Extracto
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es un trastorno de la inflamación crónica con una mayor susceptibilidad a colorrectal cáncer. La etiología de la IBD no es clara, pero se cree que el resultado de una respuesta inmune adaptativa e innata dysregulated a los productos microbianos en un huésped genéticamente susceptible. Toll-like receptor (TLR) de señalización inducida por bacterias comensales intestinales juega un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis intestinal, la inmunidad innata y la mejora de la integridad celular del epitelio intestinal (IEC). Sin embargo, el papel de TLR2 en el desarrollo de cáncer colorrectal no se ha estudiado. Hemos utilizado el modelo OMA-DSS para el cáncer colorrectal asociado con la colitis (CAC) de tipo salvaje (WT) y TLR2
- /- ratones. Los dos puntos cosechados de WT y TLR2
- /- ratones fueron utilizados para histopatología, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia y análisis de citoquinas. Los ratones deficientes en TLR2 desarrolló significativamente más grandes y los tumores colorrectales que sus controles WT. Ofrecemos pruebas de que epitelio del colon de TLR2
- /- ratones han alterado la respuesta inmune y la proliferación desregulada en condiciones de estado estacionario y durante la colitis, que conducen a las señales de crecimiento inflamatorias y predisposición al crecimiento neoplásico acelerado. En los primeros puntos de tiempo evaluados, TLR2
- /- colones exhiben un aumento significativo en los focos de criptas aberrantes (FCA), dando lugar a tumores que se desarrollaron antes y se hizo más grande. Además, el microambiente intestinal reveló niveles significativamente más altos de IL-6 y IL-17A concomitante con el aumento de fosfo-STAT3 dentro de ACF. Estas observaciones indican que en la colitis, TLR2 desempeña un papel protector contra el desarrollo de la CAC
Visto:. Lowe EL, Crother TR, Rabizadeh S, Hu B, H Wang, Chen S, et al. (2010) Toll-like receptor 2 de señalización protege a los ratones del desarrollo de tumores en un modelo murino de cáncer de colitis inducida. PLoS ONE 5 (9): e13027. doi: 10.1371 /journal.pone.0013027
Editor: Kathleen A. Kelly, Universidad de California en Los Angeles, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Junio, 2010; Aceptado: 30 Agosto 2010; Publicado: 27 de septiembre 2010
Derechos de Autor © 2010 Lowe et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de los Institutos nacionales de Salud (AI-058128 suplemento a MA) y Donna y Jesse Garber Dotación (a KSM y MA). Además, K.S.M. Actualmente con el apoyo de las Crohn y Colitis Foundation of America. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la inflamación crónica y el cáncer se entrelazan, especialmente en el intestino, como se ve en la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD). IBD se piensa que es el resultado de una ruptura en la barrera epitelial, seguido de respuestas inapropiadas a los productos microbianos que resulta en la inflamación crónica en un huésped genéticamente susceptible [1]. IBD se asocia con un mayor riesgo de cáncer colorrectal y ahora se cree comúnmente que la inflamación crónica en estos pacientes conduce a la transformación neoplásica del epitelio intestinal [2]. inmunidad intestinal adecuado se basa en un equilibrio entre la inmunosupresión y respuestas proinflamatorias apropiadamente sincronizada con las respuestas inflamatorias de protección. citocinas y quimiocinas proinflamatorias que se producen durante la inflamación intestinal crónica en respuesta a las bacterias comensales crean un microambiente que mejora la proliferación celular, la supervivencia celular y la angiogénesis, promoviendo así la tumorigénesis [3].
células epiteliales intestinales (IEC) actuar como la primera línea de defensa mediante la creación de una barrera contra los microbios. Los receptores inmunes innatas que pertenecen a la familia de receptores de tipo Toll (TLR) ayudan aún más IEC para distinguir al amigo del enemigo entre el medio complicado de microbios. Hay un creciente cuerpo de evidencia para apoyar un papel importante para la señalización de TLR en el mantenimiento de la homeostasis intestinal [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Los ratones ablación de TLR2, TLR4, TLR9, o su molécula adaptadora común MyD88, eran más agudamente susceptibles a la colitis inducida por la sustancia química colitogen sulfato de sodio dextrano (DSS), debido en parte a respuestas protectoras deteriorados y la reducción de la producción de prostaglandina [7], [ ,,,0],8], [9], [10], [11]. El tratamiento con antibióticos se agravó la colitis inducida por DSS en MyD88
- /- ratones y reparación del epitelio impedido, lo que indica la señalización de TLR en general se requiere para la renovación adecuada IEC. De hecho, el tratamiento con TLR2 [8] y TLR9 [12] ligandos durante la administración de DSS mejorado daños cripta y aceleró la curación. la señalización de TLR2-comensal conserva la resistencia transepitelial, promueve las células caliciformes la secreción de mucina, y mantiene la homeostasis dentro IEC [8], [13], [14], [15]. Por último, debido a sus tendencias a una inclinación hacia las respuestas Th2 [16], [17], [18], [19] y mejorar la supervivencia de las células T reguladoras [20], [21], [22], la señalización de TLR2 podría jugar un importante papel en el mantenimiento de un entorno de supresión en el colon.
