Extracto
Antecedentes
Es controvertido si microARN-126 es un supresor tumoral u oncogénica miARN. Se necesitan más experimentos para determinar si microARN-126 se asocia con el riesgo de cáncer de pulmón de células no pequeñas y el pronóstico.
Métodos
se realizó durante la expresión de microARN-126 para evaluar la invasión de células y el crecimiento tumoral en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) líneas celulares y xenoinjertos modelo de ratón desnudo. Se llevaron a cabo experimentos con ganancia de función y ensayos de luciferasa para revelar la relación entre el microARN-126 y la vía de señalización PI3K-Akt en células A549. Se analizaron las asociaciones de la expresión de microARN-126 entre las variantes genéticas dentro de microARN-126 y la información clínica, incluyendo el tabaquismo, el sexo, la edad y el tipo histológico y el estadio tumoral.
Resultados
Más -expresión de microARN-126 en líneas celulares de NSCLC disminución de la proliferación celular in vitro y el crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto de ratón desnudo. Y microRNA-126 reprimió la actividad de vía PI3K-Akt por la orientación sitios de unión en la región 3 'no traducida del mRNA PI3KR2. El nivel de expresión de microARN-126 se redujo en líneas de NSCLC y tejidos tumorales. Los pacientes con baja expresión de microARN-126 tenían significativamente más pobre tiempo de supervivencia que aquellos con alta microARN-126 (de expresión medios para el tiempo de supervivencia (meses): 24.392 ± 1.055 vs 1.140 ± 29.282,
P
= 0,005). Sin embargo, no hubo diferencia significativa en las frecuencias genotípicas y alélicas de la variante microRNA-126 (G & gt; A, rs4636297) entre los casos y los controles (
P
= 0,366). Además, no hubo asociación entre el SNP rs4636297 y el tiempo de supervivencia en pacientes con CPNM (
P = 0,992)
. Y microARN-126 expresión tenía ninguna diferencia significativa entre los tres grupos de genotipos (
P = 0,972)
.
Conclusiones
Nuestros datos indican que el microARN-126 es un tumor- gen supresor en el CPNM y baja expresión de microARN-126 es un factor pronóstico desfavorable en pacientes con CPNM. Sin embargo, el mecanismo de regulación de microARN-126 que queda por esclarecer en diferentes tejidos normales y malignos. Por lo tanto, se necesita más investigación para explorar las funciones supresoras de tumores de microARN-126 en el CPNM
Visto:. Yang J, H Lan, Huang X, Liu B, Tong Y (2012) microARN-126 Inhibe la célula tumoral crecimiento y su nivel de expresión se correlaciona con una pobre supervivencia en células no pequeñas cáncer de pulmón pacientes. PLoS ONE 7 (8): e42978. doi: 10.1371 /journal.pone.0042978
Editor: William C. S. Cho, Hospital Queen Elizabeth, Hong Kong
Recibido: 7 Febrero, 2012; Aceptado: July 16, 2012; Publicado: 10 Agosto 2012
Copyright: © Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (número de concesión 30.800.633) y la provincia de Sichuan Ciencia y Tecnología Fundación para jóvenes (número de concesión 09ZQ026-034). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) sigue siendo la principal causa de muerte por cáncer en el mundo, así como en china [1]. Una gran cantidad de genes involucra en el CPNM tumorigénesis como
p53
,
Rb
, y
Ras
[2]. Un estudio muestra que 98 de 186 microRNAs están en regiones genómicas asociadas con el cáncer o en sitios frágiles [3]. Por ejemplo, el miR-99a, let-7, miR-125 ter-2 están situados en regiones sin homocigotos supresión conocidos genes supresores de tumores en el cáncer de pulmón [3]. Varios microARN se encuentran cerca de las regiones de corte, incluyendo el miR-142 en 50 nucleótidos de la t (8, 17) ruptura que compromete el cromosoma 17 y MYC [3]. Esto indica que los microARNs podrían desempeñar un papel crucial en la tumorigénesis y la progresión del cáncer [3]. Además, el perfil de expresión de microARN revela firmas características de muchos tipos de tumores y es un biomarcador de la clasificación de tumores, el pronóstico y resultado terapéutico [4] - [8].
