Extracto
Silibina o silibinina, un flavonolignan aislado de las semillas del cardo de leche, es uno de los suplementos dietéticos populares y ha sido ampliamente estudiado por su antioxidante, hepatoprotector y propiedades contra el cáncer. Hemos previsto que la potencia de la silibina se podría mejorar aún más mediante la modificación adecuada /s en su estructura química. En consecuencia, aquí, sintetizado y caracterizado una serie de derivados silibina a saber, 2,3-dehidrosilibina (DHS), 7-
O
-methylsilybin (7OM), 7-O-galloylsilybin (7OG), 7,23 -disulphatesilybin (DSS), 7-
O
-palmitoylsilybin (7OP), y 23-
O
-palmitoylsilybin (23OP); y comparado su eficacia anti-cáncer usando HTB9 cáncer de vejiga humano, HCT116 de cáncer de colon y células de carcinoma de próstata PC3. En todas las líneas de células 3, DHS, 7OM y 7OG demostraron mejores efectos inhibidores del crecimiento y en comparación con la silibina, mientras que otros derivados de silibina mostraron menor o ninguna eficacia. A continuación, hemos preparado los isómeros ópticos (A y B) de Silibina, el DHS, y 7OM 7OG, y se comparó su eficacia contra el cáncer. Isómeros de estos tres derivados silibina también mostraron una mejor eficacia en comparación con los respectivos isómeros silibina, pero en cada uno, no hubo clara Silibina A frente a la actividad isómero B preferencia. Otros estudios en células HTB encontraron que el DHS, y 7OM 7OG ejercen una mejor actividad apoptótica de silibinina. ensayos clonogénicos en células HTB9 confirmaron además que tanto las mezclas racémicas así como los isómeros ópticos puros de DHS, 7OM y 7OG fueron más eficaces que la silibina. En general, estos resultados sugieren claramente que la eficacia anti-cáncer de silibina podría mejorarse de manera significativa a través de modificaciones estructurales, e identificar una fuerte eficacia anti-cáncer de derivados de silibina, a saber, DHS, 7OM, y 7OG, lo que significa que su eficacia y toxicidad deben ser evaluados en modelos de cáncer pre-clínicos relevantes en roedores
Visto:. Agarwal C, R Wadhwa, Deep G, D Biedermann, Gazak R, Křen V, et al. (2013) Lucha contra el Cáncer La eficacia de los derivados Silibina - Una Relación Estructura-Actividad. PLoS ONE 8 (3): e60074. doi: 10.1371 /journal.pone.0060074
Editor: Stephen J. Polyak, Universidad de Washington, Estados Unidos de América
Recibido: Diciembre 10, 2012; Aceptado: February 21, 2013; Publicado: 28 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Agarwal et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el NCI SR1 otorga CA102514 y CA112304, AMVIS CZ-estadounidense de colaboración ME10027 proyecto del Ministerio de Educación de la República Checa (VK y RA), y RVO61388971 (Concepto Institucional del Instituto de Microbiología, Praga). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Silibina o silibinina (C
25H
22O
10, Nº CAS 22888-70-6, la figura 1a) es un suplemento dietético popular aislado de las semillas de
Silybum marianum gratis (L.) Gaertn (familia Asteraceae), conocido como el cardo de leche. extracto de cardo mariano denotado como silimarina tiene una larga historia de uso en la medicina popular y ahora se emplea con frecuencia para la prevención y /o tratamiento de trastornos del hígado como la hepatitis vírica, la cirrosis hepática asociada con el abuso del alcohol, de las drogas daño hepático & amp; toxinas industriales [1] - [3]. Silibina también se considera un eficaz antídoto contra el envenenamiento por oronja (
Amanita phalloides
) [2], [4]. Además, silibina también exhibe una fuerte actividad antioxidante a través de los radicales hidroxilo y la inhibición de la peroxidación lipídica, actuando como un antioxidante que rompe la cadena [5], [6]. En las dos últimas décadas, además de hepatoprotector y efectos antioxidantes, silibina ha demostrado notables anti-cáncer, así como la eficacia quimiopreventivo del cáncer en la pre-clínica modelos de cultivo celular y animales de varios cánceres epiteliales, incluyendo la piel, vejiga, colon, próstata, pulmón etc. [7], [8]. Sobre la base de estos prometedores resultados de los estudios pre-clínicos, silibina también se ha probado en pacientes humanos con cáncer en fase piloto ensayos clínicos I-II, donde se informó de ser bien tolerado y demostró una biodisponibilidad plasma y el objetivo de los tejidos [7], [ ,,,0],9] - [11]. Varias pruebas toxicológicas tradicionales han demostrado la naturaleza no tóxica de Silibina, y se informa que son seguros para el consumo humano [10], [12]. En base a su probada, así como la eficacia preventiva y terapéutica contra el cáncer emergente, sería de gran importancia y el valor de la traducción si la eficacia de la silibina se podría mejorar aún más mediante adecuada modificación química /s en su estructura, ya que es obvio que la silibina tiene una efectiva "estructura de plomo".
