Extracto
En respuesta a la irradiación ionizante y ciertos agentes quimioterapéuticos, muriendo las células tumorales inducen un potente anticancerígeno respuesta inmune. Sin embargo, el efecto potencial de wogonina (5,7-dihidroxi-8-metoxiflavona) sobre la inmunogenicidad de cáncer no se ha estudiado. Aquí hemos demostrado por primera vez que wogonina provoca un efecto inmunidad antitumoral potente induciendo la translocación de la calreticulina (CRT) y anexina A1 a la celda de membrana de plasma, así como la liberación de la proteína alta movilidad de grupo 1 (HMGB1) y ATP. Se estudiaron las vías de señales implicados en este proceso. Se encontró que las especies de oxígeno reactivas wogonina inducida (ROS) producción provoca un retículo endoplásmico (ER) de respuesta al estrés, incluyendo la fosforilación de PERK (PKR-como retículo endoplasmático quinasa) /PKR (proteína quinasa R) y eIF2α (factor de iniciación eucariótico 2α ), que sirve como señal de corriente arriba de la activación de fosfoinosítido 3-quinasa (PI3K) /AKT, induciendo calreticulina (CRT) /anexina A1 membrana celular translocación. P22 /CHP, un Ca
2 + -la proteína de unión, se asoció con la CRT y se requiere para la TRC translocación a la membrana celular. Las liberaciones de HMGB1 y el ATP de wogonin células tratadas MFC, solo o junto con otros factores posibles, activan las células dendríticas y los comunicados de citoquinas inducidas. Estudio in vivo confirmó que la inmunización con células tumorales wogonin pretratados con la vacunación de crecimiento significativamente inhibido tumor gástrico homoplastia injertado en ratones y una posible respuesta inflamatoria estaba involucrado. En conclusión, la activación de la vía PI3K provocada por el estrés ER inducida CRT /translocación anexina A1 y la liberación de HMGB1 (señal "cómeme"), la mediación de la inmunidad inducida por wogonin de la vacuna de células tumorales. Esto indicó que wogonina es una novela candidato eficaz de la inmunoterapia contra el tumor gástrico
Visto:. Yang Y, Li X-J, Chen Z, Zhu X-X, Wang J, Zhang L-b, et al. (2012) wogonin inducida Calreticulin /anexina A1 Exposición Dicta la inmunogenicidad de las células cancerosas en un beneficio /AKT manera dependiente. PLoS ONE 7 (12): e50811. doi: 10.1371 /journal.pone.0050811
Editor: Marc Tjwa, Universidad de Frankfurt - Hospital de la Universidad de Frankfurt, Alemania |
Recibido: 20 de enero de 2011; Aceptado: 29 de octubre de 2012; Publicado: December 12, 2012
Derechos de Autor © 2012 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nos. 91129731 y 81072661), el Programa de Proyectos de Laboratorio Estatal de Medicamentos Naturales, Universidad Farmacéutica de China (Nº JKGZ201102) el nuevo siglo excelente programa de talentos para el Dr. Yong Yang con el apoyo de Ministerio de Educación de China (NCET-09-0771), los Fondos de investigación Fundamental para las Universidades central (Nº JKZ2009006), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jiangsu (núm BK2012025 y BK2011632), y "Major Drug Discovery" la ciencia y la grandes proyectos de tecnología de china (Nº 2011ZX09102-001-20). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los métodos tradicionales de tratamiento del cáncer incluyen cirugía, radioterapia, quimioterapia, y para algunos tipos de cáncer, la terapia hormonal. Aunque los beneficios se obtienen por muchos pacientes, rara vez son curativo para las muy pocas células tumorales diseminadas residuales, la principal causa de muerte entre los pacientes con cáncer. Una razón importante por la que los tumores no son controlados por el sistema inmune es que la baja inmunogenicidad. El uso de vacunas contra el cáncer para provocar una respuesta inmune antitumoral terapéutica contra antígenos tumorales juiciosamente elegidos expresadas en las células tumorales puede buscar y destruir las células tumorales diseminadas. Una posible estrategia para lograr esto implica la inmunización con células tumorales que han sido tratadas con una clase particular de fármacos quimioterapéuticos.
