular. El número de células viables que fueron capaces de excluir el colorante se contó para cada condición experimental. Para cada muestra, el número de células se contó por lo menos tres veces.
Colonia ensayo de formación de
El uso de placas de seis pocillos, 500 células por pocillo se mantuvieron en tensiones de oxígeno de 1%, 7% y 20% durante 48 horas. Todas las placas se colocaron a continuación en una incubadora con 20% O
2 para 2 semanas para la observación de la formación de colonias. Las colonias se fijaron con 4% de formalina tamponada durante 15 minutos, y luego se tiñeron con 1% de cristal violeta durante 30 minutos. Las placas se lavaron suavemente con PBS y se secaron antes de la evaluación microscópica de colonias. se contaron las colonias que contenían más de 30 células. la eficiencia de formación de colonias se calculó como sigue: la eficiencia de formación de colonias = colonias células /entrada × 100%. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
análisis del ciclo celular
Después de la incubación con diferentes tensiones de oxígeno, incluyendo 1% o el 20% de O
2, las células PC-3 y DU 145 eran cosechado y se fijaron con metanol a -20 ° C durante la noche. Estas células se usaron para preparar una suspensión de células al que se añadió 1,5 g /ml de Hoechst 33258 antes se mantuvieron las células en hielo durante 30 minutos. Después de eso, las muestras se analizaron con un citómetro de flujo LSRII (Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.).
Población lateral ensayo
Las células cultivadas a 80% de confluencia (aproximadamente 1 × 10
6 células) se cosecharon y se suspendieron en RPMI que contenía suero precalentado 1640 2% fetal bovino y tampón HEPES 2 mM. Hoechst (solución madre de 1 mg /ml; Sigma) 33342 tinte se añadió a una concentración final de 5 g /ml, y la mezcla se incubó con intermitente agitación durante 90 minutos a 37 ° C, en presencia o ausencia de verapamilo (50 M; Sigma). Entonces, las células se lavaron con HBSS enfriado con hielo con 2% de FBS, se centrifugó a 4 ° C, y se resuspendieron en HBSS enfriado con hielo que contiene 2% de FBS. El yoduro de propidio se añadió a las células en suspensión a una concentración final de 2 mg /ml, con el fin de revelar células viables. Antes del análisis, las células se filtraron a través de un filtro de células de 70 micras para obtener una suspensión de células individuales. Los agregados de células se descartaron del análisis por la discriminación doblete y se analizaron las células individuales en un LSRII citómetro de flujo (BD Biosciences). Hoechst 33342 fue excitada a 350 nm y las células lateral de población se visualizaron por el uso del color rojo (rojo, 660/10 nm) frente azul (azul, 424/44 nm) de detección.
ABCG2 /fenotipo CD44 y de células activada por fluorescencia (FACS)
Después de 48 horas de incubación a tensiones de oxígeno de 1% y 20%, se tripsinizaron las células PC-3 y DU145, se contaron, se lavaron con tampón FACS frío ( PBS + BSA 0,03%), y se resuspendió a una concentración final de 10
6 células /ml. Las células se pre-bloquearon con 5% de BSA durante 30 minutos en hielo antes de que se tiñeron con anticuerpos primarios (anticuerpo monoclonal CD44 contra directamente conjugado con APC (allophycoyanin) y el anticuerpo monoclonal anti-ABCG2 directamente conjugado con FE (phycoerythin); BD Pharmingen Company) en hielo, en la oscuridad, durante 30 minutos. Las suspensiones celulares se lavaron dos veces, se resuspendieron en 400 l de tampón FACS, y se filtraron a través de una malla de nylon de 70 micras. Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo (Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.) para la detección de ABCG2 y CD44, y un clasificador de células FACS DiVa se utilizó para la clasificación de células. Después del cultivo en 1% o 20% de O
2 para 48 horas, se clasificaron las células PC-3 y DU145 basado en la expresión CD44. Para las células CD44 positivas, sólo se seleccionaron las células que expresan superiores al 10% (llamada CD44
brillante); para las células CD44 negativas, se aislaron las células que expresan el 10% del fondo (llamado CD44
DIM). Para cada muestra, fueron cerrada células viables e individuales; APC IgG2b de ratón (BD Pharmingen, EE.UU.) y FE IgG2b de ratón (BD Pharmingen, EE.UU.) controles de isotipo se utilizaron como controles negativos.