microARN-126 se asigna a 9q34.3 del cromosoma dentro de la serie de genes del factor de crecimiento epidérmico como codificación-7 (
EGFL-7
). El microARN-126 es altamente expresado en los tejidos pulmonares y cardíacas, sino también expresa en niveles bajos en el cerebro, el hígado y el riñón [9]. los niveles de expresión altos de expresión microRNA-126 es identificado en las células endoteliales, que tiene un papel importante en la regulación de la angiogénesis y la integridad de los vasos sanguíneos mediante la inhibición de la vía VEGF. Desmontables de microRNA-126 dio como resultado la pérdida de la integridad vascular y hemorragia durante el desarrollo embrionario de pez cebra [10] - [13]. Además, algunos estudios revelaron que microRNA-126 reprime la apoptosis de las células de la leucemia mieloide aguda y mejora la capacidad de formación de colonias de células progenitoras de médula ósea de ratón a través de la orientación Polo-quinasa 2 (
PLK2
) [14]. Por el contrario, otros estudios mostraron que microRNA-126 se refiere a menudo gen supresor de tumores en diversos tipos de cáncer [15] - [21]. En el cáncer gástrico, la sobre expresión de microARN-126 mejora de forma significativa el crecimiento de las células dependiente de anclaje y anclaje independiente de la orientación por
SOX2
[16]. En el cáncer de colon, microRNA-126 suprime el crecimiento de las células tumorales por la orientación de fosfatidilinositol 3-quinasa beta subunidad reguladora (p85β) [19]. Algunos estudios también muestran que el microARN-126 puede inhibir la invasión y proliferación mediante la regulación de
Crk
,
VEGF
, y
EGFL7 Hoteles en NSCLC [15], [21], [ ,,,0],22]. Por lo tanto, las evidencias actuales parecen apoyar una estrecha relación entre el microARN-126 y el crecimiento del tumor. Por otra parte, en comparación con los pacientes que no responden a la primera línea de tratamiento con capecitabina y oxaliplatino, el nivel de expresión de microARN-126 fue significativamente mayor en los pacientes que respondieron al tratamiento con capecitabina y oxaliplatino [23]. Además, la relación de microRNA-126 /microRNA-152 habilitado la detección de cáncer de vejiga urotelial (BCA) de la orina en una especificidad del 82% y una sensibilidad del 72% [24]. Sobre la base de dichos informes, los microARN-126 podría tener valor predictivo posible y de diagnóstico para el cáncer.
Es controvertido si microARN-126 es un supresor tumoral u oncogénica miARN. Y el mecanismo de regulación de microARN-126 que queda por esclarecer en diferentes tejidos normales y malignos [25]. Actualmente, se necesitan más experimentos para determinar si microARN-126 está asociado con no microcítico de pulmón de células riesgo de cáncer y el pronóstico. En este estudio, se explora el papel de microARN-126 en el CPNM y demostrar que es un gen supresor de tumores y su nivel de expresión se correlaciona con una mala supervivencia en pacientes con CPNM.
Resultados
MicroRNA- 126 Inhibe la invasión celular y el crecimiento tumoral ensayo
Se realizó un ensayo de invasión de células en el A549 y células SK-MES-1 con vector de pE-Mir126 o pE-CMV vector de transfección. En comparación con el grupo control, la sobre expresión de microARN-126 deteriorado la invasión de células, que se consistió con los informes anteriores (Figura 1A). La proliferación celular se redujo en un 47,91% (
P = 0,0006
) y 36,36% (
P = 0,0018
), respectivamente, cuando las células A549 y SK-MES-1 fueron tratados respectivamente con microARN-126 sobre-expresión durante 72 horas (Figura 1B). Para explorar más a fondo el efecto de microARN-126 sobre el crecimiento tumoral, se investigó la capacidad de los microARN-126 para suprimir el crecimiento tumoral
in vivo fotos: por inyección intratumoral de PE-Mir126 vector en A549 y SK-MES-1 xenoinjertos modelos de ratones desnudos. Como se muestra en la Figura 1C, se observó el crecimiento de los tumores de 1 a 25 días después de la última inyección. El peso medio de los tumores en los ratones tratados con pE-Mir126 vector en día 25 después de la última inyección fue de sólo alrededor de una media del peso del tumor en los ratones tratados con PBS solo o pE-CMV vector solo (Figura 1D). Todo el crecimiento de tumores en los ratones tratados con IP-Mir126 vector se suprimió significativamente en comparación con los de los ratones tratados con PBS y se trataron PE-Mir126 vectorial.