Varios estudios han implicado señalización TLR en la tumorigénesis intestinal. En múltiples neoplasia intestinal ratones (Min), pérdida de MyD88 señalización reducido número de tumores y tamaños que sugieren que la señalización de MyD88 contribuye al crecimiento del tumor y la progresión [23]. En un modelo diferente, la incidencia de tumores, la multiplicidad y el tamaño se redujo después de azoximetano (AOM) y el tratamiento DSS cuando TLR4 se realizó ablación en ratones a través de la reducción de la expresión de TLR4 y la señalización en la IEC [24], [25]. Además, la colitis y tumores colorrectales colitis asociada (CAC) generan espontáneamente en IL10
- /- ratones se puede mejorar si los ratones se mantienen en condiciones libres de gérmenes [26] o al mismo tiempo ablación de TLR4 [27]. En conjunto, estos estudios apoyan que el desarrollo CAC depende del reconocimiento TLR intestinal de bacterias comensales. A pesar de los papeles evidentes de TLR2 en la homeostasis de la IEC y la mejora de la tolerancia en el microambiente de la lámina propia [28], [29], ningún estudio ha dilucidado el papel que TLR2 podría desempeñar en la transformación de las células epiteliales intestinales que conducen a tumores intestinales.
Aquí se demuestra que los ratones deficientes en TLR2 se desarrollan cada vez más grandes tumores de colon que los ratones de control WT después del tratamiento AOM-DSS. el desarrollo de tumores del colon mejorada se pone de manifiesto desde el principio por un aumento significativo de los números de focos de criptas aberrantes (ACF) y el aumento de IL-6, IL-17A, TNFa y phosphoSTAT3 expresión en el microambiente intestinal de TLR2
- /- ratones, en comparación con WT ratones. Nuestros resultados demuestran que TLR2 es un factor protector importante en la homeostasis del epitelio intestinal y proporcionan importantes conocimientos sobre un papel previamente no reconocido de la señalización de TLR2 en el CAC.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y protocolos aprobados IACUC (# 2838) del Comité de Cuidado de Animales y el empleo Cedars-Sinai Medical Center Institucional y se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos.
Animales
Helicobacter negativo de tipo salvaje C57BL /6J y TLR2
- /-. (encendido /6J fondo C57BL) se obtuvieron ratones del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME)
la inducción de tumores (figura 1A)
cáncer colorrectal asociado con la colitis
(CAC) se indujo como se describe anteriormente [30]. En pocas palabras, de 6-8 semanas de edad ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal (IP) con 12,5 mg /kg azoximetano (AOM; Sigma-Aldrich Chemical Co, St. Louis, MO). Después de 5 días, los ratones recibieron 2,5% de sodio sulfato de dextrano (DSS; MP Biomedicals, Solon, OH, el peso molecular de 35.000-50.000 kDa) de agua durante 5 días, seguido de 16 días de agua potable regular. Los ratones se sometieron a dos ciclos de DSS, seguido de un tercer ciclo con 2% de agua DSS administrado durante 4 días, seguido de agua normal durante 10 días. En el día de inyección de ratones AOM 61 enviar fueron inyectados IP con 100 mg /kg 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU, Sigma-Aldrich Chemical Co, St. Louis, MO) y se sacrificaron 2,5 h más tarde. Para observar los pasos de transformación más tempranos de la CAC, los ratones se sacrificaron 4 días después de la finalización del primer ciclo de DSS (14 días después de la otitis media aguda). El curso clínico de la enfermedad se controló por medición del peso corporal, la observación de sangrado rectal, diarrea y heces con sangre durante el tratamiento DSS
.
