Extracto
Fondo
Hedgehog (HH) de señalización juega un papel crítico en los procesos celulares normales, en el desarrollo gastrointestinal normal de los mamíferos y la diferenciación, y en la oncogénesis y mantenimiento del fenotipo maligno en una variedad de cánceres humanos. La evidencia creciente implica aún más la participación de la señalización de HH en la oncogénesis y el comportamiento metastásico de colon. Sin embargo, los enfoques genómicos para dilucidar el papel de la señalización de HH en los cánceres en general se carece, y los datos derivados de la señalización de HH en el cáncer de colon es extremadamente limitada.
Metodología /Principales conclusiones
Para identificar única objetivos de abajo de los genes GLI, los reguladores transcripcionales de la señalización de HH, en el contexto de carcinoma de colon, se empleó un inhibidor de molécula pequeña de ambos GLI1 y GLI2, GANT61, en dos líneas celulares de cáncer de colon humano, HT29 y GC3 /c1. Análisis del ciclo celular demostró la acumulación de las células tratadas con GANT61 en el G1 /S límite. cDNA microarrays de perfiles de expresión génica de los genes identificados 18.401 genes expresados diferencialmente (DEGs), tanto comunes y únicas a HT29 y GC3 /C1. Los análisis utilizando GenomeStudio (estadísticas), Matlab (mapa de calor), Ingenio (análisis de la vía canónica), o mediante qRT-PCR, p21 identificada
Cip1 (CDKN1A) y p15
INK4B (CDKN2B), que desempeñan un papel en la el G1 /S de control, como los genes regulados hasta en el G1 /S frontera. Los genes que determinan la progresión del ciclo celular en G1 /S incluyendo E2F2, la ciclina E2 (CCNE2), CDC25A y CDK2, y los genes que regulan el paso de las células a través de G2 /M (ciclina A2 [CCNA2], Cdc25C, la ciclina B2 [CCNB2], CDC20 y CDC2 [CDK1], se redujeron regulado. Además, nuevos genes implicados en la respuesta al estrés, respuesta al daño del ADN, la replicación del ADN y la reparación del ADN se identificaron después de la inhibición de la señalización de HH.
Conclusiones /Importancia
Este estudio identifica los genes que están involucrados en la proliferación celular HH-dependiente en las células de cáncer de colon, y después de su inhibición, los genes que regulan la progresión del ciclo celular y eventos aguas abajo del límite G1 /S.
Visto :.. Shi T, Mazumdar T, DeVecchio J, Duan ZH, Agyeman a, Aziz M, et al (2010) cDNA microarrays perfiles de expresión génica de erizo vía de señalización de inhibición en células de cáncer de colon humano PLoS ONE 5 (10): e13054. doi: 10.1371 /journal.pone.0013054
Editor: Terence Lee, Universidad de Hong Kong, china
Recibido: 6 Junio, 2010; Aceptado: 2 Septiembre 2010; Publicado: 1 de octubre 2010
Derechos de Autor © 2010 Shi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El apoyo financiero del Instituto Nacional del cáncer premios RO1 CA 32613 (JAH), RO1 108929 (JAH), y de la Cleveland Clinic. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Hedgehog (HH) de señalización juega un papel crítico en una variedad de procesos celulares normales. Es fundamental en la embriogénesis, la regulación de la transición epitelio-mesenquimal, el patrón de una amplia gama de estructuras de vertebrados en una variedad de órganos, el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos adultos, la reparación de tejidos, la proliferación celular, y en la supervivencia celular [1] , [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]. La vía canónica HH también es fundamental para el desarrollo normal de los mamíferos gastrointestinal, donde participa en la regulación coordinada de la diferenciación de las vellosidades intestinales normales [10], [11], [12]. Por lo tanto, en el tracto gastrointestinal normal, ligandos HH se inducen en las células diferenciadas alrededor de la superficie de las vellosidades, la generación de un bucle de realimentación negativa para inhibir la señalización de Wnt canónica en las células basales de la cripta, protegiendo así las células diferenciadas a partir de los efectos proliferativos de WNT [ ,,,0],13]. La activación de la vía de señalización de HH canónica comprende la unión de ligandos al receptor de HH membrana Patched (PTCH1), que se interioriza que conduce a la activación de la molécula de señalización Smoothened (SMO) a través de la liberación de la supresión mediada por PTC. SMO activa el árbitro final de la señalización de HH, la familia GLI de factores de transcripción que se unen al elemento de unión consenso GACCACCCA-como en secuencias de promotor para regular transcripcionalmente HH genes diana [3], [14], [15]. GLI1 y GLI2, los activadores de la transcripción de la señalización de HH, poseen distintas funciones, así como la superposición que implican activador del represor (gli2) Actividades [16] (GLI1 y gli2) o; Sin embargo, su papel en la regulación de los procesos de proliferación celular HH impulsado por, supervivencia o muerte celular son poco conocidos. Históricamente, GLI1 se ha considerado el marcador más fiable de la actividad de la vía HH, sin embargo GLI2 parece ser el activador primario de la señalización de HH, con GLI1 como un objetivo transcripcional de GLI2 [3], [7], dando lugar a aumento de la señalización de Hh tanto tanto cuantitativa como cualitativamente [16]. Una característica importante de las proteínas de GLI es que su actividad biológica es dependiente del contexto, influenciado por el entorno celular [17], [18].
