Extracto
Antecedentes
La mortalidad es significativamente mayor en los pacientes sépticos con cáncer que en los pacientes sépticos sin antecedentes de cáncer. Hemos descrito previamente un modelo de cáncer de páncreas seguido de sepsis por
Pseudomonas aeruginosa
neumonía en los que los ratones con cáncer séptica tienen mayor mortalidad que los ratones sépticos previamente sanos, asociado con un aumento de la apoptosis del epitelio intestinal y la disminución de la apoptosis de las células T. El propósito de este estudio fue determinar si esto representa una respuesta del huésped común mediante la creación de un nuevo modelo en el que tanto el tipo de cáncer y el modelo de sepsis se alteran.
Métodos
C57Bl /6 ratones recibieron una inyección de 250.000 células de la línea de cáncer de pulmón LLC-1 en su muslo derecho y se siguieron tres semanas para el desarrollo de tumores palpables. Los ratones con cáncer y sin cáncer de ratones fueron sometidos a ligadura y punción cecal y se sacrificaron 24 horas después de la aparición de sepsis o seguido de 7 días para la supervivencia.
Resultados
Cáncer ratones sépticos tuvo un mayor la mortalidad de los ratones previamente sano séptico (60% vs. 18%, p = 0,003). ratones sépticos cáncer había disminuido el número y la frecuencia de las células CD4 + linfocitos del bazo secundaria a un aumento de la apoptosis y sin cambios en CD8 + esplénica números. proliferación intestinal también se redujo en ratones sépticos cáncer. ratones sépticos cáncer había una carga bacteriana más alta en la cavidad peritoneal, pero esto no se asoció con alteraciones en citoquinas local, neutrófilos o respuestas de las células dendríticas. los ratones del cáncer séptica tenía evidencia bioquímica de la función renal empeoró, pero no había evidencia histológica de la lesión renal.
Conclusiones
Los animales con cáncer tienen una mortalidad significativamente mayor que los animales previamente sanos siguientes sepsis. Los mecanismos potenciales asociados con esta elevada mortalidad difieren en función significativa en el modelo de cáncer y sepsis utilizado. Mientras que la apoptosis de linfocitos y la integridad intestinal se alteran tanto por la combinación de cáncer y sepsis, los patrones de estas alteraciones varían mucho dependiendo de los modelos utilizados
Visto:. Lyons JD, Mittal R, Fay KT, Chen CW, Liang Z, Margoles LM, et al. (2016) murina de cáncer de pulmón aumenta CD4 + T apoptosis de las células y disminuye la capacidad proliferativa Gut en la sepsis. PLoS ONE 11 (3): e0149069. doi: 10.1371 /journal.pone.0149069
Editor: Philip Alexander Efron, Universidad de Florida, Estados Unidos |
Recibido: 26 Agosto, 2015; Aceptado: 27 de enero de 2016; Publicado: 28 Marzo 2016
Derechos de Autor © 2016 Lyons et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos nacionales de Salud (GM104323, GM095442, GM072808, GM109779, GM113228). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: Dra. Coopersmith es el presidente de la Sociedad de Medicina de Cuidados Críticos. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
La sepsis es la principal causa de muerte entre los pacientes críticamente enfermos en los Estados Unidos con entre 230.000 y 370.000 personas mueren de la enfermedad cada año [1]. Los pacientes con tumores malignos son casi diez veces más probabilidades de desarrollar sepsis que la población general [2], y el cáncer representa la comorbilidad más frecuente en pacientes sépticos [3-5]. La sepsis es también la principal causa de ingreso en la UCI en pacientes con cáncer [6,7]. Es importante destacar que el cáncer también es el co-morbilidad asociada con un mayor riesgo de muerte en la sepsis, con la mortalidad hospitalaria superior a 50% en pacientes con cáncer y, o bien la sepsis grave o shock séptico [5,7-9].
la etiología detrás del aumento de la mortalidad observada en los pacientes con cáncer que desarrollan sepsis en comparación con los pacientes previamente sanos que desarrollan sepsis es multifactorial [2,10]. Mientras que algunas muertes están relacionadas con la inmunosupresión causada por el tratamiento del cáncer, como la quimioterapia o la radiación, otros están probablemente relacionados con una disminución de la capacidad del huésped para responder adecuadamente a las infecciones en el ámbito de los cambios sistémicos crónicos relacionados con la malignidad subyacente. Los modelos animales de cáncer, de forma aislada, demuestran que no sólo es el microambiente tumoral alterado, pero que el agotamiento de células T sistémica y la supresión inmune generalizada también son inducidas por el cáncer [11]. Además, la respuesta del huésped a una infección no letal se altera marcadamente cáncer siguiente, con agotamiento fenotípica en las células T asociados con el aumento de expresión de los receptores co-inhibitoria [12].