(a-h) Las estructuras químicas de silibina, el silybin a, B silibina, 2,3-dehidrosilibina, 7-
O
-methylsilybin, 7-
O
-galloylsilybin, el silybin 7,23-disulfato, 7-
O
-palmitoylsilybin y 23-
O
-palmitoylsilybin.
en los últimos años, ha habido un mayor énfasis en la comprensión de la estructura química detallada de silibina, identificación y síntesis de sus estereoisómeros, así como la evaluación de su eficacia biológica [13] - [17]. Silibina se ha confirmado que es una mezcla 01:01 de dos isómeros ópticos a saber silibina A y silibina B (Figura 1b y 1c). Además, la función detallada de respectivos grupos hidroxilo y restos de silibina ha sido ahora bien caracterizado, y que el conocimiento ha permitido la identificación de sitios adecuados para el diseño y la síntesis de nuevos derivados de silibina sin afectar a la actividad biológica de los conjugados resultantes [18] , [19]. Estos estudios han identificado que las posiciones más adecuadas para las modificaciones son silibina 7-OH y /o 23-OH [18], [19]; y en base a estas observaciones críticas, varios derivados de la silibina se han diseñado, sintetizado y caracterizado [20] - [23]. Por ejemplo, se han sintetizado y caracterizado 7
-O CD - 23 y
-O
acil-derivados de silibinina con diferentes longitudes de cadena de acilo, y las actividades de sus propiedades antioxidantes y anti-virales han confirmado [20]. Del mismo modo, una serie de ésteres de galoil silibina también se han sintetizado y 7
-O
-galloylsilybin se identificó como el compuesto más efectivo en términos de eficacia anti-angiogénico [21]. También hemos informado de que la eficacia anti-angiogénica de B isómero de 7
-O
-galloylsilybin es significativamente mayor que el isómero A [21]. Del mismo modo, silibina producto de oxidación, 2,3-dehidrosilibina, también ha sido sintetizado que mostró potencial mejor antioxidante que silibin; el derivado de ácido carboxílico de 2,3-dehidrosilibina, a saber, el ácido 2,3-dehydrosilybinic, ha mostrado mejores actividades de barrido contra la peroxidación lipídica y anti-radicales y muestra una mejor solubilidad en agua [22], [24]. También hemos preparado una gran serie de
O
alquilo derivados (metilo y bencilo) de Silibina y 2,3-dehidrosilibina, y se han identificado algunos derivados novedosos con eficacia fuerte contra la actividad de eflujo de fármaco mediada por P-glicoproteína [23]. Tomados en conjunto, los estudios anteriores sugieren claramente que la eficacia biológica de la silibina se podría mejorar de manera significativa a través de modificaciones químicas adecuadas.
Con la opinión de que varios de los derivados de silibina han mostrado una mejor actividad que la molécula padre en diversos sistemas biológicos y que silibina sí ejerce una fuerte eficacia contra el cáncer, en el presente estudio, se comparó la eficacia anti-cáncer de varios derivados silibina (existentes, así como de nuevo diseño) en tres líneas celulares de cáncer humano diferentes, y se identificaron tres derivados silibina con anti- la actividad del cáncer mejor que el silybin.
