Extracto
Src y el objetivo mamífero de la señalización de la rapamicina (mTOR) se activan comúnmente en la no cáncer de pulmón de células pequeñas (NSCLC) y, por tanto, los objetivos potenciales para la quimioterapia. Aunque el uso combinado de Src inhibidor de dasatinib con otros agentes quimioterapéuticos ha demostrado una eficacia superior para el tratamiento del cáncer, los mecanismos que conducen a una mayor sensibilidad de dasatinib no se entienden completamente. En este estudio, encontramos que la rapamicina aumenta drásticamente el crecimiento celular y la inhibición de detención del ciclo celular G1 dasatinib inducida en células de adenocarcinoma de pulmón A549 humano sin afectar la apoptosis. Los efectos sinérgicos se correlacionaron consistentemente con la sobre regulación de las quinasas dependientes de ciclina inhibidor proteínas, incluyendo p16, p19, p21, y p27, así como la represión de la expresión Cdk4 y la translocación nuclear. investigaciones mecanicistas demostraron que FoxO1 /FoxO3a y p70S6K /4E-BP1, las moléculas de aguas abajo de Src-PI3K-Akt y la señalización de mTOR, se suprimieron significativamente por el uso combinado de dasatinib y rapamicina. Restricción Src y mTOR con pequeños ARN de interferencia en las células A549 confirmó además que la Src /PI3K /mTOR Camino jugó un papel crucial en la mejora del efecto contra el cáncer de dasatinib. Además, este hallazgo también fue validado por una serie de ensayos que utilizan otras dos líneas celulares de cáncer, NCI-H1706 y NCI-H460. En conclusión, nuestros resultados sugieren que la aplicación combinatoria de inhibidores de Src y mTOR podría ser una estrategia terapéutica prometedora para el tratamiento del NSCLC
Visto:. Chen B, Xu X, Luo J, H Wang, Zhou S (2015) La rapamicina Mejora la Lucha contra el cáncer Efecto de dasatinib por la supresión de Src /PI3K /mTOR ruta en células de NSCLC. PLoS ONE 10 (6): e0129663. doi: 10.1371 /journal.pone.0129663
Editor Académico: Shi-Yong Sun, Universidad de Emory, Estados Unidos |
Recibido: 27 Febrero, 2015; Aceptado: 11-may de 2015; Publicado: 10 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Municipal de Shanghai de Ciencias Naturales (Grant N0.13ZR1434700) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant N0.81301994). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) es el principal subtipo patológico de cáncer de pulmón que es la causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. Entre los pacientes con CPNM, las quinasas de la familia Src (SFKs) son constitutivamente activada o sobreexpresada [2,3]. Como una posible diana terapéutica para el NSCLC, Src podría desempeñar un papel importante en la progresión de adenocarcinomas de pulmón a través de la regulación de las señales de múltiples moléculas de la superficie celular, incluyendo la integrina, factores de crecimiento, y G receptores acoplados a proteínas [4,5]. Los estudios preclínicos han demostrado que la inhibición SFKs puede suprimir la proliferación, angiogénesis, invasión, y la supervivencia de células de cáncer [6-9]. A medida que el inhibidor específico de Src, dasatinib ha sido aprobado para el tratamiento de la leucemia mieloide crónica (CML), y en la actualidad se está evaluando para el uso clínico en cáncer de pulmón [10,11]. Sin embargo, dasatinib como monoterapia mostró actividad clínica modesta que era inferior a la observada en general en pacientes con CPNM que recibieron quimioterapia [11]. Por el contrario, la combinación de dasatinib con quimioterapia citotóxica parecía más prometedor que el uso como agente único. Desde Src puede mediar la resistencia del tumor a la quimioterapia citotóxica, la inhibición de Src por dasatinib se ha demostrado para mejorar la respuesta de las células de cáncer de pulmón y de colon al cisplatino in vitro [12,13]. Además, un reciente ensayo clínico de dasatinib en combinación con erlotinib logra mejorarse efecto beneficioso del tratamiento en pacientes con CPNM tratados previamente [14]. Por otra parte, dasatinib podría facilitar también los efectos anticancerígenos de la radioterapia [15]. Aunque la eficacia superior ha sugerido fuertemente que combinación con dasatinib es de importancia crítica para las terapias de NSCLC, los mecanismos que conducen a una mayor sensibilidad de las quimioterapias siguen siendo complejos y no se entiende completamente. Teniendo en cuenta que modula la transducción de señales Src que regulan la proliferación, la invasión, la apoptosis,
etc
. de las células cancerosas, los estudios descifrar la regulación de la activación de Src y su interacción con otras moléculas de señalización en la terapia del cáncer están particularmente justificadas.