La activación de la cascada de señalización de HH canónica se activa de forma aberrante y conoce bien para jugar un papel crítico en la oncogénesis y mantenimiento del fenotipo maligno en varios tipos de cánceres humanos. Dicha activación implica la amplificación de GLI1 o GLI2, las mutaciones en PTC o SMO, o la expresión génica desregulada [3], [4]; estas células malignas son también sensibles al inhibidor de molécula pequeña que se dirige a SMO, ciclopamina [4], [19], [20], [21], [22], [23]. Se cree que los carcinomas de colon que se derivan de la activación constitutiva de la señalización de WNT por la mutación del APC o genes β-catenina, mientras que la participación de la vía de señalización HH no es tan clara. En cánceres gastrointestinales, transcripcional de la regulación de ligandos HH ha sido identificado como el activador predominante de la señalización de HH en estas enfermedades (revisado en [3]). Además, hay pruebas de que la señalización de HH está implicado en la carcinogénesis de colon [24], [25], carcinoma de colon de células madre de auto renovación, y en el comportamiento metastásico de los cánceres de colon avanzados [26]. Sin embargo, los enfoques genómicos para dilucidar el papel de la señalización de Hh en el cáncer en general se carece de genes reguladores aguas abajo de GLI1 y GLI2 que funcionan en la proliferación celular, la supervivencia y el mantenimiento del fenotipo maligno HH permanecen caracterizan de manera incompleta [5], y derivan de datos en la señalización de Hh en el cáncer de colon es extremadamente limitada.
la proliferación celular es impulsado por la progresión de las células a través del ciclo celular que consiste en el paso secuencial a través de G1, S, G2 y M fases. quinasas dependientes de ciclina (CDK) asociado con las ciclinas para conducir la maquinaria del ciclo celular [27], [28]. De este modo, los asociados de CDK2 con ciclina E en la transición G1 /S y con la ciclina A durante la fase S, CDK4 y CDK6 se unen a la ciclina D durante la progresión en G1 /S, mientras que los complejos CDC2 con la ciclina A en G2, y con la ciclina B durante la transición G2 /M. miembros de la familia Cdc25 también regulan la progresión del ciclo celular a través de la desfosforilación de la CDK [29], [30]. inhibidores de CDK, incluyendo p21
Cip1 [29], [31] y p15
INK4B [[32], se unen a los complejos ciclina-CDK durante la transición del ciclo celular, en particular, en G1 /S (p21
CIP1, p15
INK4B; [32]) y G2 /M (p21
CIP1; [29]), y también puede inducir la detención del ciclo celular en la transición G1 /S del límite después de citostáticos señales a través de la inhibición funcional de la ciclina complejos de CDK. La familia E2F de factores de transcripción también regula la expresión de genes necesarios para la transición G1 /S, en particular los genes implicados en la activación de la maquinaria de replicación del ADN, y la reparación del ADN [33].