Existen numerosas similitudes en la respuesta del huésped para el cáncer y sepsis [13]. En un intento de entender por qué los anfitriones con cáncer han aumentado la mortalidad después de la sepsis en comparación con los anfitriones previamente sanos, hemos descrito un modelo de cáncer de páncreas seguido de sepsis por
Pseudomonas aeruginosa
neumonía [14]. La mortalidad fue mayor en los ratones séptico cáncer que los ratones previamente sanos y esto se asoció con una disminución en la apoptosis de linfocitos T y un aumento tanto en el intestino apoptosis epitelial y bacteremia. Curiosamente, la prevención de la apoptosis de los linfocitos-una estrategia asociada con uniforme éxito en otros modelos pre-clínicos de sepsis se asocia con una mayor mortalidad en ratones sépticos cáncer [15].
A pesar de tener una mayor comprensión de la fisiopatología de la sepsis que nunca [16-18], ha habido una incapacidad notable para traducir modelos preclínicos de sepsis en tratamientos eficaces en la cabecera, donde la administración es generalmente de apoyo todavía no selectivo, con la excepción de la terapia antimicrobiana específica [19]. Una de las razones (de muchos) por el fracaso de los ensayos preclínicos a traducirse en terapias eficaces para la sepsis es que los estudios en animales se llevan a cabo en una población homogénea previamente sano, mientras que los estudios en humanos se realizan en pacientes heterogéneos con frecuencia con múltiples comorbilidades. Como tal, hemos tratado de determinar si nuestros hallazgos preclínicos anteriores en el cáncer y sepsis serían generalizables si alteramos tanto el tipo de cáncer y el modelo de sepsis. Para examinar esto, hemos desarrollado un nuevo modelo clínicamente relevante de cáncer de pulmón, seguido de la sepsis inducida por la ligadura y punción cecal.
Materiales y Métodos
Animales
Varón y hembra C57BL /6 ratones fueron utilizados en todos los experimentos, con coincidencia de género entre los grupos experimentales y de control. Los animales fueron de 6-8 semanas de edad antes de la iniciación de los experimentos. Un subconjunto de los animales fueron inyectados con células tumorales (detalles a continuación) y todos los ratones fueron luego observó durante tres semanas adicionales antes de que un subconjunto fueron sometidos a ligadura cecal y punción (CLP, también se detalla a continuación) momento en el que se observaron durante 1 -7 días dependiendo de si se utilizaron para la supervivencia o no de supervivencia experimentos. Así, los animales eran un mínimo de 9 semanas de edad y un máximo de 12 semanas de edad en el momento del sacrificio. Los experimentos se realizaron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud directrices para el uso de animales de laboratorio y fueron aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad de Emory (Protocolo DAR-2001875-082815BN). Todos los animales fueron alojados en una instalación para animales universidad aprobada y se les dio acceso libre a comida y agua a lo largo. Los animales que fueron inyectados con células tumorales fueron monitoreados para asegurar que los tumores no se ulceran y no impiden la deambulación animales de acuerdo con las directrices del IACUC Emory para la carga tumoral. Después de CLP, todos los animales recibieron la buprenorfina después de la operación en un intento de minimizar el sufrimiento animal. Para los estudios no supervivencia, los animales fueron sacrificados 24 horas después de la operación a través de asfixia por CO2 o desangrado bajo anestesia profunda ketamina. Un subconjunto diferente de los animales fue seguida por la supervivencia durante 7 días después de la operación. Durante este experimento de supervivencia, los animales se comprobaron dos veces al día. Además de la observación de los mismos criterios de valoración descritos anteriormente que rodea el crecimiento del tumor, también se revisaron los animales para determinar si estaban moribundos relacionada con la operación. Los animales, que cumplieron criterios de valoración de tumores o estaban moribundos se sacrificaron usando puntos finales. Los animales moribundos se identifican como sigue: a) las complicaciones quirúrgicas que no responden a la intervención inmediata (dehiscencia de la herida, sangrado, infección), b) las condiciones médicas que no responden al tratamiento, tales como la automutilación, dificultad respiratoria grave, ictericia, insuficiencia orgánica grave o diarrea intratable, o c) los signos clínicos o de comportamiento que no responden a la intervención apropiada que persiste durante 1 día, incluyendo la inactividad significativa, dificultad para respirar, ojos hundidos, postura encorvada, piloerección /pelaje enmarañado, una o más úlceras en la piel unresolving y vocalización anormal cuando se maneja. Los animales que sobrevivieron 7 días después de la operación se sacrificaron a la conclusión de este experimento utilizando asfixia por CO2.