Materiales y Métodos
Cultivo celular, tratamiento y Reactivos
se adquirieron células de cáncer de vejiga HTB9 humanos, células HCT116 de cáncer de colon y células PC3 de carcinoma de próstata de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). células HTB9 y PC3 se cultivaron en medio RPMI1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino y 100 U /ml de penicilina G y 100 mg /ml de sulfato de estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 incubadora. células HCT116 se cultivaron en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino y 100 U /ml de penicilina G y 100 mg /ml de sulfato de estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 incubadora. Todos los materiales de cultivo de células eran de Invitrogen Corporation (Gaithersburg, MD). Las células se sembraron y se tratan a 40-50% de confluencia con diferentes dosis de silibina o sus derivados (5-60 micras de media) disueltos inicialmente en DMSO para los períodos de tiempo deseados bajo condiciones de suero. Una cantidad igual de DMSO (vehículo) estaba presente en cada tratamiento, incluyendo el control; concentración de DMSO no excedió 0,1% (v /v) en cualquier tratamiento. Al final de los tratamientos deseados, se realizaron diversos análisis como se describe más adelante. El anticuerpo primario para CPARP y anti-conejo de peroxidasa de anticuerpo secundario conjugado se adquirieron de Cell Signaling (Beverly, MA). Anticuerpo para tubulina era de Neomarkers (Fremont, CA). Hoechst 33342, violeta cristal y yoduro de propidio (PI) fueron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). ECL sistema de detección y peroxidasa conjugado anticuerpo secundario anti-ratón eran de GE Healthcare (Buckinghamshire, Reino Unido). Todos los demás reactivos se obtuvieron en su grado más alto disponible comercialmente pureza.
Química
La silimarina como material básico para todos los productos consecutivos se obtuvo a partir de Liaoning Senrong Pharm. Co., LTD (Panjin, provincia de Liaoning, China). Ópticamente puro silibina A y silibina B se obtuvieron como se describe anteriormente [25], [26]; en particular, un nuevo método de separación preparativa desarrollado por nosotros recientemente [25], [26], que se basa en la discriminación enzimática catalizada por lipasa de ambos silibina estereoisómeros, permitió la preparación de todos los derivados mencionados en este trabajo en forma ópticamente pura a la gran escala. Los métodos de síntesis, los esquemas sintéticos y los datos analíticos confirman la estructura de la previamente sintetizado y informaron silibina derivados (que se evaluaron para su actividad anti-cáncer en el presente estudio) se resumen en Métodos S1 y las Figuras S1, S2, S3, S4, S5, y en las Tablas S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, respectivamente. Brevemente, 2,3-dehidrosilibina (DHS) A y B se prepararon mediante una oxidación catalizada por base de silibina respectivos A y B como se ha descrito recientemente [22], [24]; 7-
O
-Methylsilybin (7OM) A y B se prepararon mediante la metilación catalizada por una base de Silibina respectiva A y B [23]; y 7-
O
-palmitoylsilybin (7OP), 23-
O
-palmitoylsilybin (23OP) y 7-
O
-galloylsilybin (7OG) tanto desde el silybin A y B se sintetizaron como se describe anteriormente por nosotros [20] - [23].
Preparación de 7,23-disulfato silibina [silibina-7,23-diilo
bis gratis (sulfato de hidrógeno), DSS], y caracterización de masas y RMN espectros
a una solución agitada de silibina [silibina a, B o silibina silibina natural de a & amp; B (01:01), 200 mg, 0,43 mmol] en DMF (2 ml), se añadió Py⋅SO
3 (200 mg, 1,26 mmol). La reacción se interrumpió después de 1 h de stiring a 40 ° C por la adición de EtOH (0,5 ml). Después de una breve agitación, la mezcla de reacción se cargó en la columna de gel de sílice y se cromatografió con el disolvente EtOH /MeOH /CH
2Cl
2 /agua (2/1/9 /0,3) para dar un color amarillo claro aceite, que se liofilizó para obtener el compuesto del título, ya sea como el diastereómero a puro o B o la mezcla de a & amp; B (cca 160 mg, 60%) como un liofilizado de color amarillo pálido
los espectros de masas de la sintetizada. compuesto se midieron en una desorción por láser asistida por matriz /ionización reflectrón tiempo de vuelo espectrómetro de masas MALDI-TOF Ultraflex (Bruker-Daltonics, Bremen, Alemania). Los espectros positivos se calibraron externamente utilizando la monoisotopic [M + H] + de iones de angiotensina I humana 1.296,69
m /z
, MRFA péptido 524.26
m /z
y CCA matriz de pico de 379,09
m /z
. Una solución 10 mg /ml de ácido o 2,5- ácido dihydrobenzoic en ácido acético /0,3% 50% de MeCN-hidroxi-cinámico α-ciano-4 se utilizó como una matriz de MALDI. A 1 l de muestra disuelto en agua se dejó secar a temperatura ambiente y el exceso de establecido con un 0,3 l de la solución de matriz en el objetivo. Los espectros de MALDI-TOF positivos o negativos se recogieron en el modo de reflectrón. MS (MALDI-TOF):
m /z
(%) = 643 (17, M
+ + H.), 561 (32), 547 (36), 545 (100), 481 (25), 465 (69).