tecnología de cDNA microarray tiene proporciona la posibilidad de estudiar la expresión de miles de genes simultáneamente, y es una herramienta importante en la disección de las vías de transducción de señales. Para la cascada de señalización HH, /GLI expresión del gen diana HH ha sido examinado después de la estimulación de EGF [6] o GLI1 inducible [16] o GLI2 [9] la activación de genes en los queratinocitos humanos, o en la transformación celular GLI1 inducida por [7]. Para identificar objetivos de abajo únicas de los genes de GLI que funcionan en la proliferación celular en el contexto de carcinoma de colon, se empleó un inhibidor de molécula pequeña de ambos GLI1 y GLI2, GANT61, identificado en una pantalla de molécula pequeña basado en células de inhibidores de la mediada GLI1- la transcripción [34]. GANT61 actúa en el núcleo para bloquear la función GLI1, inhibe tanto GLI1- y GLI2- mediada por la transcripción, y demuestra un alto grado de selectividad para HH /GLI señalización [34]. Por lo tanto, GANT61 actúa aguas abajo de la ciclopamina (focalización SMO) para inhibir los determinantes finales de la regulación transcripcional HH.
En dos líneas celulares de carcinoma de colon humano HT29, y GC3 /C1, que inhiben la vía de señalización de HH usando GANT61 disminución de la expresión de GLI1, GLI2 y el receptor de ligando HH, PTCH1, y inhibió la proliferación mediante la inducción de la acumulación celular en la transición G1 /S frontera 24 hr después del tratamiento, se determinó por análisis de citometría de flujo. En el análisis se detalla el uso de perfiles de cDNA microarrays de expresión génica y cuantitativa PCR en tiempo real, p21
Cip1 (CDKN1A) y p15
INK4B (CDKN2B), que puede provocar la transición G1 /S de control, fueron hasta reguladas, mientras los genes que determinan aún más la entrada de G1 a la fase S incluyendo E2F2, la ciclina E2 (CCNE2), CDC25A y CDK2 se redujeron en la expresión. Concomitante con la disminución de G1 hasta la progresión de la fase S, disminución de la expresión de la ciclina A2 (CCNA2), Cdc25C, la ciclina B2 (CCNB2), CDC20 y CDC2 (CDK1), que regulan el paso de células a través de G2 /M también se demostraron. nuevos genes adicionales que están involucrados en la respuesta al estrés y la respuesta al daño del ADN, no identificada previamente después de la terminación de la HH de señalización en las células cancerosas humanas, incluyen los genes de respuesta temprana DDIT2 (GADD45G), DDIT3 (GADD153), DDIT4 (REDD1), PPP1R15A (GADD34) y ATF3 que fueron significativamente hasta reguladas. Los genes implicados en la síntesis y reparación del ADN (TYMS, TOP2A, TK1, Palo, Pôle2), y nuevos genes adicionales implicados en la progresión o daño en el DNA respuestas en fase S que fueron significativamente las reguladas, incluyen KIAA0101 (p15 [PAF]), replicación Factor C variantes de 2, 3, 4, 5, CDT1, la transcripción E2F factores de CDCA4 y TFDP1, MDC1, FANCD2, PCNA, y los genes implicados en la reparación del ADN, RAD51C (XRCC3), Rad54B, RAD51 y HELLS. Por lo tanto, este estudio ha identificado los genes que son regulados durante la terminación de la proliferación celular dependiente de HH y la supervivencia de las células del cáncer de colon, e involucra a los genes asociados con la detención /S en fase G1, el daño del ADN y las respuestas al estrés.
Resultados
GANT61 induce las reguladas expresión de los genes GLI y la acumulación de células humanas de carcinoma de colon en G1 /S
en HT29 y células c1 GC3 /tratados con GANT61 (20 M) durante un máximo de 48 hr, la expresión de los genes diana GLI1 y GLI2 eran tanto las reguladas, y también el ligando del receptor de HH PTCH1, según lo determinado por QRT-PCR (Figura 1A). Posteriormente, se trataron HT29 o GC3 /C1 células, por duplicado, con GANT61 (20 M) seguido por tinción con PI y análisis citométrico de flujo para la determinación de la distribución del ciclo celular entre las fases M (Figura 1B) G1, S y G2 /. En ambas líneas celulares, las células acumulan en G1, 24 hr después del tratamiento con GANT61. En las células HT29 GANT61 tratados, un aumento del 20% en las células en fase G1 se asoció con una disminución correspondiente en las células dentro de la fase G2 /M (14%) y en la fase S (5%), en consonancia con un G1 /S arresto puesto de control. En las células c1 GC3 /, un aumento del 8% en las células en fase G1 a las 24 horas después del tratamiento GANT61 también correspondió con una reducción similar en las células de la fase G2 /M del ciclo celular (Figura 1B).