(A) Esquema general del modelo de CAC. Después de la inyección inicial AOM (12,5 mg /kg), DSS se da en el agua de bebida (áreas enmarcadas) seguido de agua potable regular. Los ratones se sacrificaron el día 14 o inyección AOM 61 post (Día 61: n = 19 WT, n = 21 TLR2
- /- ratones). (B) Porcentaje de cambio de peso durante el tratamiento AOM-DSS. mortalidad (C) del ratón durante los tratamientos de AOM-DSS. (D) Número de tumores colorrectales por ratón inducida por el tratamiento AOM-DSS en el día 61. (E) Número de tumores por ratón situado en proximal o distal en dos puntos WT o TLR2
- /- ratones. (F) La distribución de tamaño de los tumores colorrectales formados en WT o TLR2
- /- ratones. (G) La carga tumoral en AOM-DSS tratados WT o TLR2
- /- ratones. Todas las pruebas se realizaron con intervalos de confianza del 95%. Los datos se expresan como medias ± SEM. * = P & lt; 0,05, ** = p & lt; 0,01, *** = p. & Lt; 0,001
Análisis histológico para la colitis y la displasia
dos puntos enteros se lava con PBS y flash -frozen en la orientación brazo de gitano. secciones 7-micras se recogieron a lo largo de la profundidad del colon usando un criostato y se tiñeron para hematoxilina y eosina (H & amp; E: Sigma-Aldrich). alteraciones histopatológicas en la colitis e inflamación fueron anotados por un patólogo (HW) que desconocía los genotipos utilizando los siguientes sistemas de puntuación. Los datos se presentan en la sección de resultados como "valoración de la inflamación en general", que representa la suma de las puntuaciones otorgadas por "extensión y gravedad de la infiltración de leucocitos" "inflamación" y "porcentaje de participación de los dos puntos". La definición y la puntuación de estos subcriterias son los siguientes:
La inflamación fue definido y evaluado como
: (0) Ninguno de los agregados linfoides normales; (1) El aumento de los agregados linfoides; (2) criptitis (neutrófilos dentro de epitelio de las criptas); (3) Cripta absceso (acumulación de neutrófilos dentro del lumen de las criptas, a veces con la ruptura cripta); (4) La ulceración (pérdida de componentes de la mucosa y la presencia de tejido de granulación).
grado de infiltración de leucocitos se anotó como
: (0) Ninguna; (1) infiltración confinada a la mucosa; (2) la infiltración se extiende hasta la submucosa; (3) la extensión transmural del inflitration.
La gravedad de la infiltración de leucocitos fue anotado basada en el número de células infiltrantes como
: (1) leve; (2) moderado; (3) severo.
Porcentaje de Participación de colon se anotó como
: (0.25) si 1-25% del colon estaba implicado; (0.50) Si 26-50% del colon estaba implicado; (0.75) Si 51-75% del colon estaba implicado; (1.00) si 76-100% del colon estaba involucrado. Por otra parte, también hemos marcado el "
medida necrosis
" en el colon de la siguiente manera: (1) = 25%, (2) = 50%, (3) = 75%, (4) = 100% . Se identificaron las neoplasias y también anotaron por gravedad (adenoma o carcinoma
In situ
). La carga tumoral en los ratones fue determinada por la suma de las áreas de todos los tumores por ratón
BrdU y la tinción de TUNEL
todas las neoplasias observadas por H & amp;. E se confirmaron después de BrdU tinción utilizando BrdU
In-Situ
kit de detección (BD Pharmingen, San Diego, CA) según el protocolo sugerido por el fabricante. La apoptosis se detectó utilizando el
In Situ
Detección de Muerte Celular fluoresceína Kit (Roche, Indianapolis, IN), a contratinción con DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se cuantifica por la intensidad de fluorescencia por campo enfoque utilizando ImagePro Plus (Cibernética Medios , Silver Spring, MD). Regiones proximal y distal de cáncer de colon fueron examinados utilizando más de tres campos de enfoque por región en al menos cuatro diapositivas por animal.
inmunofluorescencia
Las secciones congeladas se fijaron en formalina al 10%. Los cortes teñidos para antígenos nucleares se fijaron más en el 100% de metanol. Anti-fosfo-Stat3 y anti-ß-catenina (ambos de Cell Signaling Technology, Danvers, MA) anticuerpos se incubaron durante 48 horas a 4 ° C seguido de incubación con anticuerpo de cabra anti-conejo-568 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Biotinilado anti-nitrotirosina (Cayman, Ann Arbor, MI) se incubó durante la noche a 4 ° C seguido de incubación con estreptavidina-594 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Todas las diapositivas se counterstained con DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células positivas se contaron en más de cinco campos de enfoque en al menos cuatro diapositivas por animal y la intensidad fosfo-STAT3 nuclear se midió usando ImagePro Plus.