La acumulación de pruebas indica que varios agentes quimioterapéuticos (incluyendo antraciclinas y oxaliplatino), y la irradiación ionizante (tales como γ rayos gamma y ultravioleta C (UVC) de luz) inducen la muerte de las células cancerosas inmunogénica [1], [2]. Se sugirió que tienen la capacidad para conducir calreticulin translocación (CRT) a la superficie de células tumorales, que actúa como una señal de "yo comer", se identifica por las células dendríticas (DC), lo que resulta en la respuesta de células T antitumorales [3]. Los elementos de la vía de la mediación de la exposición CRT pre-apoptóticos implican un conjunto de tubos de imagen que transitó el aparato de Golgi y secretadas por exocitosis SNARE dependiente [4].
HMGB1 (grupo de proteínas de alta movilidad 1), una nuclear proteína que se libera de la muerte celular, es el ligando del receptor de tipo Toll 4 (TLR4) [1]. El agotamiento de HMGB1 de las células tumorales mueren suprime la, presentación TLR4 dependiente mediada por DC de antígenos de la muerte las células tumorales in vitro e in vivo [1]. Así, la liberación de HMGB1 es necesario para la inmunogenicidad de la muerte celular a través de su efecto sobre TLR4. Sin embargo, ni HMGB1 ni CRT (ni una combinación de ambos) pueden promover DCs completa maduración, lo que indica que la búsqueda de moléculas inmunes-estimuladoras producidos por las células que mueren debe continuarse [5].
wogonina (5,7 beta-dihidroxi-8-metoxiflavona), un componente activo aislado de
Scutellaria baicalensis
radix, se informó que tienen actividades significativas contra el cáncer mediante la inducción de la diferenciación celular, la apoptosis y la detención del ciclo celular [6] - [8]. En este estudio, hemos probado si wogonin, al igual que algunos medicamentos quimioterapéuticos mencionados anteriormente, es capaz de inducir la muerte de células cancerosas inmunogénica, y si es así, se evaluaron las posibles vías de señalización implicadas en este proceso. Hemos encontrado por primera vez que wogonina provoca un efecto inmunidad antitumoral potente induciendo la translocación de la CRT y la anexina A1 a la celda de membrana de plasma, así como la liberación de HMGB1 y ATP. Se encontró que el retículo endoplasmático (ER) la respuesta al estrés, incluyendo PERK (PKR-como retículo quinasa endoplásmico) /PKR (proteína quinasa R) y eIF2α (factor de iniciación eucariota 2α subunidad) fosforilación y la posterior activación de la vía de señalización /AKT PI3K se involucran en este proceso.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
todos los animales se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos, y todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Federación Europea de directrices de la Asociación de Ciencia Animal de laboratorio. El Comité de Ética de la Universidad de China Farmacéutica aprobó todos los experimentos con animales (Los números de permiso: SYXK2007-0025).
Productos químicos y reactivos
wogonin se aplicó en DMSO a 10 mM y se almacenó a -20 ° DO. La doxorrubicina, rapamicina, LY294002, un inhibidor de AKT X (Aktí) se adquirieron de Calbiochem (San Diego, CA). EGFR, ERK1 /2, AKT1 /2, Ku 80, de cabra anti-IgG de conejo-HRP y el anticuerpo anti-IgG de ratón-HRP de cabra se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). N-acetil-cisteína (NAC) y el ratón monoclonal anti-β-actina se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO). p-PERK (Thr980), gratificación, p-eIF2-α (Ser51), eIF2-α, p-PKR (Thr446 /451), PKR, p-AKT (Ser 473), p-AKT (Thr 308), anexina A1, p-S6K (Thr389), p-4E-BP1 (Ser 65), S6K, 4E-BP1, p-GSK3 (Ser 9), p-S6 (S235 /236), p-ERK (Thr202 /Tyr204) , p-JNK (Thr183 /Tyr185) y p-p38 (Thr 180 /Tyr182) anticuerpos fueron adquiridos de Señalización celular Tecnología (Bevery, MA).
células de cultivo
primaria monocitos de ratón cultivadas -derivado células dendríticas (moDCs) eran de B6 ratones médula ósea, mantenido en un medio MEM (Sigma, St. Louis, MO) suplementado con un 10% de FBS más GM-CSF (50 ng /ml). Para el análisis de transferencia de Western, las células se volvieron a sembrar en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 × 10
5 células /ml con medio de cultivo completo fresco. El carcinoma gástrico humano MKN-45 células, las células MFC carcinoma gástrico ratón derivados de 615 ratones (Militar de Ciencias Médicas, Beijing), WT y AKT1 /2 Double Knockout MEFs (adquirido de banco de células de Shanghai, Academia de Ciencias de China, Shanghai, China) se mantuvieron en un medio DMEM (Sigma, St. Louis, MO), complementado con un 10% de suero bovino fetal (Invitrogen, Carlsbad, CA), penicilina /estreptomicina (1:100, Sigma, St. Louis, MO) y 4 mM L-glutamina (Sigma, St. Louis, MO), en una de CO
2 incubadora a 37 ° C.