(A) overe-Xpression de microARN-126 inhibe la invasión celular en A549 y las células SK-MES-1. En comparación con el grupo control, la sobre expresión de microARN-126 la invasión de células mermada. (B) microARN-126 impide la proliferación celular en células A549 y SK-MES-1. La proliferación celular se redujo drásticamente después de las células se trataron con microRNA-126 sobre-expresión durante 72 horas. (C) La curva de crecimiento del tumor
in vivo fotos: por inyección intratumoral con microARN-126. Se observó el crecimiento de los tumores de 1 a 25 días después de la última inyección. (D) El microARN-126 inhibe el crecimiento de células A549 y células SK-MES-1 in vivo. El tumor promedio de sólo alrededor de una mitad del peso de los tumores en los ratones tratados con PBS o PE-CMV vector solo.
microARN-126 inhibe la proliferación de células tumorales, aunque PI3K-Akt en el CPNM
para explorar el mecanismo molecular de microARN-126 efecto antiproliferativo en CPNM, se utilizaron dos programas de acceso abierto (TargetScan y miRBase) para predecir los objetivos de microARN-126. Los sitios de unión previsto en el 3'UTR de
PIK3R2
para microRNA-126 se muestran en la Figura 2A. El ensayo indicador de luciferasa indicó que la actividad del reportero que contiene la UTR 3 'de
PIK3R2
gen se disminuyó después de la co-transfección con pE-Mir126 vector (100.67 ± 4.51 ± 5.86 vs.31.33,
P & lt ;
0,0001), mientras que la actividad de la mutagénesis dirigida al sitio del reportero que contiene la UTR 3 'de
PIK3R2
gen no era obviamente alterado (104,00 ± 8,54 vs 98,33 ± 10,12,
P
= 0,484) (Figura 2B). Además, el análisis de transferencia Western reveló que la expresión de PIK3R2 se vio afectada por el tratamiento con PE-Mir126 vector en el A549 (0,97 ± 0,14 ± 0,07 vs.0.31, P = 0,002) y SK-MES-1 células (0,94 ± 0,13 vs. 0,45 ± 0,08,
P
= 0,005) (Figura 2C). Además, la transfección de pE-Mir126 vector en lugar de vector pE-CMV reprimió significativamente la fosforilación de Akt, sin cambiar los niveles de expresión de la proteína Akt total de (células A549, 0,89 ± 0,10 ± 0,04 vs.0.41, P = 0,002. Células SK-MES-1 0,88 ± 0,08 ± 0,05 vs.0.47
P
= 0,002) (Figura 2C).
(a) putativos microARN-126 focalización sitio en el 3'UTR de PIK3R2. La mutación fue generada en la secuencia 3'UTR del PIK3R2 en el sitio complementario para la región semilla de microARN-126 como se indica. (B) microARN-126 sitio de unión en el 3'UTR de PIK3R2 se evaluó mediante el ensayo indicador de luciferasa. La actividad de luciferasa se detectó mediante un luminómetro después de la co-transfección durante 48 horas. La actividad de luciferasa de cada muestra se normalizó a la actividad de luciferasa de Renilla. (C) El microARN-126 suprime la expresión PIK3R2 y la fosforilación de Akt en células A549 y SK-MES-1. La proteína total fue aislado de las células tratadas con vector pE-Mir126 o vector pE-CMV durante 48 horas. expresión PIK3R2 y la fosforilación de Akt se analizaron por transferencia Western usando el anticuerpo a P85β y fosfo-Akt (Ser473). (D) Los niveles de expresión PIK3R2 y la fosforilación de Akt en los tejidos de NSCLC. Barra de escala, 10 micras. a. La tinción inmunohistoquímica de control negativo de PIK3R2 en el tejido NSCLC. segundo. Inmunohistoquímico control negativo tinción de p-Akt (Ser473) en el tejido NSCLC. do. La tinción inmunohistoquímica de PIK3R2 en el tejido CPNM con bajos niveles de expresión de microARN-126. re. La tinción inmunohistoquímica de p-Akt (Ser473) en el tejido CPNM con bajos niveles de expresión de microARN-126. mi. La tinción inmunohistoquímica de PIK3R2 en el tejido CPNM con altos niveles de expresión de microARN-126. F. La tinción inmunohistoquímica de p-Akt (Ser473) en el tejido CPNM con altos microARN-126 niveles de expresión. (E) Los niveles de expresión de PIK3R2 y la fosforilación de Akt en los tejidos de NSCLC inversamente correlacionados con los microARN-126 niveles de expresión (PIK3R2, Spearman r = -0,276,
P & lt; 0,0001
, Akt, Spearman r = -0,164,
P = 0,0013
). (F) El tratamiento con Akt-MYR dio lugar a un rescate estadísticamente significativa de la proliferación de células A549 y SK-MES-1 por transfección con pE-Mir126 vectorial. La proteína total fue aislado de las células tratadas con Akt-myr, vector pE-Mir126 o controles respectivos durante 48 horas. la fosforilación de Akt se analizó mediante transferencia Western utilizando el anticuerpo de fosfo-Akt (Ser473). Después las células se transfectaron con Akt-MYR, vector PE-Mir126 o controles respectivos durante 72 horas en placas de 96 pocillos, las tasas de proliferación celular se determinó por el ensayo MTT.