Además de Src, el objetivo de la rapamicina en mamíferos (mTOR) es también muy activa en muchas cáncer de pulmón los pacientes y representa como otro objetivo para la terapia. La vía de señalización mTOR impulsa muchos de los principales procesos celulares y está implicada en un número creciente de estados patológicos incluyendo cáncer [16]. Recientemente, datos clínicos preliminares han indicado una cierta actividad antitumoral del inhibidor de mTOR rapamicina y sus análogos en algunos tipos de cáncer incluyendo NSCLC [17,18]. En particular, la rapamicina es también siendo explorado por su capacidad para restaurar la sensibilidad de las células cancerosas a aguas arriba de señalización agentes dirigidos [19]. Akt inhibición /mTOR por rapamicina o sus derivados han aparecido para mejorar sinérgicamente la citotoxicidad de la radiación y agentes quimioterapéuticos, la promoción de la inducción de la detención del ciclo celular y la apoptosis [20,21]. Por otro lado, se ha demostrado que la mTOR podría ser activado por Src señalización a través de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) /Akt vía [22-24]. Esto condujo a la hipótesis de que la combinación de rapamicina con inhibidores de Src, tales como dasatinib, podría facilitar la actividad contra el cáncer y ser más eficaz en la quimioterapia. Un estudio reciente demostró que la doble inhibición de Src y mTOR fue muy eficaz en la regresión del tumor en modelos de ratón de cáncer de mama [25]. Sin embargo, están disponibles actualmente con su uso combinatoria para el tratamiento de cáncer de pulmón no hay datos preclínicos. Además, el efecto potencial de mTOR en la regulación de la señalización Src sigue siendo en gran medida poco clara.
A continuación, se puede investigar el efecto terapéutico combinatoria de rapamicina y dasatinib sobre el cáncer de pulmón mediante el uso de células de adenocarcinoma de pulmón humano (A549), carcinoma de células escamosas de pulmón (NCI-H1703) y de células grandes células de cáncer de pulmón (NCI-H460) como modelos celulares in vitro. En este estudio, la inhibición del crecimiento celular inducida por dasatinib y la detención del ciclo celular se han mejorado de manera espectacular por el co-tratamiento con rapamicina, en paralelo con el entonces sobre regulación de las quinasas dependientes de ciclina (CDK) inhibidores de las proteínas. Análisis de las moléculas de señalización mostró que la desactivación Src fue facilitado de manera eficiente por medio de la inhibición de mTOR vía PI3K-Akt. El uso de pequeños RNAs de interferencia contra Src y mTOR, se observó la represión similares a los de los inhibidores sobre la proliferación celular, la progresión del ciclo celular, la invasión y la migración en las células A549. Por otra parte, nuestros resultados revelaron la interacción sinérgica entre src y señalizaciones de mTOR en las células NSCLC, lo que sugiere el beneficio terapéutico prometedor de mTOR /Src inhibición dual para el tratamiento de NSCLC.
Materiales y Métodos
Reactivos y anticuerpos
El dasatinib y rapamicina fueron adquiridos de Selleck química (Shanghai, china). Los anticuerpos primarios contra fosfo-Src (Tyr416), Src, fosfo-mTOR (Ser2448), mTOR, fosfo-PI3K (Tyr458), p85 PI3K, fosfo-Akt (Thr308), Akt, fosfo-FoxO1 (Ser256), fosfo-FoxO3a (Ser253),, 4E-BP1, CDK2, CDK4, Cdk6, y Alexa Fluor 555 conjugado de anticuerpos se obtuvieron a partir de la célula fosfo-4E-BP1 (Thr37 /46) Signal Technologies (Shanghai, China). Los anticuerpos primarios contra las proteínas inhibidor de CDK, incluyendo p16, p19, p21, p27, y β-tubulina se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Shanghai, China). Los anticuerpos contra fosfo-p70S6K (Thr389 /412), p70S6K, fueron adquiridos de SAB Signalway (College Park, MD, EE.UU.). El HRP secundaria o anticuerpos conjugados con FITC, si-mTOR, si-Src, y transfección reactivos fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology (Shanghai, China).