Esfera ensayo de formación de
El ensayo utilizado se basó en describió previamente métodos [30]. Después de las CD44
brillante células fueron ordenados con el método descrito anteriormente, solo CD44
luminosa y CD44
células tenues se sembraron a una densidad de 300 células por pocillo, en unión ultrabaja placas de seis pocillos (Ultra placas agrupadas bajo, Life sciences). Estas células se cultivaron en medio libre de DMEM /F12 de suero (Invitrogen) suplementado con 20 ng /ml de EGF y 20 ng /ml de bFGF durante diez días bajo condiciones de normoxia antes se evaluaron las esferas bajo miscopy inversa y se contaron (más de 30 células dentro de una esfera fue considerada como una esfera completa). Los datos son representativos de tres experimentos independientes
Los análisis estadísticos
Para cada experimento, los datos se muestran como media ± SEM de al menos tres experimentos independientes.; el software SPSS (versión 16.0) se utilizó para el análisis de datos. Los análisis estadísticos se realizaron con la prueba de ANOVA de una vía y de Student
t-test
(
P Hotel & lt; 0,05 se consideró significación estadística).
Resultados
la hipoxia induce la expresión de HIF-1α, HIF-2α, Oct3 /4 y Nanog
HIF-1α y HIF-2α, los principales factores de transcripción que responden a la hipoxia, se examinaron en las células de cáncer de próstata humano PC- 3 y DU145 que fueron expuestos a diferentes tensiones de oxígeno durante periodos de tiempo variables. Al 20% de O
2 tensión, HIF-1α y HIF-2α se expresaron débilmente, tanto a nivel de ARNm y proteínas; Se observaron niveles comparativamente altos de HIF-1α y la expresión de HIF-2α en el 7% de O
2 tensión, y los niveles más altos se observaron en el 1% de O
2 tensión (Figura 1A). A niveles de tensión de oxígeno reducidos, estos dos factores ya estaban regulados por incremento después de 6 horas de cultivo. Sus expresiones alcanzaron los niveles más altos en 12 horas de cultivo en el 7% de O
2 tensión, pero alcanzaron los niveles más altos a sólo 6 horas de cultivo en el 1% de O
2. Expresión de la proteína después de 48 horas de cultivo a diferentes tensiones de oxígeno se estudió también por inmunocitoquímica (Figura 1B). Las expresiones de HIF-1α y HIF-2α fueron consistentemente más elevada en las células tratadas con la hipoxia, de acuerdo con los resultados obtenidos por RT-PCR e inmunotransferencia.
(A) En comparación con las células cultivadas a 20 % O
2, las células cultivadas en el 7% de O
2 muestran mayores niveles de HIF-1α y HIF-2α, y las células cultivadas en el 1% de O
2 muestran los más altos niveles de HIF-1α y HIF-2α tanto por RT-PCR e inmunotransferencia. (B) La inmunocitoquímica revela altos niveles de HIF-1a y HIF-2α expresiones en las células cultivadas en 7% de O
2 y los más altos niveles de HIF-1a y HIF-2α expresiones en las células cultivadas en 1% de O
2 para ambas líneas celulares. Las secciones de carcinoma de mama se utilizaron como controles positivos tanto para HIF-1α y HIF-2α. Todas las fotos fueron tomadas originalmente a 200 × y se tomaron todas las inserciones en 400 ×.
Oct3 /4 y Nanog se utilizan con frecuencia como marcadores para las células no diferenciadas y desempeñan un papel esencial en el mantenimiento de la capacidad de auto-renovación de células madre adultas [31], [32]. Las expresiones de estos factores de transcripción también se examinaron en las células PC-3 y DU145 que fueron cultivadas en diferentes tensiones de oxígeno. Tanto a nivel de ARNm y de proteína (Figura 2A), expresiones débiles de Oct3 /4 y Nanog fueron revelados en estas dos líneas celulares cultivadas a 20% de O
2 la tensión, mientras que sus expresiones se upregulated en las células cultivadas en un 7% y 1% de O
2 condiciones. En ambas líneas celulares, las expresiones de estos dos factores fueron mayores a 1% de O
2 que en el 7% de O
2. Como también se ha visto en los análisis de inmunotransferencia (Figura 2A), Oct3 /4 y Nanog comenzaron a aumentar sustancialmente tan pronto como 6 horas después de que las células se transfirieron a 1% de O
2, y alcanzaron niveles máximos a las 12 horas, tanto para celular líneas. Cuando las células se colocaron en el 7% de O
2, la expresión de estos dos factores fueron también sustancialmente elevados después de 6 horas, y alcanzaron los niveles más altos en 12 horas de cultivo; sin embargo, estos niveles de expresión fueron más débiles que los observados en células expuestas a 1% O
2. Resultados similares se obtuvieron también por inmunocitoquímica (Figura 2B). Después de la exposición a condiciones hipóxicas, el aumento de expresiones Oct3 /4 y Nanog se observa tanto en células PC-3 y DU145.