Para evaluar más a fondo la relación entre microARN-126 y
PIK3R2 Hoteles en CPNM, detectamos los niveles de expresión de microARN-126, PIK3R2 y la fosforilación de Akt en 381 muestras clínicas por PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR) e inmunocitoquímica (IHC), respectivamente. Los niveles de expresión de PIK3R2 y Akt fosforilación en los tejidos tumorales inversamente correlacionados con los microARN-126 niveles de expresión (PIK3R2, Spearman r = -0,276,
P Hotel & lt; 0,0001, Akt, Spearman r = -0,164,
P = 0,0013
, Figura 2D & amp; e y Tabla 1). Los resultados mostrados en la Figura 2F demostraron que el tratamiento con la recuperación de la actividad de Akt dio como resultado la inhibición estadísticamente significativa de la proliferación en las células A549 y células SK-MES-1 por transfección con pE-Mir126 vector (
P
& lt; 0,0001) .
los niveles de microARN-126 expresión se correlacionan con escasa supervivencia en células no pequeñas cáncer de pulmón los pacientes
en comparación con el inmortalizada bronquial NL20 epitelial, microRNA-126 niveles de expresión se redujeron, obviamente, en líneas celulares de cáncer, tales como A549, H358, H1703, H460 y SK-MES-1 (Figura 3A). El nivel de expresión de microARN-126 también se examinó en una cohorte consta de 168 pares de tejidos tumorales de NSCLC y tejidos cancerosos adyacentes emparejados (Figura 3B). Su nivel de expresión fue mucho menor en los tejidos tumorales que en los tejidos no cancerosos (0,905 ± 0.171vs.0.683 ± 0,308,
P & lt; 0,0001
).
(A) los niveles de expresión de microARN -126 están disminuidos en líneas celulares de cáncer. La expresión de microARN-126 fue examinado por cuantitativa en tiempo real PCR en líneas celulares de NL20 y líneas celulares de cáncer. (B) Los niveles de expresión de microARN-126 se reducen en muestras de NSCLC humano. La expresión de microARN-126 se determinó por cuantitativa en tiempo real PCR en los tejidos tumorales y tejidos del pulmón adyacente de pacientes emparejados. En comparación con los correspondientes tejidos pulmonares adyacentes, microARN-126 expresión fue notablemente las reguladas en los tejidos tumorales (
P Hotel & lt; 0,0001). (C) bajo la expresión de microARN-126 se correlaciona con una pobre supervivencia de los pacientes con CPNM. Los pacientes fueron divididos en dos grupos en función de sus microARN-126 niveles de expresión: los que tienen menos de media de microARN-126 niveles de expresión y los que tienen más de o igual a la mediana de microARN-126 niveles de expresión (mediana: 0,654). Los pacientes con baja expresión de microARN-126 tuvieron significativamente pobre tiempo de supervivencia en comparación con aquellos con una alta expresión de microARN-126 (medios para el tiempo de supervivencia (meses): 24.392 ± 1.055 vs 1.140 ± 29.282,
P
= 0,005) .