cultura y el tratamiento de la célula
La adenocarcinoma A549 línea celular humana, pulmonar de células escamosas línea celular de carcinoma humano NCI-H1703, de células grandes de pulmón línea celular de cáncer humano NCI-H460 y células del epitelio bronquial normal de BEAS-2B se adquirieron de ATCC (Pekín, china), y se cultivaron en Dulbecco modificado medio eagle (Life Technology, Shanghai, china) suplementado con suero bovino fetal al 10%, a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de CO
2. El número de células y la viabilidad se determinó por exclusión de azul de tripano, con al menos 90% de células viables antes de la exposición al tratamiento. las células A549 se trataron con dasatinib (5, 10, 25, o 50 nM) solo o en combinación con rapamicina (20, 50, o 100 nM) durante 24 a 96 horas. Las células tratadas con 0,1% de dimetilsulfóxido (DMSO) se utilizaron como control del vehículo.
Ensayos
proliferación celular y ciclo celular
Para el ensayo de proliferación celular, 10
4 células por pocillo fueron sembradas en 24 -Bueno placas y se incubaron durante 24 h. Las células se trataron con 5, 10, 15, o 20 nM de dasatinib en presencia o ausencia de la rapamicina (20, 50, o 100 nM), y se recogieron a las 24, 48, 72, y 96 h. Trypan azul exclusión ensayos se llevaron a cabo para determinar el número de células utilizando un Cellometer Auto T4 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, EE.UU.)
.
Para el ensayo del ciclo celular, se recogieron las células en placas de 6 pocillos, se aclararon y se fija durante la noche en etanol al 75% frío a -20 ° C. A continuación, las células se trataron con tampón Tris-HCl (pH 7,4) con 100 mg /ml de ARNasa A y se tiñeron con 25 mg /ml de yoduro de propidio (PI) (Life Technology, Shanghai, China). Diez mil células fueron adquiridas y analizadas por citometría de flujo (BD FACSCalibur, CA, EE.UU.), basado en el contenido de ADN.
Apoptosis ensayo
1 × 10
6 células fueron tratadas con DMSO ( 0,1%), dasatinib (10 nM) solo o en combinación con rapamicina (100 nM) durante 96 h. tasa de apoptosis celular se determinó por Anexina V-FITC Apoptosis Kit de Detección I (BD Biosciences, Shanghai, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las intensidades de fluorescencia de todas las sondas se determinaron por citometría de flujo (BD FACSCalibur, CA, EE.UU.).
cuantitativa en tiempo real PCR
ARN total se aisló usando el reactivo Trizol y se trató con DNasa según la Instrucciones del fabricante. Primera línea de cDNA fue sintetizado utilizando M-MLV transcriptasa inversa y oligo-dT cebador (Invitrogen, Shanghai, China). ensayos cuantitativos de PCR en tiempo real se realizaron en placas ópticas de 96 pocillos en un sistema ABI Prism 7000 Sequence sistema de detección (Lifetechnology, Shanghai, China) con SYBR Green qPCR Master Mix (Qiagen, Shanghai, China). La expresión de P16, P19, P21, P27, ciclina A /D1 /E y ARNm CDC25A se normalizó frente a la de ARN 18s. Primer secuencias para ensayos de PCR en tiempo real se enumeran en la Tabla S1.