Aislamiento y tratamiento de células mononucleares de la lámina propia (CMLP) y mesentérica de ganglios linfáticos Las células (MLN) guía
Para obtener células LP, dos puntos enteros fueron lavarse a fondo con PBS enfriado con hielo. piezas de dos puntos se incubaron en HBSS One-mm suplementado con DTT 1 mM, EDTA 3 mM, HEPES 20 mM con agitación a 37 ° C durante 20 min. piezas de colon se lavaron con HBSS, seguido de incubación en tampón de disociación (0.075 U /ml Blendzyme 3, 1,5 U /ml dispasa II, 0,5 mg /ml, calcio DNasa I [todos los diagnósticos de Roche, Mannheim, Alemania], HEPES 20 mM 1,3 mM cloruro) con agitación a 37 ° C durante 50 min. Los dos puntos digeridos se sometieron a vórtice brevemente y se disocian más con el aumento de agujas de calibre, se pasan por un tamiz de 40 micras de células y se lavaron con PBS. Después de la centrifugación, el sedimento celular se resuspendió en una solución de Percoll 45% y colocó sobre una solución de Percoll 72%. Las células situadas en la interfase se recogieron en un tubo limpio y se lavaron varias veces. MLN fueron aplastados entre portaobjetos de vidrio y se lavó con PBS. La suspensión de células se pasó por un filtro de células de 40 micras y se lavó con RPMI. linfocitos aislados se resuspendieron en RPMI 10% FBS-alto contenido de glucosa suplementado con L-glutamina (Cellgro; Mediatech Inc., Herndon, VA) y 1% de antibiótico /antimicótico (Sigma-Aldrich Chemical Co, St. Louis, MO), y se estimularon con 1 mg /ml anti-CD3 (eBioscience, San Diego, CA) y 1 mg /ml anti-CD28 (eBioscience) durante 72 h o con LPS 1 mg /ml (InvivoGen, San Diego, CA) durante 6 h. Se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a -80 ° C.
Preparación de homogeneizados de colon
Los dos puntos se lavaron a fondo con PBS enfriado con hielo. Los dos puntos fueron luego congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Se añadieron perlas de óxido de zirconio se lava y esterilizados (0,5 mm de diámetro, próximo avance, Cambridge, MA) en un volumen igual a la del tejido. tejidos de colon se homogeneizaron brevemente a continuación mecánicamente usando la licuadora Bullet (siguiente avance, Cambridge, MA) a 4 ° C. Un tampón de lisis isotónico (1 mM EDTA, 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,9, NaCl 250 mM, ortovanadato de 20 mM ß-glicerofosfato, 1 mM activa, 1% NP-40, DTT 1 mM) se añadió al tejido y perlas en un volumen igual a la del tejido. Esto además se homogeneizó seguido por rotación a 4 ° C durante 20 min. tejidos homogeneizados se centrifugaron durante 20 min a 4 ° C y 16.100
g
y los sobrenadantes se almacenaron a -80 ° C.
ELISA
sobrenadantes de homogeneizados, el colon o el suero eran analizadas para la presencia de TNFa, IL-4, IFNg, IL-17A, IL-23p19 (todo eBioscience, San Diego, CA), IL-10, IL-6, TGF, MIP-2 (todo amp I +; D Systems, Minneapolis, MN), o KC, MCP-1 y RANTES (todo Biosciences BD, San José, CA), según el protocolo sugerido por el fabricante.