Como se muestra en la Tabla 2, se encontró que los niveles de expresión de microARN-126 no se correlacionó con el sexo, edad, tipo histológico, o la etapa de tumor en la cohorte de 442 casos de NSCLC . Los pacientes fueron divididos en dos grupos en función de sus microARN-126 niveles de expresión: los que tienen menos de media de microARN-126 niveles de expresión y los que tienen más de o igual a la mediana de microARN-126 niveles de expresión (mediana: 0,654). Sin embargo, el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier reveló que los pacientes con bajo nivel de expresión de microARN-126 tenían tiempos de supervivencia significativamente pobres en comparación con aquellos con un alto nivel de expresión de microARN-126 (medios para el tiempo de supervivencia (meses): 24.392 ± 1.055 vs 1.140 ± 29.282 ,
P
= 0,005) (Figura 3C). El análisis de regresión de riesgos proporcionales de Cox multivariado mostró también que los bajos niveles de expresión de microARN-126 eran un factor pronóstico (razón de riesgo, 0,782; IC del 95%, 0,647 0,945) significativamente desfavorable. (Tabla 3)
variante genética dentro de microARN-126 no está asociado con el riesgo de cáncer y de supervivencia en pacientes con CPNM
Hemos secuenciado los segmentos de ADN genómico, incluyendo el pre-miR-126 y sus respectivas regiones flanqueantes (± 200 pb) en 442 pacientes con CPNM y 543 controles emparejados. Tres SNPs, incluyendo rs78242242, rs1140713 rs4636297and, se verificaron en los segmentos. En el presente estudio, rs78242242 y rs1140713 no se analizaron estadísticamente debido a la frecuencia muy baja (datos no mostrados). La distribución de los genotipos del SNP (G & gt; A, rs4636297) en los controles se concedió al equilibrio de Hardy-Weinberg (
P
= 0,336), y no había ninguna diferencia general en las distribuciones genotípicas entre los casos y los controles (Tabla 4). las estimaciones de supervivencia de Kaplan-Meier mostraron que no hubo asociación entre rs4636297 y el tiempo de supervivencia en pacientes con CPNM (
P = 0,992
) (Figura 4A). El análisis de regresión de riesgos proporcionales de Cox multivariado mostró también que rs4636297 no se asoció con la supervivencia global de los pacientes con CPNM (razón de riesgo, 0,995; IC del 95%, 0,836-1,184) (Tabla 3). También se evaluó si el polimorfismo rs4636297 se asoció con la expresión de microARN-126 en el CPNM y los resultados mostraron que no hubo diferencias significativas entre los tres grupos de genotipos (
P = 0,972
) (Figura 4B).
(A) variante genética dentro de microARN-126 no está asociado con tiempos de supervivencia. las estimaciones de supervivencia de Kaplan-Meier muestran que no existe una asociación entre el SNP rs4636297 y el tiempo de supervivencia en pacientes con CPNM (
P = 0,992
). (SEGUNDO). Los niveles de expresión de microARN-126 en los tejidos de NSCLC de tres genotipos son similares. la expresión de microARN-126 se determinó por cuantitativa en tiempo real PCR. No hubo diferencias significativas entre los tres grupos de genotipos (
P = 0,972
).
Discusión
En los últimos años, se ha identificado que la expresiones aberrantes de microRNAs juegan un papel importante en la formación y el desarrollo [26] tumor - [28]. En la tumorigénesis, los niveles de expresión de algunos microRNAs están disminuidos en los tejidos de cáncer. Estos tipos de microRNAs son considerados como genes supresores de tumores. microRNAs supresores de tumores por lo general impiden la oncogénesis al regular negativamente oncogenes o genes que controlan la proliferación celular, la diferenciación, la migración y la apoptosis [29], [30]. En la actualidad, el microARN-126 nivel de expresión disminuye notablemente en varios tejidos tumorales, incluyendo NSCLC, cáncer de colon, cáncer de mama y cáncer gástrico [16] - [22], [31]. Por lo tanto, microRNA-126 se considera como genes supresores de tumores.