Western Blot
homogeneizado proteínas (20 g) de cada células tratadas se resolvieron en geles de poliacrilamida-SDS y se transfirieron electroforéticamente a membranas de difluoruro de polivinilideno Immobilon-P. Posteriormente, las membranas se incubaron con anticuerpos específicos frente a proteínas inhibidoras de CDK (p16, p19, p21 y p27), cdk2 /4/6, caja proteínas Forkhead (FoxO1 y FOXO3A), la Src fosforilada o total, PI3K, Akt, mTOR, p70S6K y 4E-BP1, respectivamente. Beta-tubulina se utilizó para la normalización de la carga de proteínas. Después de la incubación con peroxidasa de rábano (HRP) y conjugado con anticuerpos IgG, las membranas fueron desarrolladas utilizando ECL Western Blot reactivo de detección (Thermo, Pekín, China). mediciones de densitometría de las bandas se realizaron utilizando el software Cantidad Uno de los programas (Bio-Rad, Pekín, China).
inmunofluorescencia tinción celular
Después sembradas en placas de 12 pocillos durante 24 h, las células A549 fueron tratados con DMSO (0,1%), dasatinib (10 nM) solo o en combinación con rapamicina (100 nM) durante 48 h. Las células se lavaron y se fijaron con 0,4% de paraformaldehído durante 15 min a temperatura ambiente, después se incubaron con anticuerpos primarios contra Src fosforilada o Cdk4 durante la noche a 4 ° C. Después del lavado, las células se incubaron con FITC marcado con Alexa Fluor 555 o anticuerpo secundario conjugado. Posteriormente, el núcleo de la célula se tiñeron con PI y luego observó utilizando el sistema de imágenes múltiples Cytation 3 (BioTek, VT, EE.UU.).
pequeños ARN de interferencia (siRNA) transfección
Se sembraron células A549 en una placa de cultivo de tejidos de seis así por 2 x 10
5 células por pocillo en 2 ml de medio libre de antibióticos y se incubaron durante 24 h. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, las células se incubaron con medio de transfección que contiene Si-Src, si-mTOR, o controlar siRNA para 8 h. A continuación, el medio de transfección se reemplazó por medio completo fresco normales, seguido de una incubación adicional durante 24 a 72 h. Posteriormente, las células se recogieron para los ensayos sobre la proliferación celular, el ciclo celular y transferencia Western, respectivamente
invasión de la célula de ensayo
ensayo de invasión celular se realizó usando cámaras de trans-así membrana recubierta con Matrigel. ( para la invasión, BD Biosciences, Shanghai, china). Un total de 5 × 10
5 células se sembraron en la cámara superior con medio libre de suero y se trató con 0,1% de DMSO, dasatinib (10 nM) solo o en combinación con rapamicina (100 nM). A continuación, se dejó que las células para invadir hacia 10% de FBS como un quimioatrayente en la cámara inferior durante 24 h. Las células en la cámara superior se retiraron cuidadosamente utilizando un hisopo de algodón, y las células de la membrana inferior se fijaron y tiñeron con rojo nuclear. El número de células invadidas se contaron bajo el microscopio y el porcentaje de invasión se calculó por células invasoras través de la matriz y la membrana de Matrigel con relación a la invasión de las células en el grupo de control.
Cicatrización de heridas ensayo
Las células se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos, y alcanzaron el 70-80% de confluencia como una monocapa después de 24 horas de crecimiento. La monocapa se rascó suavemente y poco a poco con una nueva punta de pipeta de 1 ml a través del centro del pozo. Entonces así fue lavado dos veces con medio para eliminar las células desprendidas. Después de la reposición de la bien con medio fresco, las células se trataron y se cultivaron durante 18 h adicionales. La monocapa de células se fotografiaron con un microscopio de contraste de fase invertida.
El análisis estadístico
Todos los datos representan al menos tres experimentos independientes y se expresan como la media ± desviación estándar (SD) se realizaron comparaciones estadísticas utilizando un paquete de software SPSS 16,0 y se analizaron con un análisis de varianza (ANOVA) seguido de la prueba de Dunnett post hoc en su caso. La significación estadística se estableció en valores de p & lt; 0,05 (*), o & lt; 0.01 (**).