bidimensional electroforesis en gel y la identificación de proteínas mediante espectrometría de masas
los métodos se refieren al estudio anterior [9]. Brevemente, enfoque isoeléctrico (IEF) se realizó en un Ettan IPGphor II (Amersham Bioscience) con 24 cm tiras de gradiente de pH inmovilizados (pH 3 a 10; Amersham Bioscience). Geles (tres repeticiones de cada uno) fueron de acuerdo con los procedimientos publicados manchados de plata y digitalizadas mediante un escaneo Atrix 1.010 más (Microtek, Taiwán, China), y las imágenes resultantes se analizaron mediante el software ImageMaster 2D Platinum (Amersham Bioscience) para la detección de puntos, cuantificación y análisis comparativos y estadísticos. manchas detectadas y cuatro puntos de control de las zonas de gel nonstained fueron extirpados (aproximadamente 1 mm
3 cubos) de los geles teñidos con Coomassie Brilliant Blue. Preparación de muestras para láser asistida por matriz de desorción /ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF).
Doble o Triple-Label inmunofluorescencia microscopía confocal de
MFC células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% y procesada para inmunofluorescencia, como se describe anteriormente [10], salvo que Cy5, se utilizaron isothiocyanate- y /o tetrametilrodamina B anticuerpos secundarios marcado con isotiocianato de fluoresceína (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Luego, las células se lavaron brevemente en PBS y se montaron en portaobjetos de vidrio mediante el uso de prolongar kit antifade reactivo de montaje (Molecular Probes). Las células se visualizaron con un microscopio Axiovert S100 invertido (Carl Zeiss) acoplado a una unidad de CARV confocal (Atto Bioscience, Rockville, MD) y la fuente de luz de vapor de Hg. Las imágenes fueron recolectados a través de la versión de software 3.0.9 Openlab (Improvisación, Lexington, MA) con una cámara digital ORCA-ER (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City, Japón) y conjuntos de filtros de isotiocianato de fluoresceína (484 nm), tetrametilrodamina isotiocianato B (555 nm ) y Cy5 (650). El análisis de imagen confocal de imágenes se realizó utilizando Adobe Photoshop 5.5. Para permitir la comparación de intensidad, se usan condiciones similares para recoger y manipular imágenes dentro de cada experimento.
transferencias de Western
Como se mencionó anteriormente [11], 30 g de proteína de cada tratamientos indicados se separó mediante 10% electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Bedford, MA). Después de bloquear con 10% de leche durante 30 minutos, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C seguido de incubación con anticuerpos secundarios durante 1 hora a temperatura ambiente. Unión de los anticuerpos se detectó con el sistema de detección de quimioluminiscencia potenciada (ECL). Western blots resultados se cuantificaron por un software Image J.
biotinilación de proteínas de superficie celular MFC
biotinilación y la recuperación de las proteínas de la superficie celular se realizaron con un método adaptado de la referencia [1]. Brevemente, 15 × 10
se colocaron 6 MFC células en hielo y se lavaron tres veces con PBS helado-Ca
2 + Mg
2 + (PBS con 0,1 mM CaCl
2 y 1 mM MgCl
2). Las proteínas de membrana fueron entonces biotinilados de una incubación de 30 min a 4 ° C con NHS-SS-biotina 1,5 mg /ml (Pierce) recién diluido en tampón de biotinilación (trietanolamina 10 mM, CaCl 2 mM, NaCl mM
2 150, pH 7,5) con agitación suave. células MFC se enjuagaron con PBS-Ca
2 + Mg
2 + + glicina (100 mM) y se lavan en este tampón durante 20 min a 4 ° C para inactivar la biotina sin reaccionar. Después las células se lavaron dos veces con PBS-Ca
2 + Mg
2 +, raspado en PBS frío, y se sedimentaron a 3000 rpm a 4 ° C. Los sedimentos se solubilizaron durante 45 minutos en 600 l de tampón de lisis (1% Triton X-100, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Tris 50 mM, pH 7,5) que contiene inhibidores de la proteasa. Los lisados se clarificaron por centrifugación a 14.000 xg durante 10 min a 4 ° C, y los sobrenadantes se incubaron durante la noche con perlas de estreptavidina-agarosa empaquetadas para recuperar proteínas biotiniladas. Las perlas se sedimentaron por centrifugación, y se tomaron alícuotas de los sobrenadantes para representar la piscina no unido, intracelular de proteínas. proteínas biotiniladas se eluyeron de las perlas por calentamiento a 100 ° C durante 5 min en tampón de muestra SDS-PAGE antes de cargar en un gel de SDS-PAGE 10%. Para asegurar la ausencia de fugas de biotina en las células, se verificó sistemáticamente la ausencia de la proteína actina intracelular en los extractos con biotina.