Nuestros datos muestran que la sobre expresión de microARN-126 proliferación de células NSCLC deteriorado y el crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjertos de ratones desnudos. En general se acepta que miRNAs ejercen su función mediante la regulación negativa de la expresión de sus genes diana aguas abajo. La activación de los resultados de la vía PI3K en el crecimiento celular y la supervivencia, lo que contribuye al crecimiento del tumor, metástasis y resistencia a la terapia en NSCLC [32]. Varios estudios han indicado que la vía PI3K-Akt juega un papel oncogénico central en la inducción de la proliferación celular y el desarrollo de tumores [33], [34]. Por consiguiente, esta vía es una diana atractiva para los agentes contra el cáncer. Basado en el análisis bioinformático de los objetivos de predicción de microARN-126, el
fue seleccionado PIK3R2
gen de los posibles objetivos de microARN-126. En este estudio, se encontró que los
PIK3R2
gen era un objetivo directo de microARN-126. Además, microRNA-126 expresión en ambas líneas celulares de NSCLC y tejidos tumorales marcadamente disminuyó en comparación con las células y tejidos no cancerosos. Nuestra aslo datos mostraron que la sobre expresión de microARN-126 proliferación de células NSCLC deteriorado y el crecimiento tumoral en xenoinjertos A549 modelo de ratones desnudos, aunque la regulación de la vía de señalización de PI3K-Akt. Estos datos sugirieron que la pérdida de expresión de microARN-126 puede implicar el desarrollo y progresión del NSCLC. De acuerdo con estos hallazgos anteriores [22], nuestros resultados también mostraron que los niveles de expresión de la expresión de microARN-126 se correlacionan con una pobre supervivencia en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas.
Las variantes genéticas en microARN precursor (pre-miARN) o genes miARN sitios objetivo se han demostrado estar asociados con el riesgo de diversos tipos de cáncer. Algunos estudios muestran que los SNPs en pre-miRNAs jugaron un papel importante en la predicción de la supervivencia y la susceptibilidad [35] NSCLC, [36]. Por ejemplo, los homocigotos variantes miR-196a2 tenían una relación de 1,76 veces elevado de riesgo (HR) para una supervivencia global desfavorable de NSCLC [36]. Sin embargo, no hay polimorfismos se encuentran en los sitios de unión previstos en el 3'UTR de PIK3R2 para microRNA-126. Así se realizó el análisis de asociación genética para estudiar el potencial asociación de SNPs dentro de microARN-126 con la supervivencia y la susceptibilidad del NSCLC. En el presente estudio, se encontró que las frecuencias alélicas y genotípicas del microARN-126 (G & gt; A, rs4636297 SNP) no se asociaron con el riesgo y la supervivencia global del NSCLC. En el informe anterior, la asociación entre el rs4636297 y el riesgo de cáncer de mama no se ha encontrado [37]. Un estudio reciente demuestra que el genotipo rs4636297GG significativamente bloquea el procesamiento de pri-miARN de pre-miARN, lo que resulta en el microARN-126 expresión madura reducido significativamente [38]. Del mismo modo, en comparación con la de tipo salvaje alelo G, la variante A de rs4636297 no tiene efecto sobre la estructura secundaria de sí mismo pre-miR-126, sino que afecta a la estructura secundaria de la región flanqueante. Mientras tanto, la energía libre? G se incrementa en el Una variante alelo [37]. Sin embargo, el nivel de microARN-126 había ninguna diferencia significativa entre los tres grupos de genotipos en nuestra cohorte de 442 casos de NSCLC. Los resultados indican que los gremlins variantes en el microARN-126 no tienen impacto en el nivel micro ARN de los tejidos tumorales en pacientes con CPNM. Aunque un estudio identificó que Ets-1 y Ets-2 pueden regular la expresión de microARN-126 por la orientación de un elemento de unión Ets en regiones genómicas aguas arriba de la microRNA-126 y
EGFL7
gen en las células endoteliales [39] , son necesarios más estudios para determinar si el mecanismo anterior implica en la regulación a la baja de los microARN-126 en el CPNM.
en resumen, nuestros datos indican que el microARN-126 es un gen supresor de tumores en el CPNM y baja la expresión de microARN-126 es un factor pronóstico significativamente desfavorable en pacientes con CPNM. Sin embargo, las variantes genéticas de microRNA-126 no están asociados con el riesgo de NSCLC y pronóstico. Además, el mecanismo de regulación de microRNA-126 que queda por esclarecer en diferentes tejidos normales y malignos. Por lo tanto, se necesita más investigación para explorar las funciones supresoras de tumores de microARN-126 en el CPNM.