Los espectros de RMN se midieron en Bruker AVANCE III 400 (observación frequence 400,13 MHZ para
1 H, 100.62 MHz para
13C) en DMSO
d
6 gratis (Sigma Aldrich) a 30 ° C. señal de disolvente residual se utiliza como estándar interno ((δ
H 2.500, δ
C 39.60). Los desplazamientos químicos y las constantes de interacción se registraron a partir de espectros en los que se aplicaron las funciones de ponderación (exponencial con exponente negativo y la función de Gauss). Los desplazamientos químicos se expresan en δ escala (ppm) y las constantes de interacción en Hz. resolución digital permite expresar desplazamientos químicos de los protones con tres y carbonos con dos cifras decimales, respectivamente, y las constantes de interacción protón-protón con un decimal. multiplicidad de señales de humo se determinó a partir de espectros HSQC de protones editado asignación de señal se basa en experimentos de RMN 2D -. COSY, HSQC, HMBC, que se realizaron con los programas estándar (Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, dE)
1 H y
. Los espectros de RMN de 13C de forma óptica pura silybinA-7,23-diilo
bis gratis (sulfato de hidrógeno) y silybinB-7,23-diilo
bis gratis (sulfato de hidrógeno), que no han sido reportados hasta el momento, se resumen en las Tablas 1 y 2, respectivamente.
ensayos de crecimiento celular
en cada caso, las células se cultivaron hasta aproximadamente 40-50% de confluencia y tratados con silibina o sus derivados o isómeros puros de cada compuesto en condiciones de suero como se detalla anteriormente. Después de 24 y 48 h de tratamiento, las células se recogieron mediante una breve tripsinización y se lavaron con PBS. número total de células se determinó contando cada muestra por duplicado utilizando un hemocitómetro bajo un microscopio invertido. Cada punto de tratamiento y el tiempo tenía tres placas independientes.
Ensayo de apóptosis
cuantitativa muerte celular por apoptosis por el silybin y sus derivados en células HTB9 se midió mediante el ensayo de Hoechst como se describe anteriormente [27]. En pocas palabras, después de los tratamientos deseados, se recogieron las células y luego teñidas con colorante de unión a ADN Hoechst 33342 y PI. Las células apoptóticas se cuantificaron utilizando microscopio de fluorescencia (Axioskope 2 plus-HBO 100, Zeiss, Jena, DE) por el recuento de células /campo microscópico (en 400 ×) en seis campos de cada muestra (por triplicado). Las células apoptóticas mostraron azul brillante (a principios de apoptosis) o fluorescencia naranja-rojo (finales de apoptosis), que se distingue de las células necróticas que muestran la fluorescencia de color rojo brillante (PI-manchado).
Western Blot
Para Western Blot, lisados (80 mg) se desnaturalizaron en tampón de muestra de SDS-PAGE 2X y se resolvió el 8% en geles de Tris-glicina. Las proteínas separadas se transfirieron a membrana de nitrocelulosa seguido de bloqueo con 5% de leche en polvo no grasa (w /v) en solución salina tamponada con Tris (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 100 mM, 0,1% de Tween 20) para 1 h a temperatura ambiente. Después del bloqueo, las membranas se probaron con anticuerpo primario durante 2 h a temperatura ambiente y luego durante la noche a 4 ° C seguido de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa apropiado para 1 h a temperatura ambiente y se visualizaron mediante el sistema de detección ECL. En cada caso, las transferencias se sometieron a exposiciones múltiples en la película para asegurarse de que la densidad de la banda está en el intervalo lineal. Para todos los resultados, autoradiograma /bandas fueron escaneados con Adobe Photoshop 6.0 (Adobe Systems Inc, San Jose, CA). Para garantizar la igualdad de proteínas de carga, cada membrana fue despojado y re-probaron con anticuerpo α-tubulina.