inmunoprecipitación (IP)
Como se mencionó anteriormente [11], las células tratadas con los estímulos apropiados se lisaron con tampón de lisis, NaCl 200 mM (pH 7,4), 1% de Triton X-100, 10% de glicerol, EDTA 0,3 mM, Na3VO4 0,2 mM, y cócteles de inhibidores de la proteasa (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) . Partes alícuotas de 600 g de proteínas de cada muestra se precleared por incubación con 20 l de proteína A /G Sepharose (perlas) (Amersham, IL) durante 1 hora a 4 ° C. muestras precleared se incubaron con anti-Calreticulin (CRT) de anticuerpos (cs-2891, Cell Signaling Tech), o anti-DNA-PKcs (sc-9051, los anticuerpos de Santa Cruz) en tampón de lisis durante la noche a 4 ° C. se añadieron 30 l de perlas de proteína A /G y las muestras se incubaron durante 2 horas a 4 ° C. Las perlas se lavaron cinco veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y una vez con tampón de lisis, cocidos, separados por 10% SDS-PAGE, y se transfirieron a una membrana de PVDF, seguido por análisis de transferencia Western como se describe anteriormente.
CRT-confocal inmune-fluorescencia
cáncer células con tratamiento indicado se fijaron y se bloquearon con 10% de BSA en PBS durante 30 min a temperatura ambiente y después se incubaron con anti-conejo 1:100 calreticulina (CRT) de anticuerpos ( cs-2891, Cell Signaling Tech) durante 1 h (prueba de CRT translocación) seguido de FITC-anti-anticuerpo secundario de conejo (Cell Signaling Tech, MA) a 1:100 durante 30 min y CRT inmune-fluorescencia se observó en un microscopio de confocal (Leica TCS SMD FCS, Leica, Alemania), Hoechst 33342 se utiliza para teñir la nuclear.
pequeños ARN de interferencia (siRNA) desmontables estudios
Como se ha descrito antes [11], siRNA para PERK (sc-36214), DNA-PKcs (sc-35200) o p22 (sc-142 330) se adquirió de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Las células cancerosas se cultivaron en un medio completo que no contenía antibióticos durante 4 días. Las células se sembraron en una placa de 1 día de 6 pocillos antes de la transfección y se cultivaron a 60% de confluencia el día siguiente. Para los experimentos de ARNi, 6,25 l de Lipofectamine ™ LTX juntos se diluyó 2,5 l de reactivo PLUS ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) en 90 l de DMEM durante 5 min a temperatura ambiente. A continuación, 10 l de siRNA (20 mM) se mezcló con DMEM que contenía Lipofectamine PLUS junto con reactivo y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente durante la formación del complejo. Finalmente, se añadió el complejo a los pocillos que contenían medio de 2 ml con una concentración de 100 nM final siRNA. P22 (ab56953, Abcam) o PERK expresión de la proteína (sc-13073, Santa Cruz) se determinó mediante Western blot de 48 horas después de la transfección.
especies reactivas del oxígeno (ROS) de detección
Como se ha descrito antes [11], las células cancerosas fueron pre-cargado con 1 M de colorante fluorescente dihidrorrodamina (DHR) (Invitrogen, Carlsbad, CA) dos horas antes de los tratamientos indicados, que reaccionan con ROS en las células y da como resultado un cambio de fluorescencia. Después de ser tratado con los tratamientos indicados, se tripsinizaron las células cancerosas, se suspendieron en PBS enfriado en hielo y se fijaron en alcohol etílico al 70% en -20 ° C. Los cambios en la fluorescencia en las células tratadas con fármaco se cuantificaron por análisis de FACS. La inducción de la generación de ROS se expresó en unidades arbitrarias. la producción de ROS se detectó también mediante la visualización de fluorescencia dihidrorrodamina (DHR) bajo microscopía confocal de fluorescencia inmunológico.