Cáncer modelo
Una línea celular de carcinoma de pulmón murino (LLC1, American Type Culture Collection, Manassas , VA) se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%, 1% de glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina y 1% 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico. La justificación del uso de una línea celular de cáncer de pulmón es el cáncer de pulmón que tiene la segunda más alta de mortalidad por tumores sólidos en pacientes sépticos (2) (cáncer de páncreas es la más alta y se utilizó para nuestros experimentos anteriores en la sepsis y el cáncer). Después de la expansión, las células cancerosas se disociaron de los matraces de crecimiento a través de la incubación con 0,25% de tripsina, se lavaron, se centrifugaron durante 10 minutos a 1.500 RPM y luego se resuspendieron en solución tamponada con fosfato (PBS) a una concentración final de 250.000 células por 0,2 ml (live celdas seleccionadas a través de un examen de azul de tripano). Los ratones asignados al azar para recibir el cáncer tenía una única inyección subcutánea de 250.000 células tumorales a lo largo de la cara interna del muslo derecho (grupo cáncer) y fueron seguidos durante 3 semanas antes de la CLP para permitir el crecimiento del tumor. Los ratones de control fueron no manipulada y por lo tanto no tenía ninguna intervención previa a CLP (grupo previamente sano), pero fueron vistos por un tiempo idéntico al de los ratones con cáncer para que los animales serían de edad equivalente.
modelo de sepsis y grupos experimentales
un subconjunto de los ratones con cáncer y ratones previamente sanos fueron sometidos a CLP, un modelo establecido de peritonitis polimicrobianas [20]. En resumen, bajo anestesia con isoflurano, se hizo una incisión abdominal en la línea media pequeña, y el ciego se exteriorizó y se ligó debajo de la válvula ileocecal, evitando la obstrucción intestinal. El ciego fue pinchado dos veces con una aguja de calibre 25 y apretó suavemente para extruir una pequeña cantidad de heces. Después de colocar el ciego hacia atrás en el abdomen, la pared abdominal se cerró en capas. Inmediatamente después de CLP, los ratones recibieron inyecciones subcutáneas de a) fluidos (1 ml de 0,9% de solución salina) para dar cuenta de las pérdidas insensibles, b) antibióticos (50 mg /kg de ceftriaxona, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO y 35 mg /kg metronidazol, Apotex Corp, Weston, FL) para imitar el escenario clínico en pacientes sépticos reciben terapia antimicrobiana y c) medicamentos para el dolor (0,1 mg /kg Buprenex, McKesson médica, San Francisco, CA) para minimizar el dolor y el sufrimiento. Animales bien se siguieron los 7 días de supervivencia o sacrificados a las 24 horas para la recogida de muestras. Los antibióticos fueron re-dosificados a 12, 24 y 36 horas después de la cirugía en los estudios de supervivencia.