Las células fueron tratadas durante un máximo de 48 horas con GANT61 (20 M) o con DMSO (control del vehículo) 0,2%. (A) QRT-PCR de GLI1, Gli2 y PTCH1 genes de vez 0-48 hr. (B) Se extrajo el ADN a las 24 horas después del tratamiento, se tiñeron con yoduro de propidio, y posteriormente se analizó para los efectos de la inhibición de la señalización de HH en la distribución de fase de las células dentro del ciclo celular por citometría de flujo.
cDNA microarray análisis de identificar los cambios en la expresión de genes comunes y únicas a HT29 y GC3 /c1 después del tratamiento GANT61
para delinear los cambios en la expresión génica en células HT29 y líneas celulares de carcinoma de colon humano /C1 GC3 en respuesta al tratamiento con el antagonista GLI1 /GLI2, GANT61, la expresión de 18.401 genes humanos se perfila en las células de control tratadas con vehículo (0,2% DMSO) y en células tratadas con GANT61 (20 M) durante 24 horas. Los genes con un descubrimiento tasa de falsos (FDR) -adjusted valor de p & lt; 0,001 y doble cambio & gt; 1,5 genes fueron considerados expresados diferencialmente (DEGs) inducidas por GANT61 en relación con el control del vehículo, de los cuales 1.368 genes se expresan en forma diferente HT29 y 1.002 genes en GC3 /C1 células (Figura 2). 755 genes o 558 genes fueron reguladas, y 613 o 444 genes fueron regulados hacia abajo, en HT29 y las células c1 GC3 /, respectivamente. 763 y 397 genes fueron expresados diferencialmente y único para HT29 o GC3 /C1, respectivamente. De los 763 DEGs únicas para HT29, 459 (60%) fueron reguladas y se redujeron reguladas 304 (40%). Del mismo modo, de los 397 DEGs únicas para GC3 /C1, 262 (66%) fueron reguladas y 135 (34%), el regulado. Por el contrario, 605 genes que representan el 3,4% de todos los genes son expresados diferencialmente que eran comunes a ambas líneas celulares; de éstas, 296 fueron reguladas (49%), y 309 (51%) se redujeron regulado (Figura 2). Todos los genes comunes a ambas HT29 y GC3 /C1 que fueron significativamente hasta reguladas o hacia abajo reguladas (p & lt; 0,001). Se enumeran en las Tablas 1 y 2, respectivamente
Las células fueron tratadas con GANT61 (20 M) o vehículo solo (0,2% DMSO) durante 24 horas, y el ARN total extraído como se describe en Materiales y Métodos. Los cambios en la expresión génica se determinaron mediante microarrays de cDNA de genes de perfiles utilizando la iluminación Humano-ref8 V3.0 bolas de serie-Chip. Los genes con una tasa de falso descubrimiento (FDR) -adjusted valor de p (p & lt; 0,001) y doble cambio & gt; 1,5 se consideraron DEGs. Panel superior: Los genes regulados. Panel inferior: reguladas por los genes. Expresión diferencial para el total, únicas DEGs-regulado hasta reguladas, único regulados hacia abajo, común hasta reguladas y comunes, se muestran.
La modulación de la señalización canónica vías siguientes inhibición de la señalización de HH
los genes con cambios significativos en la expresión después del tratamiento GANT61 fueron asignados a diferentes vías de señalización canónica y se sometieron a análisis Ingenuity Pathway (IPA), donde el resultado 1.368 DEGs en HT29 y 1.002 DEGs en GC3 /c1 fueron asignadas a redes definidas por la base de datos IPA (Figura 3). Para los DEGs mapeadas incluyendo tanto los genes regulados arriba y hacia abajo, los 15 más significativamente alterados vías canónicas en HT29 demostraron -log (p-valor) que van desde 2,045 hasta 9,025, y en GC3 /c1 2,32 a 7,509. De las 15 vías de participación de los genes regulados significativamente hacia abajo, 12 fueron comunes a ambas líneas celulares. Las 3 vías comunes con la mayor tasa de expresión abajo reguladas incluyen genes implicados en la respuesta al daño del ADN, control de punto de control, y la mitosis. Otras vías de las reguladas involucrado el G1 /S y G2 /puntos de control de ADN M dañar el metabolismo precursor de ADN, y la señalización celular que involucra diferentes vías, incluyendo los implicados en el cáncer, que también demuestran 3 firmas única para cualquiera HT29 o GC3 /C1 (Figura 3 ). De las 15 vías de participación de genes que son los más significativamente hasta reguladas, 8 son comunes a ambos HT29 y GC3 /c1, y 7 representan vías únicas para cada línea celular, lo que demuestra una mayor diversidad en los patrones de hasta reguladas expresión de genes (Figura 3 ). Las vías regulados hasta comunes a ambas líneas celulares incluyen el tales como esteroides, piruvato, glutatión glucólisis, o glicerolípido, y no directamente relacionados con el control de la proliferación celular relacionados con el metabolismo.