La medición de los niveles de ATP extracelular
síntesis de ATP se midió en las células MFC en el tratamiento de diversas wogonin. En sextuplicates, 5 × 10
3 Se cultivaron las células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Después de incubación a 37 ° C durante 24 h, se midió la cantidad de ATP en el sobrenadante usando el kit de determinación de ATP Molecular Probes '(Kaiji, Nanjing) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este kit se basa en la detección de la bioluminiscencia de ATP, usando luciferasa de luciérnaga recombinante y su sustrato, luciferina. quimioluminiscencia total se recogió mediante un luminómetro. La cantidad de ATP a partir de una solución de ensayo se cuantificó por comparación con una curva de calibración usando ATP como el estándar
citoquinas Cuantificación
células de cáncer de MFC fueron tratados con tratamientos indicados para 36 horas.; muestras de sobrenadante fueron recogidos y evaluados por la HMGB1 utilizando kits de ELISA (Ensayo Shino-Corporation, ST51011) de acuerdo con su protocolo. Para la liberación de citoquinas, moDCs fueron tratados con sobrenadante de células MFC durante 24 horas, el sobrenadante de moDCs se recogieron y se evaluó para la IL-6 (Mouse IL-6 ELISA Kit, BD OptEIA, 550950) y TNF-α (Mouse TNF-a ELISA Kit, BD OptEIA, 560478) de acuerdo con sus protocolos.
In vivo experimento de vacunación de células anti-tumor
3 × 10
6 MFC células, suspendidas en 200 ml de PBS, ya sea izquierda no tratada o tratada con wogonina (100 mM) durante 4 h. Wogonina células tratadas MFC se inocularon subcutáneamente en el flanco inferior de 6 semanas de edad, hembra 615 ratones (Militar Ciencias Médicas, Pekín), mientras que 5 × 10
5 células no tratadas fueron inoculadas en el flanco contralateral 7 días más tarde como se describe en estudio anterior [1].
La fagocitosis ensayo
El ensayo de fagocitosis se realizó tal como se describe anteriormente [12]. MoDCs se ajustaron a 2,5 × 10
4cells /ml en medio DMEM y se cultivaron en placas de 24 pocillos a 37 ° C y 5% CO2. Se les permitió adherirse durante 24 h, momento en el que las células de puntos se marcaron con PKH26 4 M. Preparamos células MFC que estaban sin tratar o tratados por diferentes concentraciones de wogonina (50, 100 y 200 mM) durante 2 horas. Después de moDCs se lavaron con PBS frío tres veces, se añadieron células MFC marcadas con CFSE 0,5 M en placas de 24 pocillos para ensayos de fagocitosis. Después de 15 min a 37 ° C, se observó fagocitosis por software Leica DFC 450C, utilizando el software de procesamiento y análisis de imágenes ImageJ1.38 calcular el porcentaje de moDCs que envolvió al menos una célula tumoral en al menos 100 células.
análisis estadístico
los valores de las cifras se expresan como media ± desviación estándar (SD). Las cifras de este estudio fueron los representantes de más de 3 experimentos diferentes. El análisis estadístico de los datos entre el control y los grupos tratados se realizó mediante una prueba t de Student. Los valores de p & lt;. 0,05 se consideraron como estadísticamente significativo
Resultados
calreticulin inducida wogonina (CRT) translocación a la membrana de la superficie celular depende de la PERK y PI3K /AKT
estudios anteriores han mostrado que un suministro externo de señales que inducen la exposición de la membrana calreticulina (CRT) de plasma, que actúa como un "me comer" señalización, que confiere inmunogenicidad a la muerte celular de otro modo no inmunogénico, lo que permite una quimioterapia contra el cáncer óptima [1]. Siguiente hemos probado si wogonin también podría comportarse de manera similar en células de cáncer de MFC. Como se puede ver en la Fig. 1A, wogonina (100 micras) inducida fuerte CRT translocación de superficie celular en células de cáncer de MFC en como se detecta por transferencias de Western de la superficie celular de pruebas CRT. Entre las vías de señalización que regula la translocación de la CRT y la correspondiente inmunogénica muerte celular /apoptosis, que ahora está bien establecido que la pre-apoptótica estrés ER y la fosforilación del factor de iniciación de la traducción eucariótica 2α (eIF2α) y la señal de corriente arriba de la proteína quinasa quinasa R-como retículo endoplásmico quinasa (PERK) son las principales [13]. La señal de fosforilación de la eIF2α por el transporte anterógrado PERK de CRT de la ER en el aparato de Golgi y la exocitosis de vesículas que contienen CRT-, finalmente resulta en CRT translocación a la superficie