(A) En comparación con las células cultivadas en 20% O
2, las células cultivada en el 7% de O
2 muestran niveles más altos de expresiones Oct3 /4 y Nanog, y las células cultivadas en el 1% de O
2 muestran los niveles más altos de expresiones Oct3 /4 y Nanog en PC-3 y células DU145 líneas de ambos RT-PCR e inmunotransferencia. (B) La inmunocitoquímica revela correspondiente niveles más altos de Oct3 /4 y Nanog expresiones en 7% O
2 y los más altos niveles de Oct3 /4 y Nanog expresiones en 1% de O
2, en comparación con las células cultivadas en 20% O
2 para ambas líneas celulares. secciones de tejido seminoma humanos se utilizaron como controles positivos para estos dos anticuerpos. Todas las fotos fueron tomadas originalmente a 200 × y se tomaron todas las inserciones en 400 ×.
Para determinar si la elevada
NANOG
expresión se deriva de
NANOG1
o
NANOGP8
, RT-PCR cuantitativa se realizaron análisis ulterior, con las correspondientes células cultivadas en normoxia como calibradores. Se verificó en varias ocasiones que el
NANOG1
expresión en las células en normoxia estaba en un nivel muy bajo, con un promedio de valores de Ct 37.24 y 37.37 para las células PC-3 células y DU145, respectivamente. Sin embargo, el
NANOGP8
expresión en las células bajo normoxia fue relativamente alta, con un promedio de valores de Ct 33.56 y 33.51 para las células PC-3 células y DU145, respectivamente. Aunque los niveles más altos
NANOG1
y
NANOGP8
expresiones se pudo observar en ambas líneas celulares en condiciones de hipoxia, el elevado
NANOG
expresión se confirmó predominantemente
NANOGP8
, con hasta 6 veces y aumento de 10 veces en la expresión en las células PC-3 y DU145 bajo 1% O
2, respectivamente (Figura 3). Dado que el
NANOG1
expresión en las células bajo normoxia fue extremadamente baja, el aumento de 2,6 veces y 3,1 veces en la expresión de este gen en las células PC-3 y DU145 bajo 1% O
2 representado todavía nivel de expresión muy bajo.
en comparación con las células en normoxia, no son elevados
NANOG1
y
NONOGP8
expresiones en las células bajo el 7% de O
2 para ambas líneas celulares, con un aumento de hasta 1,8 veces
NANOG1
expresión y hasta 2,5 veces
NONOGP8
aumento en ambas líneas celulares; las células en 1% de O
2 expresan niveles aún más altos de
NANOG1
y
NONOGP8
, con 2,6 veces y un aumento de 3,1 veces en
NANOG1
expresión en las líneas de células PC-3 y DU 145, respectivamente, y con 6 veces y aumento de 10 veces en
NONOGP8
expresiones en las líneas de células PC-3 y DU 145, respectivamente.
la hipoxia aumenta la capacidad de formación de colonias y se extiende G
0 /G
1 etapa
Desde la hipoxia aumentó la expresión de factores stemness, el próximo investigó si la hipoxia influyó en la proliferación de estas células. Las células PC-3 y DU145 se cultivaron bajo normoxia (20% O
2) o condiciones de hipoxia (1% de O
2 y 7% O
2) durante 48 horas para el ensayo de proliferación. Como se muestra en la Figura 4A, para cada línea celular no hubo diferencias estadísticamente significativas en la proliferación de las células cultivadas a diferentes tensiones de oxígeno (
P
& gt; 0,05), aunque las células crecieron algo más lento en condiciones de hipoxia de normoxia. A continuación, pregunta si la hipoxia en el preoperatorio podría influir clonogenicty en estas células. Las células se expusieron inicialmente a diferentes tensiones de oxígeno durante 48 horas, seguido de la transferencia a una cámara de normoxia (20% O
2) durante 14 días para el ensayo de formación de colonias. En comparación con las células que se cultivaron de manera constante en el 20% de O
2, se observaron más colonias en las células que fueron pretratados con un 7% de O
2, e incluso más colonias se observaron en las células pretratadas al 1% O
2 (Figura 4B). En comparación con las células siempre se cultiva bajo la normoxia, estadística y significativamente mayor eficiencia de formación de colonias fue identificado en los PC-3 y DU145 ells hipoxia pretratados (Figura 4C). Los análisis del ciclo celular demostró una G extendida
0 /G
1 etapa en las células que fueron expuestas a 1% O
2 durante 48 horas en comparación con las células cultivadas a 20% de O
2 como controles (
P
& lt; 0,05). (Figura 4D y e), lo que indica más células en un estado de reposo en condiciones de hipoxia
(a) curvas de proliferación celular no muestran ninguna diferencia estadística para el crecimiento celular bajo diferentes tensiones de oxígeno (
P & gt; 0,05).