Ensayo clonogénico
HTB9 células se sembraron en placas de 6 pocillos y autorizará la colocación de las placas por 24 h. A partir de entonces, dependiendo del protocolo de tratamiento, las células fueron tratadas con cada compuesto de cada 72 h o tratados sólo por 2 h cada 24 h. Al final del periodo indicado, las células se lavaron dos veces con PBS enfriado en hielo, se fijaron con la mezcla de metanol y ácido acético glacial (3:01) durante 10 minutos y después se tiñeron con 1% de cristal violeta en metanol durante 15 minutos seguido de lavado con agua desionizada. Se contaron las colonias con más de 50 células.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el software SigmaStat 2,03 (Jandel Scientific, San Rafael, CA). Los datos se analizaron usando ANOVA de una vía seguido por t-test de Tukey, y una diferencia estadísticamente significativa fue considerado en
p
≤0.05.
Resultados
Efecto de Silibina y su derivados sobre crecimiento de células cancerígenas
en primer lugar, se comparó el efecto inhibidor del crecimiento de silibina y sus derivados (estructuras químicas se muestra en la Figura 1) DHS, 7OM, 7OG, DSS, 7OP y 23OP en líneas celulares de cáncer humano de vejiga , origen de colon y de próstata, a saber HTB9, HCT116 y PC3, respectivamente; en particular, silibinina ha demostrado una gran eficacia contra el cáncer en modelos pre-cáncer de vejiga, de colon y de próstata [7], [8]. Como se muestra en la Tabla 3, en las células HTB9 a los 30 y 60 micras dosis, el DHS, y 7OM 7OG fueron más efectivos que el silybin después de 24 y 48 h de los tratamientos en la inhibición del crecimiento de células términos; Sin embargo, a concentraciones equimolares, los efectos inhibidores del crecimiento de otros derivados, a saber, DSS, 7OP, y 23OP, fueron inconsistentes y, o bien igual o menor que el silybin. Del mismo modo en las células HCT116, DHS, 7OM y 7OG fueron más eficaces en la inhibición de crecimiento de las células en comparación con la silibina y otros derivados de silibina (Tabla 3). En las células PC3, silibina derivado (30 y 60 micras dosis) mostraron inhibición del crecimiento igual o mejor que la silibina después de 24 h de tratamiento (Tabla 3). Una vez más, el DHS, y 7OM 7OG eran mucho más eficaz que la silibina u otros derivados después de 24 y 48 h de los tratamientos en términos de inhibición del crecimiento celular; sin embargo, el efecto de otros derivados silibina (DSS, 7OP, y 23OP) se perdió en gran medida a las 48 h de duración punto (Tabla 3). En conjunto, estos resultados muestran claramente que sólo los derivados de DHS, 7OM y 7OG de silibina tienen una eficacia anti-cáncer mucho más fuerte que la estructura de matriz, y por lo tanto, solamente se utilizaron estos tres derivados en estudios posteriores.
Efecto de silibina y sus derivados sobre la apoptosis en células de inducción HTB9
a continuación, se comparó el efecto de silibina y sus tres derivados más activos (DHS, 7OM y 7OG) a 30 mM dosis en la inducción de muerte celular por apoptosis en HTB9 células. Como se muestra en el panel de 2A-inferior figura, después de 24 h de tratamiento, silibina y sus derivados aumentó significativamente la muerte celular apoptótica en células HTB9, y 7OG era más potente en la inducción de apoptosis. Sin embargo, los análisis de Western blot para CPARP marcador de apoptosis mostraron un fuerte incremento con la única 7OG (panel de la figura 2A-superior). La mejor eficacia de los derivados de silibina era más claramente evidente después de 48 h de tratamiento donde DHS, 7OM y 7OG aumentó significativamente la población celular apoptótica (panel Figura 2B-inferior) así como el aumento del nivel de CPARP en células HTB9 (Figura 2B-superior panel). Estos resultados confirman aún más la eficacia anti-cáncer fuerte y mejor del DHS, 7OM y 7OG en comparación con silibina contra las células HTB9.