Resultados
La rapamicina aumentó el efecto inhibitorio de dasatinib sobre la proliferación celular y la progresión del ciclo celular en células A549
Como se muestra en la figura 1A, en dasatinib niveles farmacológicamente relevantes disminuyeron notablemente el número de células de las células A549 de una manera dependiente de la concentración. Notablemente, la co-tratamiento con rapamicina (50 y 100 nM) inhibición del crecimiento dasatinib mediada mejora de forma significativa en las células A549, en que 10 nM de dasatinib más 100 nM de rapamicina podría lograr magnitudes iguales de actividad contra el cáncer de dasatinib solo en la concentración de 50 nm. Resultados acerca de los efectos temporales de dasatinib con rapamicina indicaron que la proliferación de las células A549 se inhibió significativamente por dasatinib (10 nM) a través de 96 h de tratamiento (Fig 1B). Es importante destacar que, el co-tratamiento con rapamicina (100 nM) se redujo aún más el número de células en tan pronto como a 48 h, lo que sugiere la marcada eficacia sinérgica para el tratamiento de la misma dasatinib. Sin embargo, la rapamicina sola mostró supresión de menor importancia en la curva de crecimiento de las células cancerosas.
(A) El efecto dependiente de la concentración de rapamicina en la actividad contra el cáncer de dasatinib en células A549. Como se detalla en el "
Métodos
", las células A549 se trataron con control de vehículo (0,1% DMSO) o dasatinib (5, 10, 25, y 50 nM) en presencia y ausencia de la rapamicina (20, 50 , y 100 nM). el número de células viables se analizaron a las 72 h después de la co-tratamiento. (B) Efectos de la rapamicina en los cambios temporales de la inhibición del crecimiento dasatinib inducida en células A549. Las células se trataron con control de vehículo (0,1% DMSO), dasatinib (10 nM) con o sin rapamicina (100 nM). El número de células se midieron a 0, 24, 48, 72, y 96 h después del tratamiento. (C) Los efectos de dasatinib y rapamicina sobre la distribución del ciclo celular. las células A549 se trataron con dasatinib (10 nM) o rapamicina (100 nM) durante 96 h y se analizaron por citometría de flujo después de tinción PI. Los resultados se expresan como el porcentaje medio de células en G0 G1, fase /S, y G2 /M a partir de tres experimentos independientes. (d) los efectos de dasatinib y rapamicina sobre la apoptosis en células A549. Las células se trataron con dasatinib (10 nM) o rapamicina (100 nM) durante 96 h y las tasas de apoptosis se determinó por citometría de flujo con anexina-V y tinción PI. Columnas, con una media de tres determinaciones; bares, Dakota del Sur. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0.01.
Los estudios anteriores han demostrado que tanto Src y mTOR a menudo se activan constitutivamente en las células de la leucemia mieloide aguda (LMA) y por lo tanto constituyen posibles dianas terapéuticas. Por ejemplo, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) erlotinib inhibidor podría inducir la detención del ciclo celular en la fase G1 por la inhibición de la señalización oncogénica a través de Src y mTOR [26]. De acuerdo, nuestros resultados de ensayo del ciclo celular en células A549 mostraron que dasatinib (10 nM) aumentó significativamente la proporción de células en fase G1, en comparación con el grupo control (Fig 1C), lo que sugiere la detención directa de la progresión del ciclo celular mediante la inhibición de Src en células de cáncer. Por el contrario, la rapamicina (100 nM) por sí solo exhibió poco efecto sobre la distribución de células en varias fases del ciclo celular. Sin embargo, la presencia de rapamicina en la co-tratamiento con dasatinib aumentó notablemente el porcentaje de células en fase G1, lo que resulta en la obstrucción significativa de transición G1 /S y la mitosis celular. El resultado fue consistente con la inhibición sinérgica del crecimiento celular por dasatinib y rapamicina en combinación. Mientras tanto, se observó el efecto de dasatinib y rapamicina sobre la apoptosis celular se evaluó también en células A549, pero no hay diferencia significativa de la tasa de apoptosis de las células entre tratamientos con control, dasatinib o rapamicina (Fig 1D), lo que sugiere que la rapamicina y dasatinib tuvieron efecto menor en la apoptosis en células A549.