(B) Ensayo de formación de colonias para las dos líneas celulares muestra más colonias en las células pre-tratadas a 7% de O
2 durante 48 horas y aún más colonias en las células pre-tratado bajo 1% O
2 (C ) Histogramas para la eficacia de formación de colonias muestra estadísticamente mayor eficiencia en las células pre-tratadas en condiciones de hipoxia (7% o 1% o
2) para las dos líneas celulares (
P
& lt; 0,0001). (D) La citometría de flujo muestra extendió G
0 /G
1 escenario para ambas líneas celulares que han sido cultivadas por debajo del 1% de O
2 durante 48 horas, en comparación con las células siempre se mantiene bajo normoxia. (E) Los análisis estadísticos revelan ampliado considerablemente G
0 /G
1 etapa en las células cultivadas en condiciones de hipoxia para ambas líneas celulares (
P Hotel & lt; 0,05).
la hipoxia aumenta la fracción de células con fenotipo
las células madre de población Side-como, supone que contiene las células madre del cáncer de próstata putativo, se sabe que bombear el colorante Hoechst 33342 [20], [33]. Células que muestran esta actividad se evaluaron adicionalmente durante el cultivo en diferentes tensiones de oxígeno. fracciones más altas de estas células lado la población fueron observados en los cultivos se mantuvieron a 1% de O
2 la tensión durante 48 horas en comparación con las células cultivadas a 20% de O
2 (Figura 5A y B).
células PC-3 y DU 145 se cultivaron en 1% de O
2 y el 20% de O
2 coditions durante 48 horas para analizar el fenotipo de tallo similar a través de citometría de flujo ensayo. (A) Las imágenes representativas muestran que se indujeron células de población lateral en ambas líneas celulares después del tratamiento hipóxico. (B) análisis estadísticos muestran diferencias significativas en la población lado. (C) La citometría de flujo análisis muestran niveles más altos de intensidad de expresión ABCG2 en ambas líneas celulares en condiciones de hipoxia. (D) histograma muestra diferencia estadísticamente significativa en la expresión ABCG2. (E) La citometría de flujo análisis muestran una mayor intensidad de la expresión de CD44 en ambas líneas celulares en condiciones de hipoxia. (F) El histograma muestra una diferencia estadísticamente significativa en la expresión de CD44.
ABCG2 y CD44 se han descrito como marcadores madre, como el cáncer de próstata sobre la base de las investigaciones clínicas y estudios en líneas celulares de cáncer de próstata [19], [ ,,,0],33]. Por lo tanto, ABCG2 y CD44 expresiones en las células PC-3 y DU145 que se incubaron en 1% o 20% de O
2 tensiones durante 48 horas se examinaron con citometría de flujo. Como se muestra en las Figuras 5C y D, lanzó eran 1,20 veces y aumento de 1,42 veces en la expresión ABCG2 en las células PC-3 y DU145 bajo 1% O
2, respectivamente, en comparación con las células siempre cultivadas en normoxia. Del mismo modo, hubo 1,50 veces y 1,45 veces el aumento en la expresión de CD44 en las células PC-3 y DU 145 menores de 1% de O
2, respectivamente, en comparación con las células siempre cultivadas en normoxia (Figuras 5E y F).
Desde la hipoxia puede inducir tanto ABCG2 y la expresión de CD44 en ambas líneas celulares, que investigarse más a fondo la relación entre CD44 y ABCG2. Doble tinción de estos dos marcadores de superficie reveló que la ABCG2 hipoxia inducida
+ células fueron principalmente CD44
células brillantes, y el CD44
células oscuras en las mismas condiciones de cultivo fueron en su mayoría negativos para la expresión ABCG2 (Figura 6A ).
(A) doble tinción de CD44 y de la superficie ABCG2 marcadores con citometría de flujo ensayo muestra los niveles más altos expresiones de estos factores en ambas líneas celulares en condiciones de hipoxia durante 48 horas.