Las 15 mejores vías de señalización canónica , determinado por el IPA, que fueron significativamente hasta reguladas o las reguladas por el tratamiento GANT61 en HT29 y células GC3 /C1, se muestran. Los 1.368 DEGs en HT29 y 1.002 DEGs en GC3 /c1 fueron asignadas a la red definida IPA-. El p-valores de significación que determinan la probabilidad de que la asociación entre los genes en el conjunto de datos y la vía canónica es por pura casualidad se calcularon mediante la prueba exacta de Fisher, y se expresan como -log (p-valor). A. Rutas con enriquecidas genes regulados. B. Procesos con enriquecidas hasta los genes regulados. Azul: Caminos comunes a ambos HT29 y GC3 /C1. Rojas: Pathways únicas a cualquiera HT29 o GC3 /C1. cuadrados amarillos.: Relación entre el número de DEGs que se asignan a una vía canónica específica dividido por el número total de genes que componen esa vía
Los genes que muestran patrones de cambio diferenciales veces en HT29 tratadas y GANT61 GC3 células /C1
Doblar patrones de cambio de más altamente DEGs en HT29 y GC3 /C1, se seleccionaron analizan y se muestran en un mapa de calor para evaluar y comparar la similitud y diferencias en la expresión diferencial entre las dos líneas de células tratadas con GANT61 (Figura 4). Además de los genes con diversas funciones que no están directamente relacionados con la proliferación HH-dependiente, hasta reguladas genes que influyen en la transición G1 /S y la posterior progresión del ciclo celular, y que son comunes a ambas líneas celulares, incluyen CDKN1A, y el ADN transcripciones; daño inducibles 3 y 4 (DDIT3 y DDIT4). A considerablemente mayor número de genes implicados en la proliferación celular y la transición del ciclo celular a través de la G1 /S límite, la progresión de la fase S, y la transición G2 /M, fueron significativamente reducido regulado en la expresión, y comunes a ambas líneas celulares. Estos incluyen CDC6 (que participan en G1 /S), tres genes que impulsan la entrada y paso a través de la fase S (CCNE2, E2F2) y G2 (CCNA2), los genes implicados en la replicación y reparación del ADN (TYMS, Palo, TOP2A, TK1, Pôle2), y dos genes que regulan la mitosis (AURKB, Cdc20;. Figura 4, asteriscos)
El mapa de calor se generó en Matlab (Mathworks), y compara patrones de plegado de cambio de los DEGs más altamente en HT29 y células GC3 /C1 después del tratamiento GANT61. Los más altamente DEGs demostraron una expresión diferencial valor de p de p & lt; 0,001 entre el control de vehículo (0,2% DMSO) y las células tratadas con GANT61. Panel izquierdo (rojo): hasta los genes regulados. Panel derecho (verde): reguladas por los genes. Los genes marcados con asteriscos definen los genes con funciones específicas en G1 /S de transición, la progresión de la fase S, la replicación del ADN o reparación, o la regulación de la G2- o transiciones de fase M-. Doblar los cambios de todos los DEGs-regulado y todos menos uno hasta reguladas DEG son ≤8 (barra del espectro de color central).