la rapamicina potenció dasatinib hasta de regular proteínas inhibidoras de CDK y regular a la baja Cdk4
G1 del ciclo celular está controlado por varios factores, entre ellos las ciclinas, proteínas ciclo de división celular ( CDC), las CDK y proteínas inhibidoras de CDK. Nuestro estudio preliminar demostró que la expresión de ciclina A /D1 /E y Cdc25A no se modificaron significativamente por dasatinib y rapamicina en el mRNA y los niveles de proteína S1 (FIG). En cuanto a los inhibidores de CDK, dasatinib aumentó la expresión de p16, p19, y p21, tanto a nivel de mRNA (Fig 2A) y proteína (Fig 2B), con diferencia estadística de los grupos de control. Curiosamente, el co-tratamiento con rapamicina promueve notablemente inducida por dasatinib solo aparecido sobre regulación de p16, p19, p21, y p27, pero rapamicina tener poco impacto en la expresión de estas proteínas inhibidor de CDK. Como consecuencia, la expresión de Cdk4 se suprimió drásticamente por la combinación de dasatinib y rapamicina, pero tampoco Cdk2 ni Cdk6 parecía claramente sensible a los tratamientos (Fig 2B).
células A549 se trataron con control de vehículo (0,1 % de DMSO) o dasatinib (10 nM) en presencia y ausencia de la rapamicina (100 nM) durante 24 h. (A) Expresión relativa de proteínas inhibidoras de CDK (p16, p19, p21 y p27) a nivel de ARNm. Columnas, con una media de tres determinaciones; bares, Dakota del Sur. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0.01. (B) Expresión de proteínas CDK inhibidor, CDK y FoxOs determinados por Western Blot. (D) La localización de Cdk4 determinada por la tinción de inmunofluorescencia. imágenes representativas de tinción indicado de Cdk4 (rojo), el núcleo (azul), y las imágenes fusionadas.
Para confirmar aún más los efectos de dasatinib y rapamicina en proteínas inhibidoras de CDK, la expresión y distribución de Cdk4 en Las células A549 se analizaron adicionalmente por tinción de inmunofluorescencia. Normalmente, Cdk4 se une a ciclina D para formar un complejo en el citoplasma, entonces se acumula en la membrana nuclear y trasladar en el núcleo cuando las células progresan a través de G1 /S de fase. Nuestro resultado mostró que Cdk4 predominantemente localizada en el núcleo en las células A549; sin embargo, fueron secuestrados en parte en el citoplasma bajo el tratamiento con dasatinib (Fig 2C). Además, la translocación de Cdk4 en el núcleo se bloqueó de manera significativa por el tratamiento con dasatinib y rapamicina en combinación. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren consistentemente que la inhibición de la progresión del ciclo celular por dasatinib y rapamicina fue mediado a través de la regulación de CDK inhibidores de proteínas, así como la baja regulación de la Cdk4 en las células A549.
En informes anteriores han demostrado que la p19, p21 y p27 fueron transcripcionalmente regulados por Foxos, que más tarde se ha demostrado como objetivos de abajo de PI3K /AKT [25,27]. Recientemente se ha informado de que p16 puede también ser regulada por vía Src-AKT en la senescencia celular en células humanas de cáncer de próstata [28]. En este estudio, nuestro resultado indicó que los niveles de fosforilación de FoxO1 y FOXO3a fueron también aumentó notablemente por el co-tratamiento cuando se compara con la inducida por cualquiera de Src o inhibidor de mTOR solo (Fig 2B). Por otra parte, el resultado fue en paralelo con la expresión de inhibidores de CDK. Por lo tanto, especuló que la sobre regulación de inhibidores de CDK de dasatinib y rapamicina fue probablemente atribuido a la Src y PI3K /AKT.
La rapamicina sinergizada con dasatinib en la supresión de la PI3K-Akt-mTOR señalización en las células A549
el estudio más reciente demostró que la fosforilación de Src puede facilitar la activación de la vía de señalización Akt-mTOR en las células de AML [29]. Para investigar la posible interacción entre Src y mTOR vías, se analizó la activación de Src, PI3K, AKT y mTOR en secuencia. En primer lugar, la tinción de inmunofluorescencia de fosfo-Src indica que la activación de Src fue inhibida por dasatinib y más significativamente reprimido por el co-tratamiento con rapamicina (Fig 3A), lo que sugiere que la inhibición de mTOR por rapamicina podría sinergizar con dasatinib en la supresión de la activación de Src en células A549 . Y este resultado se confirmó además mediante transferencia Western (Fig 3B). Además, nuestros datos demuestran que la inhibición de Src por dasatinib también podría suprimir la activación de PI3K-Akt en las células A549, que estaba de acuerdo con los informes anteriores [29]. Más importante aún, las inhibiciones de Src, PI3K, AKT y se mejoraron por unanimidad por la presencia de rapamicina en comparación con dasatinib solo, como se muestra en la figura 3B y 3C. Fue la pena señalar que el resultado se correlaciona bien con las observaciones con respecto a la expresión del inhibidor de CDK y caja de proteínas Forkhead (Figura 2B), que estaban de acuerdo con nuestras especulaciones sobre la relación entre la detención del ciclo celular y la desactivación Src-PI3K-AKT. Por otro lado, la inmunotinción y los resultados de transferencia Western indicaron que la activación de Src fue inhibida por rapamicina, en menor medida de lo que dasatinib. Estos datos implican que la mTOR, que convencionalmente se reconoció como el objetivo de la señalización de respuesta /AKT PI3K, también podrían desempeñar un papel importante en la regulación de la activación de Src.