(A-B) Células HTB9 fueron tratados con dosis de 30 M de Silibina (SB), 2,3-dehidrosilibina (DHS), 7-
O
-methylsilybin (7OM) y 7-
O
-galloylsilybin (7OG). Después de 24 o 48 h de cada tratamiento, se recogieron las células y la población apoptótica se determinó por el ensayo de Hoechst como se detalla en el "Materiales y Métodos". En los diagramas de barras, cada punto de datos es representativa de la media ± desviación estándar de 3 muestras. También se recogieron (A-B, parte movible Western blot) Las células tras el silybin o sus derivados tratamiento y se analizaron para CPARP nivel de proteína por Western Blot. En cada caso, las membranas también fueron despojados y re-probaron con anticuerpo α-tubulina para comprobar la carga de proteínas. * P≤0.001.
Efecto de isómeros ópticos puros de Silibina y sus derivados en el crecimiento de células cancerígenas
Como se mencionó anteriormente que el silybin es una mezcla (relación 01:01) de óptica isómeros silibina a y silibina B, el próximo preparados gran cantidad de estos dos isómeros silibina y los utilizados para sintetizar grandes cantidades de sus derivados DHS (a y B), 7OM (a y B) y 7OG (a y B) como se resume en métodos anteriores. Estos isómeros ópticos puros de la silibina y sus derivados se evaluaron a continuación para su crecimiento celular de cáncer de los efectos inhibidores. En todas las tres líneas celulares de cáncer, a saber HTB9, HCT116 y PC3, isómeros puros (30 y 60 micras dosis) de DHS, 7OM y 7OG fueron más eficaces en comparación con respectivo isómero de silibina después de 24 y 48 h de tratamientos (Tabla 4) . Cuando se comparó el crecimiento de las células efectos inhibitorios del isómero A frente al isómero B y sus respectivos derivados, ninguna observación clara podría hacerse, sin embargo, el silybin isómero B y sus derivados parecía más eficaz que el isómero A y sus derivados (Tabla 4).
A continuación, se compararon los efectos inhibidores del crecimiento de dosis más bajas (5 y 10 mM) de los isómeros ópticos de silibina (silibina A y B silibina), así como sus derivados DHS (A y B), 7OM (a y B) y 7OG (a y B) en las células HTB9. Como se muestra en la figura 3, en 5 mM de dosis, la diferencia entre la silibina y sus derivados fue menos llamativo. Sin embargo, en una concentración de 10 mM, la diferencia en la eficacia de isómeros silibina con sus derivados isómeros era claramente evidente con la inhibición del crecimiento más fuerte por los derivados en comparación con estructuras de los padres, específicamente después de 48 h de tratamiento (Figura 3). En conjunto, estos resultados sugieren que al igual que una mejor actividad de isómeros silibina racémicas saber, DHS, 7OM y 7OG en comparación con los padres silibina racémica, los derivados de silibin pura isómeros A y B son también más eficaz en comparación con sus respectivos puro silibina isómeros A y B .
HTB9 células fueron tratadas con 5 y 10 mM dosis de silibina A, 2,3-dehidrosilibina A, 7-
O
-methylsilybin A, 7-
O
-galloylsilybin A o B silibina, 2,3-dehidrosilibina B, 7-
o
-methylsilybin B, 7-
o
-galloylsilybin B. Después de 24 o 48 h de cada tratamiento, el total de se determinó el número de células que se detallan en el "Materiales y Métodos". En los diagramas de barras, cada punto de datos es representativa de la media ± desviación estándar de 3 muestras. * P≤0.001;#P≤0.01; $ P = 0.05.