Hemos publicado previamente una extensa evaluación inmunológica de cáncer de pulmón en ratones no manipulados [11], así que no repetir esos estudios. Sin embargo, no hemos tenido previamente datos sobre muchos de los resultados ensayados en este estudio y los experimentos de modo realizados en ambos sépticos y no sépticos animales en su caso, con el fin de comprender el impacto del cáncer en el aislamiento, la sepsis de forma aislada, y la combinación de cáncer y sepsis. La siguiente es la terminología utilizada para cada grupo experimental: a) no manipulada (ratones que recibieron ni cáncer ni sepsis), b) cáncer (los ratones que recibieron inyección de células tumorales por sí solo), c) sépticos previamente sano (ratones sometidos a CLP solo sin previo intervención), y d) séptico cáncer (ratones con inyección de células tumorales después de tres semanas más tarde por CLP).
leucocitos análisis
análisis de citometría de flujo fenotípica de leucocitos se realizó en las suspensiones celulares transformados de esplenocitos (bazos enteros removidos en el momento del sacrificio) o líquido peritoneal (2,5 ml de PBS inyectado en el peritoneo y se retira después de 5 segundos de agitación suave). El número de células por ml de la suspensión se calculó utilizando un Nexcelom Auto Cellometer, los resultados de los cuales se utiliza para determinar el número de células absolutos. Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para teñir las células antes del análisis: para el fluido peritoneal, anti-GR1.1 FITC (BD Bioscience, San José, CA), anti-CD11b PerCP (BioLegend, San Diego, CA), anti-CD11c PeCy7 ( eBioscience, San Diego, CA), y anti-MHC II APC Cy7 (eBioscience); para el fenotipado de esplenocitos, anti-F4 /80 PerCP (BioLegend), anti-CD11c PeCy7 (eBioscience), anti-CD11b APC (eBioscience), anti-B220 Alexa700 (BD Bioscience), y anti-MHC II APC Cy7 (eBioscience).
para determinar la frecuencia de linfocitos apoptóticos, los esplenocitos se recogieron de los animales sacrificados y procesados a una suspensión de 1x10
7cells /ml y 1x10
6 esplenocitos fueron procesadas utilizando un comercialmente disponible Anexina V y el kit de 7-AAD (BioLegend) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células fueron teñidas con anti-CD4-PO (Invitrogen, Carlsbad, CA), anti-CD8-PB (eBioscience) para determinar la frecuencia de células T CD4 y CD8 pro-apoptóticos. Una estrategia gating excluidos células muertas de la tinción positiva para la 7-AAD del análisis.
Para las muestras sometidas a tinción intracelular de citoquinas, 1x 10
6 esplenocitos se sembraron en una placa de 96 pocillos. Las células se suspendieron y se incubaron en RPMI 1640 medio de cultivo y se estimularon durante cuatro horas utilizando forbol 12-miristato 13-acetato (30 ng /ml) e ionomicina (400 ng /ml) con 10μg /ml de Brefeldina A a 37 ° C. Después de la estimulación, las células se tiñeron con anti-CD4 PacBlue (BD Bioscience), anti-CD8 PacOrange (Life Technologies Carlsbad, CA), anti-IL-2 FITC (BD Bioscience), anti-IL-4 PE (eBioscience), anti-CD44 PerCP (BioLegend), anti-CCR4 PeCy7 (BioLegend), anti-CXCR3 APC (eBioscience) y anti-IFN Alexa700 (BD Bioscience). Un flujo LSR II citómetro (BD Biosciences) se utilizó para ejecutar todas las muestras y software FlowJo 10.0.8r1 (árbol de la estrella, San Carlos, CA) se utilizó para analizar todos los datos.
La permeabilidad intestinal
a las 19 horas siguientes CLP, los ratones fueron gavaged con 0,5 ml de isotiocianato-dextrano (FD4) a una concentración de 22 mg /ml en PBS (Sigma-Aldrich) fluoresceína [21,22]. Plasma recogido en el momento del sacrificio luego 5 horas después se diluyó con un volumen igual de PBS, y la concentración se determinó por FD4 flourospectrometry con longitudes de onda de excitación /emisión de 485/520 nm con una curva patrón de diluciones en serie (BioTex Synergy HT, Winooski, VT).