el análisis estadístico
los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 4. el análisis estadístico de las curvas de supervivencia se realizó mediante la prueba de log-rank. Los análisis estadísticos de los tamaños tumorales se realizaron con la prueba de Mann-Whitney para las poblaciones no seguir las distribuciones gaussianas. Las comparaciones de una variable de datos siguientes distribuciones gaussianas se realizaron mediante la prueba t de Student no pareada de dos colas. Cuando una prueba F indica las variaciones difieren significativamente, se empleó la corrección de Welch a la prueba t de Student. Las comparaciones de los dos datos variables se realizaron mediante ANOVA de dos vías con la prueba de Bonferroni. Las comparaciones de los datos de la curva de supervivencia se realizaron utilizando la prueba (Mantel-Cox) de log-rank. Todas las pruebas se realizaron con intervalos de confianza del 95%. Los datos se expresan como medias ± SEM. * = P & lt; 0,05, ** = p & lt; 0,01, *** = p. & Lt; 0,001
Resultados
TLR2 deficiencia conduce a un mayor desarrollo de la colitis asociada a cáncer de colon
estudios anteriores han demostrado que TLR de señalización y la molécula de MyD88 adaptador común están implicados críticamente en la homeostasis de la célula epitelial intestinal y el desarrollo de tumores intestinales [9], [10], [23], [24], sin embargo, el papel de TLR2 no ha sido ampliamente estudiado. Para examinar el papel de TLR2 durante la tumorigénesis la colitis asociada se utilizó un modelo bien establecido de la CAC [4], [24], [30], [31], [32]. WT y TLR2
- /- ratones recibieron una sola inyección de AOM seguido de la administración de tres ciclos de DSS (Figura 1A). TLR2
- /- ratones había aumento de la morbilidad como se evidencia por el aumento de la pérdida de peso durante el curso del tratamiento (Figura 1B) y sangrado rectal más durante el tratamiento DSS en comparación con los ratones WT (datos no mostrados). También encontramos aumento de la mortalidad en el TLR2 - /- ratones en comparación con ratones de tipo salvaje (4,6% para WT y 25% para TLR2
- /- ratones, respectivamente, p & lt; 0,05), con la mayoría de las muertes se producen poco después de la primera curso de DSS (Fig 1C). A continuación, se analizó el impacto de la deficiencia de TLR2 en el desarrollo tumoral asociado con la colitis. TLR2
- /- ratones tenían una carga tumoral más alta que los ratones WT. examen Histolopathological reveló un aumento significativo en el número de tumores en TLR2
- /- en comparación con ratones WT (Figura 1D). El número medio de tumores por ratón fue casi se duplicó en TLR2-ratones deficientes en comparación con los ratones WT (6,1 vs 3,5, p & lt; 0,05). Debido a TLR2 intestinal se expresa con más fuerza en el colon proximal [33], la hipótesis de que los ratones que carecen de TLR2 desarrollarían más CAC proximal. De hecho, la diferencia en el desarrollo de tumores en TLR2
- /- en comparación con ratones WT fue más prominente en el colon proximal (Figura 1E). Además del aumento en el número de tumores, TLR2-deficiencia también condujo a número significativamente mayor de los tumores más grandes (& gt; 1 mm
2) (p & lt; 0,05) (Figura 1F) y mayor carga tumoral (casi el doble), en TLR2
- /- ratones en comparación con los ratones WT (p & lt; 0,05) (Figura 1G). Estos resultados indican que TLR2-deficiencia no sólo mejora la promoción de tumores, pero también aumenta la progresión tumoral.
dos puntos deficientes en TLR2 tienen displasia más avanzada y la expresión de ß-catenina en comparación con dos puntos WT
ß-catenina señalización juega un papel esencial en la carcinogénesis humana intestinal [34] y las mutaciones se han reportado en los tumores de colon murino de AOM inducida por [30], [31], [35]. De hecho, se observó fuerte tinción de ß-catenina citoplasmática o nuclear positiva en el tejido transformado en el documento WT y TLR2
- /- ratones (Figura 2B). adenomas colorrectales WT (Figura 2 A, B, Izquierda 2 paneles) muestran estructuras tubulares clásicos con glándulas distorsionadas y organización moderada. Sin embargo, TLR2
- /- neoplasias colorrectales (Figura 2 A, B, derecha 2 paneles) está representada glándulas más distorsionadas con las regiones del aumento de las estructuras de desorganización y cribiforme indicativos de una displasia de alto grado (es decir, el carcinoma
In situ)
. De hecho, el análisis histológico reveló casi el doble de la incidencia de carcinoma avanzado
in situ
(0,3 vs 0,6 significa carcinoma in situ por ratón), en TLR2
- /- ratones, en comparación con WT, que mostró una tendencia hacia la significación (p & lt; 0,055) (Figura S1)
La histopatología de dos puntos en el día 61 de tratamiento de la OMA-DSS.. (A) con hematoxilina y eosina (H & amp; E) (izquierda) o manchado BrdU (derecha) de las secciones de serie WT o TLR2
- /- ratones se muestran. se muestran 20x original ampliación (paneles superiores) y 100x (paneles inferiores). (B) tinción de inmunofluorescencia para la ß-catenina. 100x original magnificación (panel izquierdo) o 400x (panel derecho).