Efecto de mezclas racémicas y los isómeros ópticos puros de Silibina y sus derivados en la formación de colonias de células HTB9
A continuación, se comparó el efecto de las mezclas racémicas y pura isómeros de silibina y sus tres derivados más eficaces DHS, 7OM y 7OG sobre la formación de colonias por las células HTB9. En el primer experimento, se empleó una dosis de 20 mM de todos los compuestos y se observó una inhibición completa de la formación de colonias por silibina, así como sus derivados (datos no mostrados). Por lo tanto, hemos utilizado la próxima dosis más bajas de las mezclas racémicas así como los isómeros puros de la silibina y sus derivados. Como se muestra en la figura 4A, DHS, 7OM, y 7OG (5 y 10 mM dosis cada 72 h) inhibieron la formación de colonias por células HTB9, y los tres derivados fueron más eficaces que la silibina, tanto a las dosis. Del mismo modo, el tratamiento (5 y 10 mM dosis) con isómeros puros (A y B) de DHS, 7OM, y 7OG también inhibió fuertemente la formación de colonias por células HTB9; isómeros de todos los tres derivados fueron concluyente más eficaz en comparación con los respectivos isómeros silibina A y silibina B (Figura 4A). Entre todos los isómeros puros en este ensayo, 7OG-B mostró la mayor eficacia (Figura 4A).
(A) células HTB9 (aproximadamente 1000 células) se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron cada 72 h con 5 y 10 mM dosis de silibina (SB), 2,3-dehidrosilibina (DHS), 7-
O
-methylsilybin (7OM), 7-
O
-galloylsilybin (7OG), el silybin A (SB-A), 2,3-dehidrosilibina A (DHS-A), 7-
O
-methylsilybin A (7OM-A), 7-
O
-galloylsilybin A ( 7OG-A) o el silybin B (SB-B), 2,3-dehidrosilibina B (DHS-B), 7-
o
-methylsilybin B (7OM-B), 7-
o
-galloylsilybin B (7OG-B). El 11
º día, se procesaron las células y se contaron las colonias con más de 50 células. (B) las células HTB9 (aproximadamente 1000 células) se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron durante 2 h cada 24 h con 20 dosis M de silibina (SB), silibina A (SB-A), 2,3-dehidrosilibina A (DHS -A), 7-
o
-methylsilybin A (7OM-A), 7-
o
-galloylsilybin A (7OG-A) o el silybin B (SB-B), 2, B-3 dehidrosilibina (DHS-B), 7-
O
-methylsilybin B (7OM-B), 7-
O
-galloylsilybin B (7OG-B). Después de 7 días, se procesaron las células y se contaron las colonias con más de 50 células. En los diagramas de barras, cada punto de datos es representativa de la media ± desviación estándar de 3 muestras. *, P≤0.001; #, P≤0.01; $, P = 0.05.
En otro régimen de tratamiento, las células fueron expuestas a HTB9 dosis de 20 M de Silibina o isómeros de Silibina y sus derivados (DHS, 7OM, y 7OG) durante 2 h, y después de ello, se añadió medio fresco sin los compuestos, y el mismo protocolo de tratamiento fue seguido cada 24 h. Estas condiciones experimentales se basan en nuestra observación en el ensayo clínico completado donde hemos informado silibina vida media y la concentración en el plasma de pacientes de cáncer en la silibina M misma gama es decir, 20 durante aproximadamente 2 h [28] Como se muestra en la figura 4B, bajo estas condiciones de tratamiento, la eficacia de todos los compuestos se vio comprometida en cierta medida, pero todavía 7OG y DHS retenidos mayor eficacia inhibidora contra la formación de colonias HTB9. Este ensayo confirmó que 7OG es el más eficaz entre todos los derivados silibina seguido por el DHS y 7OM.