proliferación intestinal
la proliferación de las células epiteliales intestinales se tiñeron con 5-Bromo-2'deoxyuridine (BrdU). A los 90 minutos antes de su sacrificio, los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de BrdU (5 mg /ml en solución salina al 0,9%, Sigma-Aldrich) para marcar las células en fase S [23,24]. a continuación, el tejido yeyunal se fijó en formalina al 10% durante 24 horas antes de ser incluidas en parafina y deslizable montada en las secciones 5μm. Las láminas fueron entonces deparaffinized, rehidratada, y se incubaron en peróxido de hidrógeno al 1% durante 15 minutos antes de ser calentada en una olla a presión en decloaker antígeno (Biocare médico, Concord, CA) durante 45 minutos. bloque de la proteína (Dako, Carpinteria, CA) se realizó durante 30 minutos a temperatura ambiente y portaobjetos se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos monoclonales de rata anti-BrdU (1: 500; exactas Químicas y Ciencia, Westbury, Nueva Jersey). Las muestras se incubaron después con anticuerpo de cabra anti-rata (1: 500; Accurate Chemical & amp; Scientific) y peroxidasa de rábano picante estreptavidina (1: 500; Dako), cada uno durante una hora a temperatura ambiente. Diaminobencidina (DAB) se utilizó para desarrollar los portaobjetos durante 2-3 minutos, y se realizó contratinción con hematoxilina. BrdU de células positivas se cuantificaron en 100 criptas intestinales contiguos, bien orientadas
Intestinal apoptosis
La apoptosis de las células epiteliales intestinales se cuantificó utilizando dos técnicas complementarias:. activa la caspasa-3 tinción morfológica y análisis de secciones teñidas con hematoxilina-eosina [25,26]. Las secciones se tratan como anteriormente con decloaker antígeno y luego se bloquearon con 20% de suero normal de cabra (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Los portaobjetos se incubaron durante la noche a 4 ° C con conejo anti-caspasa-3 (1: 100; Cell Signaling, Beverly, MA), y luego con anticuerpo de cabra anti-conejo anticuerpo biotinilado (1: 500; Vector Laboratories) y peroxidasa de estreptavidina de rábano picante ( 1: 500; Dako) durante una hora cada uno a temperatura ambiente. Los portaobjetos se desarrolló con DAB y counterstained. Caspasa-3 células positivas fueron contados en 100 criptas intestinales contiguos.
fueron identificados en las secciones de hematoxilina-eosina mediante la identificación de los cambios morfológicos característicos, incluyendo la contracción celular con núcleos condensados y fragmentados y su cuantificación en 100 criptas contiguos Las células apoptóticas .
longitud de vellosidades
de vellosidades longitud se midió como la distancia en cm desde el cuello hasta la punta cripta de vellosidades en 12 vellosidades del yeyuno bien orientado consecutiva con Nikon elementos de imagen por software EIS-Elementos BR 3,10 (Nikon Instruments, Melville, NY).
Los cultivos bacterianos
Los cultivos cuantitativos de sangre entera y líquido peritoneal se prepararon a partir de serie de 10 diluciones de muestras en solución salina estéril al 0,9%. Una parte alícuota de 100 l de muestra no diluida y de cada dilución de 10
-1 a 10
-3 se sembró en placas de agar sangre (Remel, Lenexa, KS) y se incubaron a 35 ° C en un 5% de CO
2 ambiente durante 24 horas. Los recuentos de colonias se obtuvieron de placas que contienen menos de 300 colonias. El número de unidades formadoras de colonias (UFC) por ml de muestra original se determina multiplicando el número de colonias por el recíproco de la dilución se contaron y ajustado por el volumen de muestra plateado.
citoquinas
La sangre entera, el lavado broncoalveolar y líquido peritoneal de fluido (BAL) y después se centrifugaron a 10.000 rpm durante 10 minutos. Después se recogió y se analizó la concentración de citocinas mediante una matriz de 6 complejo de citoquinas de cuentas del sobrenadante de cada uno según las instrucciones del fabricante (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
La función renal
Total la sangre se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos. a continuación, la creatinina en suero se midió usando un ensayo de creatinina de microplacas (Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, MI), mientras que se determinó nitrógeno ureico en sangre (BUN) utilizando un kit de detección colorimétrica urea nitrógeno (Arbor ensayos, Ann Arbor, MI). riñones enteros se extrajeron y se fijaron en formalina al 10% durante 24 horas antes de la fijación de parafina y seccionamiento. Después de la tinción de hematoxilina-eosina, secciones fueron evaluados por lesiones por un patólogo cegado a la identidad de la muestra (ABF). los pesos de los animales se midieron en el momento de CLP e inmediatamente antes del sacrificio para evaluar la pérdida de peso potencial debido a la deshidratación.