TLR2 deficiencia conduce a un aumento de la formación temprana de focos de criptas aberrantes y la tumorigénesis intestinal temprana
Debido a TLR2
- /- ratones desarrollaron tumores colónicos significativamente más grandes, el próximo examinó WT y deficientes TLR2 dos puntos de 14 días en el régimen de AOM-DSS para los eventos de transformación más tempranas durante la tumorigénesis. En este punto del tiempo, TLR2
- /- ratones mostraron un aumento significativamente la inflamación en comparación con los ratones WT (puntuación de inflamación general de 4 vs 6, p & lt; 0,001) (Figura 3A). Los dos puntos de TLR2
- /- ratones contenían moderada a grave inflamación que se extendía transmural mientras que la inflamación en colones WT extiende a profundidades similares, pero muestra sólo leve a moderada infiltración de leucocitos (Figura 3D). El aumento de la inflamación que se produce en este punto de tiempo (día 14) en TLR2 - /- ratones también correlacionada con la pérdida de peso corporal más severa y aumento de la mortalidad durante el primer curso de DSS en nuestro estudio a largo plazo (figura 1B-C). ratones WT sufrieron más aún ulceración y necrosis extensa de TLR2
- /- ratones (extensión de la necrosis en el colon 2,5 vs 1,3, p & lt; 0,01) (Figura 3B, D). En su lugar, TLR2
- /- ratones mostraron signos de regeneración con el agotamiento de mucina, ampliada y núcleos hipercromáticos, y aumento de la relación citoplasmática, todo indicativo de focos de criptas aberrantes (ACF), que se sabe que ser pre-neoplásica [36 ] (Figura 3D, paneles de la derecha). Asimismo, se observó la proliferación similar, pero reducción de la apoptosis en TLR2
- /- ACF en comparación con WT ACF (Figura 3E, F), lo que puede contribuir a la supervivencia de las células transformadas. De hecho, el análisis cuantitativo de ACF reveló un aumento significativo en ACF en TLR2
- /- ratones en comparación con los ratones WT en proximal (p & lt; 0,001)., Así como dos puntos distales (p & lt; 0,01) (Figura 3C)
La puntuación de la inflamación, la necrosis y la ACF en día 14 de tratamiento AOM-DSS (n = 5 WT y n = 5 TLR2
- /-). (A) las puntuaciones inflamatorias del colon. (B) Una extensión de la necrosis colónica. (C) Número de ACF por ratón situado en colones proximal o distal. (D) H & amp; E manchas de secciones seriadas de dos puntos. 40x de magnificación original (panel superior) o 100x (panel inferior). manchas (E) inmunohistoquímicas para BrdU. 100 aumentos original. tinción (F) Inmunofluorescencia TUNEL. 100 aumentos original. Todas las pruebas se realizaron con intervalos de confianza del 95%. Los datos se expresan como medias ± SEM. * = P & lt; 0,05, ** = p & lt; 0,01, *** = p & lt;. 0.001
TLR2 por deficiencia de haber aumento de la proliferación celular y la reducción de la apoptosis durante el desarrollo temprano CAC
estudios previos han demostrado que se requiere el reconocimiento de las bacterias comensales a través de TLRs para la homeostasis del epitelio intestinal, que es controlada por el equilibrio de la proliferación y la apoptosis en las criptas [10]. Con el fin de comparar la homeostasis intestinal entre TLR2
- /- ratones y los ratones WT, se analizó la proliferación de células epiteliales de la incorporación de BrdU y la apoptosis mediante tinción TUNEL para la fragmentación del ADN en las criptas colónicas. Curiosamente, antes de la OMA-DSS se observó el número significativamente menor de BrdU
+ células (Figura 4A), con un aumento significativo número de TUNEL
+ células (Figura 4B) por cripta en los extremos proximal y dos puntos distales de TLR2
- /- ratones en comparación con los ratones WT. Por el contrario, después de una ronda de tratamiento DSS (día 14), TLR2
- /- criptas colónicas muestran una mayor BrdU
+ células (p & lt; 0,001) (Figura 4A, C) y la disminución de TUNEL