De los 296 genes regulados, además de los genes representados comparablemente en el mapa de calor que incluyen DDIT3 (GADD153) y DDIT4 (REDD1), también se identificaron las transcripciones adicionales de daños-inducible novela de ADN e incluyen DDIT2 (GADD45G), PPP1R15A (GADD34) y ATF3 (Tabla 1). TP53INP1, que puede regular la detención del ciclo celular, y TP53INP2, identificado en las respuestas de muerte celular, fueron también hasta reguladas. De los 309 genes significativamente las reguladas en respuesta a GANT61, nuevos genes identificados incluyen KIAA0101 (p15 [PAF]), factor de replicación C variantes de 2, 3, 4, 5, CDT1, la transcripción E2F factores CDCA4 y TFDP1, MDC1, PCNA , FANCD2, y los genes implicados en la reparación del ADN, RAD51C (XRCC3), Rad54B, RAD51 e infiernos (Tabla 2).
genes expresados diferencialmente implicadas en la transición G1 /S y G2 /M transición
para evaluar más a fondo los genes implicados en el control de la progresión del ciclo celular en células de carcinoma de colon humano después del tratamiento GANT61, 10 genes implicados en la transición G1 /S o G2 /M transiciones, identificado por el IPA, se seleccionaron un examen más detenido. Genes necesarios en la transición G1 /S frontera de transición G1 /S, o para la inducción de un /S de control G1 siguientes señales citostáticos, incluyen los dos inhibidores de quinasas dependientes de ciclina, p21
Cip1 (CDKN1A) y p15
INK4B (CDKN2B), que fueron hasta reguladas por 5.2- y 3.1-canales, 24 horas después de la administración GANT61 (Tabla 3). genes adicionales requeridos para la transición G1 /S que se redujeron reguladas incluyen la transcripción E2F2 E2 Factor (-4,2 veces), y otros genes críticos que se redujeron regulado por 2.1- 3.2- a veces, incluyen la ciclina E (CCNE2) , CDK2 y CDC25A. En G2 /M, GANT61 indujo el regulado expresión de CCNA2 (ciclina A2), la ciclina B1 (CCNB1), ciclina B2 (CCNB2), CDK1 (CDC2), y cdc25C por 2.3- a 3.1- veces (Tabla 3).
para determinar la robustez de los microarrays de genes de perfiles de expresión de ADNc después del tratamiento de células HT29 y GC3 /C1 con GANT61 (20 M) durante 24 horas, se empleó QRT-PCR para determinar cambios en la expresión de los seleccionados grupo de 10 DEGs determinados a partir de los microarrays de ADNc. Los genes involucrados y los cebadores sintetizados se muestran en la Tabla 4. QRT-PCR se realizó en ADNc generado utilizando ARN total aislado de forma independiente a partir HT29 tratadas con GANT61 y GC3 /C1 células de 0 h, 16 h, 24 h, 38 h y 48 h después del tratamiento. GAPDH se utilizó para normalizar todos los datos de QRT-PCR. Los genes determinados por QRT-PCR incluyen la expresión de E2F2, CCNE2, CDC25A y CDK2 en G1 /S, lo que se redujeron regulado, sobre regulación de CDKN1A y CDKN2B en G1 /S, y la baja regulación de CCNA2, Cdc25C, CCNB2 , y CDK1 en G2 /M (Figura 5). El plano reguladas o las reguladas cambios en la expresión génica después del tratamiento GANT61 y determinado por un perfil de cDNA microarray, fueron confirmados por qRT-PCR (Figura 5).
Las células fueron tratadas con vehículo (DMSO al 0,2%) o GANT61 (20 M) durante 16 horas, 24 horas, 38 horas o 48 horas. El ARN total se extrajo y QRT-PCR se realizó como se describe en Materiales y Métodos utilizando los conjuntos de cebadores enumerados en la Tabla 2. Los datos representan la media ± SD de 4 determinaciones, y GAPDH se utilizó para normalizar los niveles de ARNm relativos.
Discusión
la vía de señalización HH se activa en una variedad de cánceres humanos siguientes mutaciones en los genes que regulan la señalización canónica HH, incluyendo el receptor de PTC, y la molécula de señalización de HH, SMO, y también puede ser activado a través de la regulación transcripcional de los ligandos HH (revisado en [3]). Esta vía se está convirtiendo cada vez más importancia debido a hacerse una idea de su papel prominente en muchos procesos de desarrollo, y en el mantenimiento del fenotipo maligno en una amplia variedad de cánceres humanos, cuyo crecimiento se ha encontrado para ser impedido por la inhibición selectiva de constitutiva HH actividad de la vía [14], [35], [36]. Los tumores del cerebro, próstata, piel, páncreas y riñón han demostrado el requisito para la señalización de HH-GLI, y han respondido a la inhibición de la señalización de Hh molécula diana SMO por ciclopamina o SMOshRNA [4], [19], [20] [21], [22], [23].