La lesión hepática
lesión del hígado fue evaluada por ambas enzimas hepáticas en suero y la histología. La alanina aminotransferasa (ALT) se midió en una química AU480 autoanalizador Beckman (Beckman Diagnostics, La Brea, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Además, las partes de todo el hígado se retiraron y se fijaron en formalina al 10% durante 24 horas antes de la inclusión en parafina. Las secciones fueron montadas deslice y se tiñeron con hematoxilina-eosina para su análisis por un patólogo (ABF) cegados a la identidad de la muestra.
pulmón lesiones
Para el análisis histológico, los pulmones de los animales estaban rojas con 1 ml de formalina al 10%, y las secciones se retiraron a continuación y se fijaron en formalina al 10% durante 24 horas antes de ser incluidos en parafina. Pulmón secciones fueron teñidas con hematoxilina-eosina y examinados por un patólogo (ABF) cegados a la identidad de la muestra.
La mieloperoxidasa actividad (MPO) se evaluó también en el fluido BAL. La tráquea se irrigó con 1 ml de PBS, y después el fluido se retiró y se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos. se añadió tampón sustrato que contiene 0,0005% de peróxido de hidrógeno y O-dianisidina al sobrenadante, y la actividad de MPO se ensayó más de 6 minutos en longitud de onda de 460 (BioTek Synergy HT, Winooski, VT). actividad MPO se calculó como la densidad óptica /minuto por l de fluido BAL.
pulmón concentración de proteína del fluido se midió mediante el análisis de las muestras tratadas con el reactivo de ensayo de proteínas (Thermo Scientific, Rockford, IL) a 660 nm en combinación con una curva estándar de albúmina de suero bovino.
recuentos sanguíneos completos
sangre recogidas en el momento del sacrificio se recogió en tubos de sangre anti-coagulantes forrado y se analizó la concentración de hemoglobina, recuento de leucocitos, y recuento de plaquetas en un Heska HemaTrue
® analizador de hematología veterinaria por las instrucciones del fabricante (HESKA, Loveland, CO).
Estadísticas
se analizaron todos los datos mediante el programa de software estadístico Prism 6.0 (GraphPad , San Diego, CA) y se presentan como media ± SEM. Los datos fueron probados para la distribución gaussiana con la prueba de normalidad, todos D'Agostino-Pearson. Dos comparaciones -way sobre los datos con una distribución de Gauss se realizaron mediante la prueba t de Student. De dos vías comparaciones de datos que no tienen una distribución de Gauss se realizaron con la prueba de Mann-Whitney. comparaciones múltiples grupos se analizaron mediante ANOVA de una vía, seguido por el post-test de Tukey. La supervivencia se analizó mediante la prueba de log-rank. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa a lo largo
Resultados
Ratones
que recibieron inyecciones subcutáneas de células de cáncer de pulmón murino desarrollados tumores solitarios bien circunscritas en el sitio de la inyección de tres. semana más tarde (tamaño medio de 1,5 cm de diámetro). revisión post-mortem de la histología pulmonar demostró enfermedad metastásica microscópica en algunos animales, a pesar de que no se propague tumor macroscópico se observó en todos los animales en el momento del sacrificio.
La presencia de cáncer de pulmón preexistente empeora la mortalidad después de la sepsis
mortalidad de siete días fue del 18% en ratones sépticos previamente sanos. Por el contrario, la mortalidad de siete días fue del 60% en el cáncer de ratones séptico (figura 1).
ratones previamente sanos y los que recibieron una inyección de células LLC1 tres semanas antes (n = 15-17 /grupo) fueron sometidos a CLP. ratones sépticos tuvo cáncer de mortalidad significativamente mayor que los ratones séptico previamente sanos (p = 0,003).