A549 células fueron tratadas con el control del vehículo (DMSO al 0,1%) , dasatinib (10 nM) con o sin rapamicina (100 nM) durante 24 h. Se recogieron las proteínas de homogeneizado (20 g) de todo el lisado celular y se utilizan para el Western Blot. (A) Activación de Src determinado por la tinción de inmunofluorescencia. Representante imágenes indican la tinción de Src (rojo), el núcleo (azul), y las imágenes fusionadas. (B) La activación de Src, PI3K, y Akt determinada por Western Blot. (C) la cuantificación de Densitometría Src, PI3K y la fosforilación de Akt en las células A549. (D) La activación de la señalización de mTOR determinada por Western Blot. (E) Densitometría cuantificación de mTOR, p70S6K y la fosforilación de 4E-BP1 en las células A549. Los datos presentados relaciones medias de fosforilación en relación con el control sin tratar a partir de tres experimentos independientes. Columnas, con una media de tres determinaciones; bares, Dakota del Sur. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0.01.
A continuación, se determinó la activación de mTOR mediante Western Blot en los niveles fosforiladas de mTOR. Como se esperaba, la activación de mTOR se inhibió de manera significativa por el inhibidor de la rapamicina. A pesar de dasatinib mostró efecto moderado en la represión de la activación de mTOR, la combinación con rapamicina notablemente avanzada que la inhibición inducida por dasatinib solo (Fig 3D y 3E). Por otra parte, la fosforilación de p70S6K y 4E-BP1, los objetivos conocidos en el sentido descendente de la vía mTOR, se suprimió significativamente tanto por rapamicina y también se redujeron aún más por la combinación con dasatinib. En conjunto, estos resultados sugieren que la rapamicina sinergizada con dasatinib en la represión de la vía de señalización de PI3K-Akt-mTOR en células A549.
represión Dual de mTOR y Src por siRNAs inducidas detención del ciclo celular y la inhibición del crecimiento en células A549
Para validar la posible interacción entre Src y la señalización de mTOR, que investigarse más a la alteración de los niveles de fosforilación de PI3K /AKT, y los niveles de expresión de CDK inhibidores de las proteínas en las células A549 con el knock-down artificial de Src o mTOR . Como se muestra en la figura 4A, la expresión de restricción de Src o mTOR por siRNAs reprimidos significativamente los niveles de fosforilación de PI3K /AKT y p70S6K /4E-BP1, respectivamente. Por el contrario, los niveles de expresión de las proteínas inhibidoras de CDK, incluyendo p16, p19, p21, y p27, fueron aparentemente elevado por la si-mTOR o si-Src (Fig 4B). De acuerdo, la expresión de FoxO1 también se incrementó mientras que Cdk4 disminuyó significativamente. Más importante aún, la doble knock-down de mTOR y Src promovió significativamente la inhibición de PI3K /AKT, p70S6K /4E-BP1, y dio lugar a la sobre regulación de CDK inhibidores de las proteínas, en comparación con cualquiera de los dos si-mTOR o si-Src solo. Los resultados fueron consistentes con nuestros hallazgos en las células A549 tratadas con rapamicina y dasatinib
.