los activadores de la transcripción en la señalización de HH comprenden los miembros de la familia de factores de transcripción GLI, GLI1 y GLI2, que tienen tanto distinta, así como la superposición de funciones [16, ]. La activación de las proteínas de GLI es un proceso complicado que implica modificaciones y las interacciones de una serie de reguladores de la vía positivos y negativos y no se entiende completamente [1], [14], [35]. Los genes diana regulados por la vía de señalización de HH difieren entre tejidos y tipos de células, así como siendo influenciados por la presencia o ausencia de factores reguladores co-expresada con proteínas de GLI que finalmente determinan los programas transcripcionales activados por la señalización de Hh [6], [37 ]. Por lo tanto, las rutas de señalización oncogénicas convergen en la señalización de HH canónica en el nivel de los factores GLI de transcripción y, además, en los genes diana de GLI1 y GLI2 para impulsar aún más la vía de señalización de HH en la supervivencia celular en tumores malignos [6], [7], [20 ], [38], [39], [40]. Por tanto, el fenotipo de señalización HH es influenciado de manera significativa y en última instancia determinada por la co-expresión de factores reguladores adicionales, y por lo tanto por el contexto celular de la expresión génica.
señalización HH juega un papel en el programa de diferenciación de las vellosidades intestinales normales [11], [12], [41], y se ha sugerido recientemente que las células epiteliales de cáncer de colon humano muestran un eje de señalización de HH-GLI en el proceso de la carcinogénesis [24], [25]. La expresión de componentes de la vía HH-GLI se demostró consistentemente en un análisis de 40 carcinomas primarios humanos de colon y tumores metastásicos en el hígado [26], en consonancia con las conclusiones de los investigadores anteriores [25], [42], [43]. Por lo tanto, el uso de QRT-PCR, la expresión de GLI1, PTCH1, GLI2 y SHH se determinó en todos los carcinomas de colon humanos examinados. El requisito de que tanto GLI1 y GLI2 para la proliferación sostenida y la supervivencia de las líneas celulares de carcinoma de colon humano in vitro, incluyendo HT29, se demostró utilizando la tecnología de siRNA [26]. Además, desmontables de SMO por SMOshRNA impidió el crecimiento de células HT29 en ratones SCID, mientras que los xenoinjertos subcutáneos HT29 en peso respondieron a ciclopamina por la reducción en el volumen del tumor [26]. Así, la activación canónica de GLI1 y GLI2 través de SMO es importante para la supervivencia y la proliferación de células de carcinoma de colon humano in vivo.
En el estudio actual, la función tanto de GLI1 y GLI2 aguas abajo de SMO se inhibió en el presencia de GANT61, un inhibidor de molécula pequeña que se identificó a partir de una pantalla basada en células para inhibir específicamente la transcripción GLI1 mediada, pero que también inhibió la función de GLI2 [34]. Este agente fue seleccionado para inhibir específicamente los árbitros finales de HH de señalización, los factores de transcripción GLI, en la elucidación de los genes diana aguas abajo que determinan la proliferación HH-dependiente en células de carcinoma de colon humano. Dos líneas celulares, bien caracterizados en nuestros laboratorios, HT29 y GC3 /c1, fueron tratados con GANT61 (20 M) durante 24 horas, y la expresión de GLI1, GLI2 y ARNm PTCH1 se redujo reguladas. Además, los efectos sobre la proliferación celular según lo determinado por la distribución de células en el análisis del ciclo celular y citometría de flujo demostraron la acumulación de células en G1 después del tratamiento, con una disminución concomitante de las células del compartimiento de G2 /M, y en el caso de HT29 , también de la fase S, lo que sugiere la inducción de un G1 /S de control.