La presencia de cáncer de pulmón preexistente disminuye los linfocitos CD4 +, pero no los linfocitos CD8 + después de la sepsis
ratones séptico cáncer había una disminución en la frecuencia y números absolutos de CD4 + linfocitos del bazo en comparación con ratones séptico previamente sano (Fig 2A y 2B). Además, los ratones séptico cáncer tenía una mayor frecuencia de anexina-positivo tinción CD4 + linfocitos en comparación con ratones sépticos previamente sanos, sugiriendo aumento de la apoptosis fue el responsable de la pérdida de células CD4 + (Figura 2C y 2D). Por el contrario, mientras que la frecuencia de esplénicas linfocitos CD8 + fue mayor en los ratones séptico cáncer (Fig 3A), esto era probablemente debido a la disminución de las células CD4 +, ya que no se observaron diferencias en los números de CD8 + de células (Figura 3B) o tinción de anexina (Fig 3C y 3D) entre los ratones sépticos cáncer y ratones sépticos previamente sanas. expresión de células CD4 + de la CXCR3 marcador Th1 se incrementó en ratones séptico cáncer (Fig 4A y 4C), mientras que la expresión de la CCR4 marcador Th2 no fue diferente entre los ratones previamente sanos sépticos y ratones séptico cáncer (Fig 4B y 4C). la producción estimulada de Th1 efector de citocinas IFN-γ por las células T CD4 + no se vio afectado por el cáncer (Figura 4D, 4F y 4G) mientras que la producción de la Th2 efector IL-4 fue significativamente menor en los ratones sépticos cáncer (Figura 4E, 4F y 4G) .
cáncer ratones sépticos tuvo una frecuencia significativamente menor de células T CD4 + como un porcentaje del total de células T CD3 + (a, p = 0,02, n = 7-9), así como una disminución en el número total de células T CD4 + (B, p = 0,03, n = 8-10) en comparación con ratones sépticos previamente sanas. Esto se asoció con un aumento en las células T CD4 + de anexina-positivas en ratones séptico cáncer (C, p = 0,04, n = 7-8). Un representante de la citometría de flujo histograma demuestra el aumento de la tinción de anexina en séptica cáncer (azul) las células T CD4 + en comparación con séptico previamente sano (rojo) las células T CD4 + (D).
Cáncer ratones sépticos tuvo una frecuencia significativamente mayor de las células T CD8 + como un porcentaje del total de células T CD3 + (a, p = 0,007, n = 8-10). Sin embargo, no hubo cambio estadísticamente significativo en el número total de células CD8 + (B, p = 0,10, n = 8-10) o anexina-positivas las células T CD8 + (C, p = 0,31, n = 7-10) lo que sugiere el cambio en el porcentaje de células CD8 + estaba relacionada con la disminución de las células CD4 +. Un representante de la citometría de flujo histograma demuestra ninguna diferencia en la tinción de anexina en séptica cáncer (azul) y séptico previamente sano (rojo) las células T CD8 + (D).
Ratones sépticos
Cáncer tuvo un modesto aumento en T CD4 + la expresión de células de la Th1 marcador CXCR3 (a, p = 0,01, n = 9-10), pero no tienen un cambio estadísticamente significativo en la expresión de la CCR4 Th2 marcador (B, p = 0,21, n = 9-10). Una parcela de citometría de flujo representativo para ambos marcadores se incluye (C). la producción estimulada de IFN-γ no fue estadísticamente diferente en las células T CD4 + de ratones séptico cáncer (D, p = 0,17, n = 9-10); sin embargo, estimuló la producción de IL-4 fue menor en las células T CD4 + de ratones cáncer séptico (E, p = 0,006, n = 9-10). un resultado representativo citometría de parcelas para tanto no estimulada y estimulada IFN-γ e IL-4 se muestran para los ratones previamente sano séptico (F) y los ratones del cáncer séptico (G).
La presencia de pre-existente de pulmón cáncer disminuye la capacidad para eliminar la infección
peritoneal carga bacteriana local fue mayor en los ratones sépticos cáncer que los ratones séptico previamente sano (figura 5A). Esto no se asoció con cambios en la interleucina -1β (IL), IL-6, IL-10, IL-13, MCP-1, TNF-α, o IFN-γ en el líquido peritoneal (Fig 5B-5H). El líquido peritoneal también contenía un porcentaje similar de los neutrófilos (figura 6A) y células dendríticas (Figura 6B) entre los ratones sépticos previamente sanos y ratones sépticos cáncer. la activación de células dendríticas como se determina por la expresión de MHC II en las células de fluido peritoneal también fue similar entre los grupos (figura 6C). la frecuencia de células dendríticas del bazo y la activación también se vieron afectados por la presencia de cáncer (Fig 6D y 6E). No hubo diferencias en los números absolutos de neutrófilos o células dendríticas (datos no mostrados).