+ células (p & lt; 0,001) (Figura 4 B, D) en comparación con los ratones WT, lo que indica desregula la homeostasis epitelial en TLR2
- /- dos puntos durante condiciones inflamatorias. Además, aunque la BrdU
+ células se localizaron principalmente a la zona de células madre del criptas WT, células proliferantes fueron encontrados extenderse en las regiones medias de la TLR2
- /- criptas, en el que las células epiteliales son normalmente diferenciados y no proliferativas (Figura 4C). Por lo tanto, como integridad de la mucosa se vea comprometida en dos puntos deficientes de TLR2, la capacidad de la IEC para adherirse a las señales de supervivencia y muerte apropiados se ha visto comprometida, lo que resulta en vez en la supervivencia celular desregulada. Para confirmar que la tumorigénesis intestinal temprano en TLR2
- /- ratones depende de la inducida por DSS inflamación examinamos WT y TLR2
- /- ratones 14 días después de una sola inyección de AOM (sin tratamiento DSS) como controles. No se observó ninguna ACF discernible o aumento de la inflamación en dos puntos WT o deficientes en TLR2 en estos experimentos de control (Figura S2) que sugiere la importancia de la inflamación para el desarrollo de tumores en el contexto de TLR2-deficiencia.
Evaluación de la proliferación por la tinción de BrdU y la apoptosis mediante tinción TUNEL en proximal y dos puntos distales de los ratones ya sea tratados durante 14 días con el régimen de AOM-DSS (Día 14) o los ratones sin tratar (día 0) (n = 5), BrdU
+ (a) y TUNEL
+ células (B) se contaron en criptas intactas y bien orientadas. BrdU
+ células se cuantificaron a partir de al menos 20 criptas por región a partir de 4 diapositivas diferentes por animal. (C) Día 14 tinciones inmunohistoquímicas representativos de BrdU en las secciones del colon. 100 aumentos original. (D) Día 14 manchas de inmunofluorescencia representativos de manchas TUNEL en secciones del colon. 100 aumentos original. Todas las pruebas se realizaron con intervalos de confianza del 95%. Los datos se expresan como medias ± SEM. . * = P & lt; 0,05, ** = p & lt; 0,01, *** = p & lt; 0,001
TLR2
- /- ratones han aumentado IL-6 y la activación de STAT3 durante la tumorigénesis intestinal temprana
Además del aumento de la proliferación celular y la inflamación, que detecte un aumento significativamente los niveles séricos de IL-6 en TLR2
- /- ratones en las primeras etapas de la tumorigénesis después del tratamiento inicial de OMA-DSS (día 14) en comparación a los ratones WT (p & lt; 0,05) (Figura 5A). Es importante destacar que, IL-6 promueve la progresión del tumor en modelos de tumores asociados con la inflamación a través de la activación de STAT3 [37], [38]. No se observó ninguna diferencia significativa en las concentraciones séricas de otras citoquinas pro-inflamatorias o quimiocinas (IL-12p40, IL-1beta, MCP-1, KC, y MIP-2) entre el TE y TLR2
- /- ratones en día 14 de tratamiento AOM-DSS (datos no mostrados). También se detectó aumento de la producción de IL-6 en los homogeneizados de colon enteros de TLR2
- /- ratones en el día 14 del tratamiento AOM-DSS en comparación con los ratones WT (P & lt; 0,01) (Figura 5B). células mononucleares de la lámina propia (CMLP) aislado de TLR2
- /- ratones tratados con LPS también produjeron más IL-6 que WT LPMC (p & lt; 0,05) (Figura 5C). En consonancia con el aumento de la producción de IL-6 en TLR2
- /- ratones en las primeras etapas de la tumorigénesis, se observó el aumento significativamente la acumulación nuclear de fosforilados STAT3 (activado) (pSTAT3) en TLR2
- /- epitelio en comparación con dos puntos WT (Figura 5E). La cuantificación de la intensidad de pSTAT3 nuclear en ACF reveló un aumento de 8 veces en la expresión pSTAT3 en TLR2
- /- ACF en comparación con WT ACF en día 14 (p & lt; 0,05) (Figura 5F). Además, mientras que la expresión pSTAT3 nuclear dentro de TLR2