de la membrana de plasma, que sirve como tecla "comer-me" [1 ], [4], [14] - [17]. Aquí, encontramos que PERK caída por siRNA objetivo translocación CRT inhibe en gran medida por wogonin (fig. 1A), lo que indica la posible participación de PERK y el estrés ER en este proceso. Sorprendentemente, PI3K inhibición /AKT por cualquiera de inhibidor farmacológico (LY 294002 y AKT inhibidor X) o knockdown genética (usando AKT1 /2 doble knockout MEFs) también en gran medida inhibido CRT translocación (Fig. 1B-D), el efecto de la inhibición de AKT en wogonina inducida por translocación CRT también se confirmó mediante un ensayo inmunológico confocal-fluorescencia como se muestra en la Fig. 1C. Tomados en conjunto, se encontró que induce la translocación wogonin CRT a la superficie de células plasmáticas, gratificación y PI3K /AKT podría estar implicado en este proceso.
MFC células de la línea celular de carcinoma gástrico fueron transfectadas con siRNA scramble (Ctrl, 200 nM) PERK o siRNA (200 nM), después de 48 horas, el nivel de expresión de PERK se detectó mediante transferencias Western para verificar el nivel PERK después del tratamiento siRNA. Perk éxito desmontables células y las células de control (Ctrl siRNA células tratadas) fueron tratados con wogonin (100 M) para 2 y 4 horas. proteínas de superficie celular en la fracción de membrana de plasma se que biotinilado y se ensayaron para CRT, EGFR y actina. También se obtuvieron lisado celular total para probar CRT, PERK y actina (A). células MFC se pretrataron con AKT inhibidor específico X (Akti 100 nM) o PI3K /inhibidor de AKT LY294002 (100 nM) durante 2 horas, seguido de wogonina (100 M) tratados durante 2 y 4 horas, CRT, EGFR y actina en el plasma fracción de proteína de membrana se detectó por Western blots. CRT, p-AKT (Ser 473), AKT1 /2 y actina en lisado total de células también se detectaron mediante transferencias de Western (B) .CRT translocación a la superficie celular después de wogonina tratamiento también se confirmó por microscopía confocal inmune-fluorescencia, la translocación fue inhibido por el inhibidor de Akt X (Akti 100 nM), doxorubicina (Dox, 1 M, el tratamiento de 2 horas) se utilizó aquí como controles positivos. (DO). WT y AKT1 /2 MEFs doble knockout fueron tratados con wogonina (100 mM) durante 4 horas; CRT, EGFR y la actina en la fracción de proteína de la membrana plasmática se detectaron por transferencias de Western. P-S6 (S235 /236), p-AKT (S473), AKT1 /2, CRT y actina en lisado de células enteras fueron detectados por Western blots (D). Los experimentos en esta figura se repitieron al menos 3 veces y se obtuvieron resultados similares. Bar = 10 micras.
wogonin induce dependiente de la respuesta de estrés ER ROS, cortando la señal aguas arriba como para la activación de la vía /AKT PI3K
Como hemos comentado anteriormente, los datos actuales sugieren que que wogonin inducida por la translocación de la CRT y /AKT PERK y PI3K pueden estar involucrados en este proceso. A continuación tratamos de diseccionar esta vía de señalización. Como se muestra en la Fig. 2A, wogonin (100 mM) induce una activación de PI3K /AKT evidente en las células MFC en un breve periodo de tiempo (hasta 2 horas); Es interesante que la activación de AKT se había reducido regulado después de la exposición a largo plazo de wogonin (Fig. 2A y B). Al mismo tiempo, la exposición de wogonina también indujo una respuesta de ER obvio como lo demuestra la fuerte fosforilación de las proteínas de estrés ER (PERK, PKR y eIF2α) en tratados wogonina células MFC (Fig. 2C). knockdown PERK siRNA, que se ha demostrado que inhiben la CRT translocación (Fig. 1A), en gran parte inhibe la fosforilación inducida wogonina de eIF2α y la activación /AKT PI3K en células MFC (Fig. 2D y E), lo que indica que PERK sirve como la señal de corriente arriba para wogonina inducida señalización PI3K /AKT. Al tratar de identificar la señal aguas arriba de wogonin inducida por el estrés ER y la fosforilación PERK, se encontró que la producción de ROS significativa (Fig. 2F y G), PERK /fosforilación y la activación de PKR /AKT /mTORC1 PI3K activada por wogonin se inhibió en gran medida por anti- oxidante N-acetil-cisteína (NAC) (Fig. 2G-H). En base a esto, proponemos que las ROS modifica las proteínas ER y arrancar una respuesta al estrés ER, lo que resulta en PERK /PKR mediar la fosforilación eIF2α y la posterior activación de PI3K /AKT, que dirige la translocación de la CRT y un posible "comer-me" de la señal.