Ratones séptico
Cáncer tenían niveles más altos de bacterias en sus cavidades peritoneales que los ratones séptico previamente sano (A, p = 0,005, n = 8-9). Este cambio no se asoció con diferencias en la concentración de peritoneal IL-1β (p = 0,32), IL-6 (p = 0,18), IL-10 (p = 0,52), IL-13 (p = 0,97), MCP-1 (p = 0,67), el TNF-α (p = 0,40), IFN-γ o (p = 0,27) (BH, n = 8 para todos los grupos).
cáncer ratones sépticos y previamente sana ratones sépticos tuvo frecuencias similares de neutrófilos (a, p = 0,52, n = /grupo 7) y células dendríticas (B, p = 0,52, n = 7 /grupo) en el líquido peritoneal, y no hubo diferencia en la frecuencia de la expresión de MHC II de células dendríticas entre los dos grupos (C, p = 0,52, n = 7 /grupo). ratones sépticos cáncer y ratones sépticos previamente sanas también tenían frecuencias similares de células dendríticas (D, p = 0,73, n = 9-10) y se activan las células dendríticas (E, p = 0,83, n = 9-10) en esplenocitos.
citocinas en suero fueron similares entre los ratones sépticos cáncer y ratones sépticos previamente sanos excepto por un aumento de la MCP-1 en ratones séptico cáncer (Fig 7). No hay diferencia en la carga bacteriana se identificó en cultivos de sangre cuantitativos entre los ratones sépticos previamente sanos y ratones séptico cáncer (datos no mostrados).
No se observaron diferencias significativas en la IL-1β (p = 0,10), IL-6 (p = 0,63), IL-10 (p = 0,24), IL-13 (p = 0,07), o TNF-α (p = 0,99) (BF, n = 7-8 /grupo). Por el contrario, el aumento se detectó MCP-1 en el suero de los ratones con cáncer séptico en comparación con ratones previamente sano séptico (E, p = 0,04, n = 7-8).
La presencia de pre- cáncer de pulmón existente disminuye la proliferación cripta, pero no altera otros componentes de la integridad intestinal siguientes sepsis
cáncer en aislamiento disminuye la proliferación cripta comparación con los ratones no manipulados. Sepsis en forma aislada también disminuye la proliferación de la cripta en comparación con ratones no manipulados. La combinación de cáncer y sepsis provoca una disminución desproporcionadamente mayor en la proliferación de las criptas en comparación con sepsis solo como ratones sépticos cáncer tienen más baja que la proliferación de ratones séptico previamente sano (figura 8A-8C).
ratones séptico previamente sanos (A) tenían niveles cualitativamente superiores de la proliferación que los ratones del cáncer séptico (B, BrdU-positivas células de las criptas mancha marrón). Cuantitativamente, tanto el cáncer en el aislamiento y la sepsis en la proliferación aislamiento disminución crypt (C, p = 0,02 y 0,008 respectivamente, en comparación con los ratones no manipulado). La combinación de cáncer y sepsis disminuyó aún más la proliferación intestinal, moreso que se observó con ninguna de las variables de forma aislada (p & lt; 0,001 séptico previamente sano vs. séptico cáncer, n = 8 a 10 para todos los grupos en el panel C). Por el contrario, mientras que la longitud de las vellosidades se redujo en sepsis (pero no cáncer) de forma aislada (p = 0,008), no hubo diferencia en la longitud de las vellosidades entre séptico previamente sano y ratones séptico cáncer (D, p & gt; 0,99, n = 8-9 para todos los grupos).
por el contrario, la longitud de las vellosidades no se ve afectada por el cáncer de forma aislada, se redujo como se ha mostrado previamente por sepsis (26), pero no es diferente entre los ratones sépticos previamente sanos y ratones sépticos cáncer (Fig 8D). El cáncer y sepsis también no afecta la permeabilidad intestinal o apoptosis cripta en comparación con sepsis sola (datos no mostrados).
La presencia de cáncer de pulmón preexistente empeora la función renal bioquímica sin causar lesión hepática siguiente sepsis
ni el cáncer ni la sepsis en el aislamiento afecta la función renal, niveles de BUN y Cr fueron similares en no manipulado, el cáncer y los ratones sépticos previamente sanos. En contraste, tanto BUN y Cr fueron mayores en los ratones séptico cáncer (Fig 9A y 9B); sin embargo riñones aparecieron groseramente normalmente histológicamente (datos no mostrados).