Discusión
El cáncer es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. En Estados Unidos solamente, se proyecta un total de 1,638,910 nuevos casos de cáncer y 577,190 muertes por cáncer que se produzca en el año 2012 [29]. Con el creciente uso de herramientas de imagen y biomarcadores, muchos tipos de cáncer se diagnostican en etapas tempranas donde las opciones terapéuticas son bastante limitadas debido a las inherentes a los efectos secundarios asociados con estos tratamientos. En tales pacientes, la quimioprevención del cáncer y /o la intervención a través de agentes no tóxicos tales como silibina podría ser una opción atractiva alternativa junto con vigilante en espera. Además, la quimioterapia del cáncer a menudo está limitada por la toxicidad aguda que acompaña especialmente hepatotoxicidad, que da lugar a reducciones de la dosis o retrasos en la terapia, lo que podría aumentar el riesgo de una recaída [8]. Silibina tiene una larga historia de uso para sus beneficios hepatoprotector, y por lo tanto, se podría utilizar junto con agentes quimioterapéuticos como hepatoprotector [8]. Además de reducir la toxicidad, silibina podría mejorar la eficacia de cáncer quimioterapéutico drogas [30]. En este sentido, hemos reportado que silibina sinergiza fuertemente las células humanas de carcinoma de próstata a doxorrubicina, cisplatino, carboplatino, y la inhibición del crecimiento inducida por la mitoxantrona y la muerte apoptótica [31] - [33]. efectos sinérgicos similares de silibina con doxorrubicina y cisplatino también se ha informado en varias otras líneas celulares de cáncer [34] - [37]. Otros elementos comunes que contribuyen de manera significativa a la carcinogénesis son la inflamación crónica y el estrés oxidativo [38]. Por lo tanto, se recomiendan las frutas y verduras que son ricas en antioxidantes, así como agentes anti-inflamatorios para las estrategias de quimioprevención del cáncer [38]. propiedades Silibina ha demostrado antiinflamatorias y antioxidantes [38], proporcionando una justificación adicional para su aplicación en la prevención e intervención cáncer.
Una de las principales limitaciones, que han obstaculizado la utilidad terapéutica de Silibina en el pasado, es su biodisponibilidad, que es en gran parte debido a su gran estructura de múltiples anillos y la baja solubilidad en agua [22]. Varias formulaciones silibina (fosfatidilcolina, nano-suspensiones, etc.) han sido probados para mejorar aún más su biodisponibilidad y estas formulaciones han mostrado una mejora significativa en la biodisponibilidad de Silibina [12]. Por ejemplo, la formulación de Silibina con fosfatidilcolina (conocido como 'Silipide', nombre comercial 'Siliphos') se puso a prueba en pacientes con cáncer de próstata y cáncer de colon y reveló biodisponibilidad plasmática elevada [9] - [11]. Otro enfoque hacia la mejora de la biodisponibilidad de silibin, así como la eficacia biológica es a través de química modificación /s adecuado en su estructura; en particular, la estructura de la silibina, así como el papel de sus restos funcionales están bien caracterizados en los últimos estudios [13], [18], [19]. En ese sentido, ya hemos sintetizado y caracterizado con éxito una serie de derivados silibina, identificado varios de ellos con antioxidante superior y las actividades anti-angiogénicos y los encontró soluble en agua, en comparación con el silybin [20] - [23]. Sobre la base de estos hallazgos importantes y en líneas similares, aquí estamos sintetizado y caracterizado Silibina otro derivado, a saber, el silybin 7,23-disulfato (DSS), que es un metabolito potencial Silibina en la Fase II de biotransformación, y se comparó la actividad anticancerígena silibinina con el DSS así como varios derivados silibina sintetizados anteriormente, tales como el DHS, 7OM, 7OG, 7OP, y 23OP. Los principales resultados de estos estudios de eficacia son: a) 7OG, el DHS, 7OM consistentemente mostró una eficacia anti-cáncer mejor que el silybin, mientras que los derivados silibina DSS, 7OP y 23OP mostraron menor o eficacia inconsistente; el apoyo a una relación estructura-actividad general; b) los isómeros ópticos puros de 7OG, DHS, y 7OM también ejercieron una mejor eficacia anti-cáncer en comparación con respectivos isómeros silibina (A y B); c) no había ninguna preferencia clara entre los isómeros A y B en términos de eficacia de Silibina o sus derivados; y d) la eficacia global de estos derivados silibina dependía tanto del tipo de grupo funcional presente, así como su localización espacial
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En resumen, los resultados de este estudio mostraron que la eficacia de la lucha contra el cáncer silibina podría mejorarse significativamente por medio de modificaciones adecuadas en su estructura química, e identificó 7OG, el DHS y 7OM como derivados silibina más eficaces. Este resultado está en línea con las observaciones anteriores que muestran que la sustitución en C-7 de la estructura Silibina mejora fuertemente su acción antioxidante y /o actividad antirradical. Además, dado que nuestros resultados con tres derivados silibina plomo fueron consistentes en tres líneas celulares de cáncer humano completamente diferentes, se sugiere que la actividad anti-cáncer observada en no teléfonos de línea específico.