línea celular de carcinoma gástrico células MFC fueron tratados con wogonin (100 M) para los puntos de tiempo indicados, AKT y la activación mTORC1 aguas abajo se detectaron mediante transferencias Western utilizando anticuerpos indicados, AKT1 /2, S6K, S6 y β-actina fueron también probados como la igualdad de las cargas (A). la fosforilación de Akt se cuantificó usando el software Image J después normalizó a AKT1 /2 (B). Tenga en cuenta que wogonina indujo una activación temprana, pero más tarde inhibición de AKT. células MFC se trataron con wogonina (100 M) para los puntos de tiempo indicados, p-PERK (Thr980), p-eIF2-α (Ser51), p-PKR (Thr446 /451), sus correspondientes proteínas no fosfo y AKT1 /2 fueron detectados por transferencias de Western (C). células MFC fueron transfectadas con siRNA PERK durante 48 horas, las células transfectadas con éxito (confirmado mediante transferencia de western) se trataron con wogonina (100 mM) durante 1 hora, p-PERK (Thr980), p-eIF2-α (Ser51), p- AKT (Ser 473), p-4E-BP1 (Ser 65), PERK, sus correspondientes proteínas no fosfo y β-actina fueron detectados por Western blots (D), la fosforilación de AKT se cuantificó usando el software Image J después normalizó a AKT1 /2 (E). Las células MFC fueron pre-tratados con anti-oxidante N-acetil-cisteína (NAC, 400 mM) durante 2 horas, seguido de wogonina (100 mM) de tratamiento durante 30 minutos, la producción de ROS se detectaron tanto por fluorescencia (F) y FACS ( G) de ensayo, respectivamente, como se ha descrito anteriormente. Las células MFC fueron pre-tratados con anti-oxidante N-acetil-cisteína (NAC, 400 mM) durante 2 horas, seguido de wogonina (100 mM) durante 30 y 60 minutos, p-PERK (Thr980), p-PKR (Thr446 /451), p-4E-BP1 (Ser 65), p-AKT (Ser 473) y sus correspondientes proteínas no fosfo se detectaron mediante transferencias de Western (H). Los experimentos en esta figura se repitieron al menos 3 veces y se obtuvieron resultados similares.
#
P Hotel & lt; 0,05 vs grupo control siRNA. *
P Hotel & lt; 0,05 frente a grupo sin tratamiento previo NAC. Bar = 10 micras.