Materiales y Métodos
Cell Culture, Población de estudio y muestras quirúrgicas
A549, H358, H1703, H460 y SK-MES-1 líneas de NSCLC humanos, una línea celular humana normal epitelial bronquial (NL-20), se obtuvieron de la American Type Culture Collection. muestras de NSCLC humanos eran de 442 pacientes en el hospital de Chengdu General de Ejército y el Hospital Popular Provincial de Sichuan de 2008 y de 2010. De 442 muestras, 76 fueron obtenidas por biopsia de 43 casos de estadio IV y 33 casos de fase III, y el resto obtenidas por cirugía. Hay 168 tejidos pulmonares cancerosos adyacentes en los 442 especímenes. La etapa de un CPNM se basa en el Comité Conjunto sobre el Cáncer (AJCC) sistema TNM. controles sin cáncer eran de una cohorte de 543 individuos que no tenían antecedentes de cáncer y se adapta a los casos en edad y sexo. Este estudio fue aprobado por el Consejo de Sichuan Academia de Ciencias Médicas & amp Revisión Institucional; Hospital de Sichuan Provincial Popular, Segundo Hospital de la Universidad de West China, la Universidad de Sichuan, Chengdu y el Hospital General de Ejército. El consentimiento informado firmado se obtuvo de todos los participantes o de los representantes de los pacientes si no se pudo obtener el consentimiento directo. Ninguno de los pacientes había recibido ningún tipo de tratamiento para el cáncer de pulmón antes de la cirugía. Los participantes del estudio se sometieron a una entrevista personal para obtener información sobre las características demográficas y los factores de estilo de vida, tales como el consumo de tabaco.
La extracción de RNA y PCR en tiempo real cuantitativa
El ARN total fue extraído por medio de reactivo TRIzol. Se utilizó el ARN total (100 ng) de cada muestra para la síntesis de ADNc usando cebadores de transcripción inversa para microRNA-126 y U6 ARN pequeño nuclear. cuantitativa en tiempo real PCR se realizó utilizando el SYBR Premezcla Ex Taq ™ (Takara Biotech Co.). qPCR Primer Conjunto de microARN-126 (Cat.no.MQP-0101) y U6 pequeños ARN nucleares (Cat.no.MQP-0201) eran de Ribobio Co. microARN-126 y U6 pequeños ARN nucleares se cuantificaron respectivamente, de acuerdo con la curva patrón y realizado por triplicado. U6 pequeños ARN nucleares se utilizó para la normalización. La expresión relativa se calculó utilizando la ecuación:. Copias (miR-126) /copias (U6)
invasión celular Ensayo
Una cámara de cultivo celular Transwell (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) se recubrió con Matrigel, se secaron y se reconstituyeron con medio de cultivo a 37 ° C. Las células se dividieron en tres grupos: el grupo de control, el grupo de pE-CMV y el grupo PE-Mir126. Las células transfectadas con pE-CMV o pE-Mir126 se mueren de inanición en medio libre de suero y se suspendieron a 1 × 10
6 /ml en medio RMPI1640 durante 24 horas antes del ensayo. 300 l de suspensión de células se colocaron en la cámara superior y se dejaron migrar durante 24 horas a 37 ° C. Se retiraron los medios de comunicación en suspensión en la cámara inferior. Las células que habían invadido el lado inferior del filtro se fijaron en paraformaldehído al 4% y se tiñeron con solución de Gimsa. El número de células que pasa a través de los poros en la cámara inferior se contó con un microscopio de contraste de fase.
Ensayos de proliferación de células
Las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos en RMPI1640 con un 10% FBS y 100 g /ml de penicilina /estreptomicina durante 72 horas. las tasas de proliferación de células se determinó por el ensayo de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT).
construcciones de vectores
El fragmento de 398 pb de longitud que contiene 3'UTR de
PIK3R2
se amplificó por PCR y se clonó en PMD-18T vector (Takara) usando los siguientes cebadores: adelante, 5'-ACTAGTTGCAGATTCAGGGCTTCTCT -3 ', e inverso, 5' -3 AAGCTTCCTGTATGACCTTGGGCACT '. A continuación, el fragmento se subclonó en los sitios Spe I y Hind III aguas abajo del gen de la luciferasa en el plásmido PMIR-INFORME (Ambion) para generar el plásmido pMIR- PIK3R2-WT. Usando pMIR- PIK3R2-INFORME plásmido WT como plantilla, pMIR- PIK3R2-INFORME plásmido MT, lo que lleva a la mutado
PIK3R2
secuencia 3'-UTR en el sitio complementario para la región semilla de microARN-126, fue generada por una KOD -Plus-Mutagénesis Kit (Toyobo, Japón) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se utilizaron los siguientes cebadores: adelante, 5'-TGCCATGCTTGTTATTGATATGATATAAAACATC -3 ', revertir, 5'-ACAAAACCTGCCTCCCAGCTCGTGGGGC -3'. Todas las construcciones fueron confirmadas por secuenciación.
informador de luciferasa Ensayo del gen
A549 células fueron cultivadas en placas de 96 pocillos y cotransfectadas con pMIR- PIK3R2-INFORME plásmido WT (o pMIR- PIK3R2-INFORME MT plásmido) y pE-Mir126 vector (GeneSil Biotecnología Co., Ltd, china) usando lipofectamina 2000. luciérnaga y Renilla luciferase actividades se midieron 48 horas después de la transfección utilizando el kit Dual Luciferase reportero de ensayo (Promega, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los ensayos se realizaron por duplicado y se repitieron tres veces.