(A) los niveles de activación de PI3K, AKT y mTOR determinados por Western Blot. Las células A549 se transfectaron con si-Src, si-mTOR, o ARNsi de control de 8 h, seguido de una incubación prolongada de 24 h. Se recogieron las proteínas de homogeneizado (20 g) de todo el lisado celular y se utilizan para el Western Blot. (B) La expresión de proteínas inhibidoras de CDK (p16, p19, p21, y p27), FoxO1, y Cdk4 determinada por Western Blot. (C) Efectos de la si-si-mTOR y Src en la progresión del ciclo celular. Las células A549 se transfectaron con si-Src, si-mTOR, o ARNsi de control de 8 h, seguido de una incubación prolongada de 24 h. A continuación, las células se recogieron y se analizaron por citometría de flujo con tinción PI. Los resultados se expresan como el porcentaje medio de células en G0 G1, fase /S, y G2 /M a partir de tres experimentos independientes. Los resultados se expresaron como el porcentaje medio de células en G0 G1, fase /S, y G2 /M a partir de tres experimentos independientes. (D) Efectos de la si-si-mTOR y SRC en los cambios temporales de la proliferación celular. ells A549 se transfectaron con si-Src, si-mTOR, o ARNsi de control de 8 h, y después se incubaron con medio normal durante 72 h. El número de células se midieron a 0, 24, 48, y 72 h después de la transfección. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0.01.
Además, el knock-down de mTOR y Src dio lugar a la detención del ciclo celular similar a la inducida por los inhibidores específicos de la rapamicina y dasatinib. Como se muestra en la figura 4C, la doble inhibición de mTOR y Src por siRNAs inducidas supresión más significativa de la progresión del ciclo celular en la fase G1 en las células A549, en comparación con ya sea si-mTOR o si-Src solo. Además, la proliferación de las células también se vio afectada de la manera comparable con la inducida por los inhibidores químicos (figura 4D). Fue notable que solo si-mTOR también indujo la detención en G1 moderada y la inhibición del crecimiento en las células A549, posiblemente debido a su mayor eficacia en deprimente mTOR que el impuesto por la rapamicina. En conjunto, si-mTOR mejora de forma significativa la inhibición de la detención del ciclo celular y el crecimiento que induce por si-Src en células A549, que apoya nuestra conclusión sobre el efecto quimioterapéutico mejorada de dasatinib en combinación con rapamicina.
La rapamicina potenció la inhibición efecto de dasatinib sobre la invasión y migración celular en las células A549
Para confirmar aún más el efecto potenciador de la rapamicina sobre la actividad anticancerígena de dasatinib, se analizó la invasión y migración de las células A549 en virtud de diversos tratamientos. Como se muestra en la figura 5A, la capacidad invasiva a través de filtros recubiertos con Matrigel de las células tratadas por dasatinib se redujo significativamente en comparación con las células de control. El co-tratamiento de dasatinib con rapamicina se redujo aún más el porcentaje de invasión de las células A549 en casi un 50%, mientras que la rapamicina sola no mostró supresión clara sobre la invasión de células en comparación con el control.
(A) Imágenes representativas ( panel superior) y cuantificación (panel inferior) de las células invasoras. Como se detalla por "ensayo de invasión de células" en el "
Métodos
", las células A549 se trataron con DMSO (0,1%), dasatinib (10 nM) solo o en combinación con rapamicina (100 nM) durante 24 h. El número de células invasoras fueron contados bajo el microscopio y los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes, * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0.01. (B) Imágenes representativas de los ensayos de curación de heridas en células A549 que se trataron con DMSO (0,1%), dasatinib (10 nM) o rapamicina (100 nM) durante 18 h. (C) La expresión de MMP-2/9 y E-cadherina determinada por Western Blot en células A549 que se trataron con DMSO (0,1%), dasatinib (10 nM) o rapamicina (100 nM) durante 24 h.
Además, el efecto de dasatinib y rapamicina sobre la capacidad de migración de las células A549 se evaluó mediante el ensayo de curación de la herida utilizando células físicamente heridos (Fig 5B). A las 18 h después de que se raye, las células A549 no tratadas migraron de manera eficiente en la incisión, y el efecto de la rapamicina sola sobre la migración celular aparecido limitada. En contraste, la migración fue obviamente inhibida por el tratamiento con dasatinib. 0.01. 0.01.