DNA-PKcs, forma un complejo con PERK, media la activación de AKT por wogonin
A continuación tratamos de indentify el jugador intermedio de la activación de AKT por PERK por el foco en DNA-PKcs, un miembro de PI3K descubierto recientemente que puede activar AKT [18] - [20]. DNA-PK se compone de una subunidad de 470 kDa catalítica (DNA-PKcs) y el complejo antígeno Ku (Ku80 /Ku70) y participa en V (D) J recombinación, reparación del ADN de doble filamento se rompe por recombinación no homóloga, la apoptosis, y regulación de la transcripción [21] .Significantly, ahora está bien establecido que el ADN-PKcs, como un miembro de la familia PI3K, también regula la fosforilación de Akt [22]. Además, un papel para la DNA-PK en la activación de AKT por CpG-ADN se ha establecido el uso de hueso macrófagos derivados de médula [23]. Por otra parte, Bozulic et al. indicó que el ADN-PK fosforila AKT a la inducción de ADN de doble filamento se rompe [19]. Además, el requisito de la DNA-PK que fosforila AKT en respuesta a la radiación ionizante también se estableció en vivo [19]. Así que la próxima, probamos la posible implicación de DNA-PKcs en wogonin inducida por la fosforilación de AKT. Un inhibidor molecular pequeña de DNA-PKcs, Nu7062, se utilizó específicamente aquí para inhibir la actividad de DNA-PKcs. En las células pretratadas con Nu7026, la fosforilación de AKT wogonin inducida se suprimió casi por completo (Fig. 3A). Estos resultados apoyan la hipótesis de que el ADN-PKcs podría ser las interrelaciones que medie clave para wogonin inducida por la activación de AKT. Para probar esta nueva, se utilizó siRNA contra el ADN-PKcs aquí para derribar ADN-PKcs. En pleno apoyo de nuestros datos de los estudios NU7026, la fosforilación de AKT tanto en Ser473 y Thr308 se vio afectada en gran medida en las células tratadas wogonin agotadas de ADN-PKcs (Fig. 3B). Es importante destacar que se encontró que el ADN-PKcs, AKT y PERK forman un complejo en wogonina células tratadas, que se invierte por pre-tratamiento con DNA-PKcs inhibidor Nu 7062 (Fig. 3C), en base a esta información, se sugiere que ADN PKcs, forma un complejo con PERK, media la activación de AKT por wogonina. Sin embargo, el mecanismo detallado por el cual el ADN-PKcs fosforila AKT en las células tratadas wogonin necesita más investigación.
línea celular de carcinoma gástrico Las células MFC fueron pre-tratados con un inhibidor de la DNA-PKcs (Nu 7062, 10 mM) para 2 horas, seguido de wogonina (100 mM) de tratamiento para 1 y 2 horas, la fosforilación de Akt se detectaron mediante transferencia de Western y DNA-PKcs y AKT1 /2 se detectaron como cargas iguales (a). células MCF-7 fueron transfectadas con scramble (Ctrl, 200 nM) o DNA-PKcs (200 nM) durante 48 horas mediante el uso de métodos de transfección señas anteriormente, se usaron células transfectadas con éxito para el ensayo de señalización de AKT en tratados wogonina células MFC (B). Las células MFC fueron pre-tratados con un inhibidor de la DNA-PKcs (Nu 7062, 10 mM) durante 2 horas, seguido de wogonina (100 mM) de tratamiento durante 1 h, los precleared 600-g alícuotas de lisados de células se incubaron con anti-DNA -PKcs, seguido por análisis de transferencia de Western con anti-DNA-PKcs, AKT, PERK, Ku80, IgG y β-actina, respectivamente (C). Los experimentos en esta figura se repitieron al menos 3 veces y se obtuvieron resultados similares.
* P & lt; 0,05 frente a grupo sin Nu7062,
* P & lt;. 0,05 frente a grupo sin ADN-PKcs caída
indentify anexina A1 y p22 como posibles blancos de wogonin
Para más indentify posibles objetivos de wogonin, se aplicó aquí una electroforesis bidimensional (2D) en gel además del análisis de espectrometría de masas de proteínas. Preparamos proteínas de células enteras de la línea celular de carcinoma gástrico MKN-45 células que se dejaron sin tratar o tratado para la diferente concentración de wogonina (50, 100 y 200 mM) durante 24 horas. Comparación de la electroforesis (2D) de dos dimensiones, seguido por espectroscopia de masa análisis, llevado a la identificación de HMGB1 (grupo de proteínas de alta movilidad 1), p22 y anexina A1 como proteínas que fue fuertemente inducida por wogonina tratamiento de una manera dependiente de la dosis ( La Fig. 4A y B). Anexina A1 es el primer miembro caracterizado de la familia de anexina de proteínas capaces de unirse a (es decir, para el anexo) a las membranas celulares de una manera dependiente de calcio. descrito originalmente como una proteína inhibidora de la fosfolipasa A2 (PLA2), anexina A1 puede afectar a muchos componentes de la reacción inflamatoria además el metabolismo del ácido araquidónico [24], [25]. Curiosamente, la anexina A1 ha sido recientemente implicados en la célula apoptótica "me come" señal y subsiguiente fagocitosis, y se están acumulando pruebas para apoyar un papel en la fase de resolución de la inflamación. Un documento de Arur et al. elegantemente demostró que la anexina A1 podría servir como una fosfatidilserina endógena (PS) ligando [26], la mediación de inmersión de las células apoptóticas. Anexina A1 es reclutado para la región rica en PS de superficie celular y media "comer-me" de la señal y la liberación de calcio celular [26]. Como se muestra en la Fig.