Western Blot
Las células se lisaron usando tampón RIPA. La proteína total (20 g) se ha ejecutado en 12% SDS-PAGE y posteriormente se transfirió a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF). La membrana se bloqueó en solución salina tamponada con tris-Tween-20 (TBS-T) con 3% de BSA durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, se incubaron con los anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C y seguido por incubación con los anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante una hora a temperatura ambiente. Las bandas inmunorreactivas se identificaron utilizando SuperSingal Pico sustrato quimioluminiscente al oeste y se expusieron a películas de rayos-X.
inmunocitoquímica
La tinción inmunohistoquímica se realizó en secciones de 5 mm de tejidos con CPNM incluidos en parafina para determinar la expresión de PIK3R2 y Akt fosforilación. Brevemente, para el bloqueo de la peroxidasa endógena, los portaobjetos se incubaron durante 10 min con 3% de H
2O
2, se lavó con PBS durante 5 minutos, y luego durante 30 minutos con 3% de suero de cabra en PBS. Los portaobjetos se incubaron en PIK3R2 y (Ser473) anticuerpo fosfo-Akt (1:250, tecnología de señalización celular) durante la noche a 4 ° C. Las etapas posteriores se realizaron utilizando Sistemas de Envision ™ (Dako). Las intensidades de tinción se puntúan y representados como sigue: Puntuación 0: muestras completamente negativos; Puntuación 1: muestras con hasta 10% de células positivas; Puntuación 2: muestras con 11 a 50% de células positivas; Puntuación 3:. Las muestras con un 50% de células positivas
Desnudo ratón modelo de xenoinjerto
hembra Balb /c nu /nu (4-5 semanas de edad) fueron adquiridos de Instituto de animales de experimentación, Sichuan Academia Provincial de Ciencias médicas (Chengdu, china). células A549 (1 × 10
6) se suspendieron en 100 l de PBS y se inyectaron por vía subcutánea en la región de flanco derecho de ratones desnudos. Después de 10 días, los tumores alcanzaron 5-10 mm de diámetro, y los ratones se dividieron aleatoriamente en tres grupos (5 ratones por grupo), los animales recibieron inyecciones intratumorales de vector pE-Mir126, vector pE-CMV o PBS, respectivamente, para cuatro veces en los días 1, 3, 5 y 7, con la dosis total de 3 × 10 unidades
10 plaqueforming (pfu) por tumor. dimensiones del tumor se midieron 2 veces cada 5 días por una pinza lineal. El volumen del tumor (mm
3) se calculó según la siguiente fórmula: longitud x anchura
2/2. Todos los ratones fueron sacrificados humanitariamente el trigésimo día después del tratamiento, y se pesaron los tumores resecados.
Genotipado
rs2297882 variante se genotipo por secuenciación. El microARN-126, incluyendo pre-miRNAs fueron amplificados por PCR, los siguientes cebadores se utilizaron para amplificar el producto: adelante, 5'-ATTGCCGTGTGGCTGTTAG-3 '; revertir, 5'-CATTGCACTGTCCACTCCTG -3 '. Los productos de PCR fueron secuenciados en ambas direcciones en un analizador genético ABI3130xl (Applied Biosystems, EE.UU.). Los cebadores para PCR también fueron utilizados como cebadores de secuenciación.
Análisis de las Estadísticas
El nivel de microARN-126 en diferentes grupos se evaluó mediante la prueba de la t. Las asociaciones entre el riesgo de CPNM y genotipos SNP se estimaron mediante análisis de regresión logística multivariable. La supervivencia se calculó a partir de la fecha del diagnóstico inicial a la fecha de la muerte o el último seguimiento. Supervivencias fueron analizados utilizando el método de Kaplan-Meier, y las diferencias en la distribución se evaluaron mediante la prueba de log-rank.