HT29 y células GC3 /C1 fueron tratados posteriormente con GANT61 (20 M) durante 24 horas, se extrajo el ARN, y los cambios en el gen la expresión se determinaron por Illumina cDNA microarrays de perfiles. Después de los análisis estadísticos, 1.368 genes en HT29 y 1.002 genes en GC3 /c1, se determinaron para ser modulada significativamente por el tratamiento GANT61 (FC & gt; 1,5; p & lt; 0,001). Para los genes que son regulados hasta en la expresión, 296 genes eran comunes a ambas líneas celulares, y por reguladas por los genes, 309 genes eran comunes a ambas líneas celulares. El bloqueo de las células en el G1 /S frontera se evidencia por la expresión regulada hasta de p21
Cip1 y p15
INK4B que, en parte, regular la transición G1 /S. p15
INK4B es un miembro de la familia Ink4 de inhibidores de CDK, es inducida en respuesta a señales citostáticos [32], [44], y los complejos con la ciclina D /CDK4 o la ciclina D /CDK6 para mediar detención de la fase G1 a la transición G1 /S en ciertos sistemas [30], [32]. p21
Cip1 se puede unir una amplia gama de complejos de ciclina-CDK, con una preferencia por los que contienen CDK2 (revisado en [31], [45], y durante un ciclo normal de las células, facilita la formación de complejo activo de ciclina-CDK para promover la proliferación celular. Sin embargo cuando se sobreexpresa, p21
Cip1 forma un complejo inhibidor con la ciclina e /CDK2, que conduce a G1- y fase de la detención en consecuencia S-, formando de este modo la transición G1 /S de control [46], [47]. la programado momento de la expresión de las ciclinas e, a y B que impulsan la progresión del ciclo celular, se refleja en los cambios importantes en las fases del ciclo celular. ciclina e se expresa a niveles máximos en las células sometidas a la G1 a S transición, la disminución durante S- progresión de la fase, de tal manera que las células G2 /M son la ciclina e-negativas (revisado en [30]). ciclina a se expresa a finales de G1, demuestra la expresión pronunciada durante la fase S, y aumenta a medida que las células avanzar hacia G2, con degradación en principios de la mitosis; tipo B ciclinas comienzan a ser expresada en S de fase tardía, y conducen las células aunque G2- y M- fases del ciclo celular [30]. CDK2 controla la transición G1 /S por complejación con la ciclina E, y se activa por CDC25A, que desfosforila CDK2 [48]. CDC2 controla la entrada en la mitosis celular en la transición G2 /M, formando de este modo complejos con CICLINAS A y B, se activa por cdc25C, y es regulada hacia abajo a finales de la fase M [29]. Todos estos genes se redujeron reguladas en la expresión en respuesta a la inhibición de la función GLI1 /GLI2 (Tabla 2). Por lo tanto, las señales provocadas para promover la acumulación celular en G1 /S de plomo a la represión de genes que regulan la progresión del ciclo celular, y p21
expresión Cip1 se ha demostrado para agotar la expresión de genes que regulan la replicación y reparación del ADN, y la mitosis [49], [50], [51]. En el estudio actual estos genes incluyen CDC6 (activa en la transición G1 /S y esencial para la iniciación de la replicación del ADN), TYMS, TOP2A, TK1, poste y Pôle2 (fase S), y AURKB y CDC20 (mitosis [52] , [53]), determinado por análisis de mapa de calor. Una representación esquemática de los genes implicados en la inhibición inducida por GANT61 de la progresión del ciclo celular en la progresión /S, S-fase G1, y la regulación durante G2- y M-fases, identificados a partir de cDNA microarrays, análisis de mapa de calor, y por QRT-PCR , se muestra en la Figura 6, y consiste en 5 de las 12 vías de señalización comunes determinados por análisis de IPA
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Desde cDNA microarray, mapa de calor, y analiza QRT-PCR, los genes implicados en las diferentes fases del ciclo celular, incluyendo la transición G1 /S, y la progresión a través de S-G2- y fases M-, se muestran. Los genes identificados incluyen inhibidores de CDK, miembros de la CDK y ciclinas, las familias de los CDC, los genes implicados en la replicación y reparación del ADN y los genes que regulan el huso mitótico, e involucran a 5 de las 12 vías de señalización comunes que se determinen por el análisis de IPA. Rojo: Los genes regulados. Verde: hacia abajo de los genes regulados. → cortina ligera sombra oscura, el aumento de la expresión diferencial.
microarrays de genes de ADNc Integral análisis de los genes que determinan el fenotipo de señalización de HH se ha llevado a cabo sólo en modelos de células no cancerosas de perfiles. En estos sistemas, la activación GLI ha sido estimulado por el tratamiento de EGF [6], GLI1 estable o expresión HA-RAS [7], o la expresión de GLI2 constitutivamente activado [16]. En estos estudios, la ciclina D [6], [7], GADD153 [7], CDKN2B, CDKN1A, CDK2, PCNA, TOP2A, CCNB1, XRCC1 [16], han sido identificados como genes activados aguas abajo de GLI.