- /- ACF se limitaba a las células intactas de las criptas epiteliales (Figura 5E, panel derecho), pSTAT3 nuclear en WT ACF apareció principalmente en la lámina propia o criptas abscesos (Figura 5E, panel izquierdo) . El análisis cuantitativo de pSTAT3 al inicio del estudio no reveló diferencias en TLR2
- /- frente a los ratones WT (Figura 5F) guía
Los paneles A-C:. la producción de IL-6 en el documento WT y TLR2
- /- ratones a día 14 de tratamiento AOM-DSS se midió por ELISA. (A) Los niveles séricos de IL-6 (n = 8 WT, n = 9 TLR2
- /-). (B) la concentración de IL-6 en los homogeneizados de colon se normalizó a la concentración de proteína en los tejidos (n = 3 WT, n = 5 TLR2
- /-). (C) IL-6 secreción de las células lámina propia del colon aislados tratados con LPS (1 mg /ml) durante 6 h (n = 3-5). (D) las manchas de inmunofluorescencia de fosfo-Stat3 en los tejidos del colon de WT y TLR2
- /- ratones al inicio del estudio. 100 aumentos original. (E) tinción de inmunofluorescencia de fosfo-STAT3 en los tejidos del colon de WT y TLR2
- /- ratones tratados durante 14 días con el régimen de AOM-DSS. El panel superior 40 aumentos original, panel inferior aumento del original 400x. (F) La cuantificación de la intensidad de fosfo-Stat3 medido en ACF desde más de cinco campos de enfoque en al menos cuatro diapositivas por animal (n = 5 WT y n = 5 TLR2
- /-). Todas las pruebas se realizaron con intervalos de confianza del 95%. Los datos se expresan como medias ± SEM. . * = P & lt; 0,05, ** = p & lt; 0,01, *** = p & lt; 0,001
TLR2
- /- ratones tienen una mayor respuesta inmune T
H17 durante CAC desarrollo
estudios recientes han puesto de relieve T
H17 células en la patogénesis de la EII [39] y el colon tumorigénesis [40]. Se examinó la expresión de T
H1, T
H2 y T
H17 citoquinas en colones de WT y TLR2
- /- ratones durante el desarrollo temprano del CAC. Si bien se observó disminución de la producción de IFN-gamma a partir de homogeneizados de colon derivados de TLR2
- /- ratones en comparación con los ratones WT en el día 14 (Figura 6), se observó significativamente mayor producción de TNFa en dos puntos deficientes en TLR2 en comparación con los dos puntos WT (p & lt; 0,05) (figura 6H), una citoquina Th1 sabe que juega un papel crucial en el desarrollo CAC [32]. No se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa en los niveles de IL-4 (Figura 6C) IL-10 (Figura 6B) o en los homogeneizados de colon en estos animales. En contraste, se observó un aumento de más de 2 veces en la IL-17A en TLR2
- /- homogeneizados de colon en comparación con WT (p & lt; 0,05) (Figura 6D). LPMCs aislados de TLR2
- /- ratones también producidos mayor que 7 veces más IL-17A en comparación con las células WT cuando se volvieron a estimular con anti-CD3e y anti-CD28 (p & lt; 0,001) (Figura 6E). También se observó el aumento de forma significativa la producción de TGF-b en dos puntos deficientes en TLR2 en comparación con los dos puntos WT (P & lt; 0,05) (Figura 6F). Aumento de la producción de TGF-b ‥ IL-6, y pSTAT3 en TLR2
- /- ratones en comparación con WT apoya aún más la participación de células T
H17. IL-23p19 es una citoquina que ha sido implicado en el mantenimiento de T
H17 células [41]. Hemos observado que TLR2
- /- homogeneizados de colon tienen significativamente más bajos niveles de IL-23p19 al inicio del estudio en comparación con dos puntos WT (P & lt; 0,001) (Figura 6G). Sin embargo, después de día 14 de tratamiento AOM-DSS, la producción de IL-23p19 aumentó significativamente en TLR2
- /- dos puntos mientras que disminuye en dos puntos WT (p & lt; 0,001) (Figura 6G), apoyando aún más la interacción de TLR2 y T
H17 células en este modelo. Además, en comparación con los dos puntos WT a los 14 días del tratamiento AOM-DSS, TLR2
- /- muestran dos puntos de producción significativamente más colónica TNFa (Figura 6H), sabe que juega un papel crucial en el desarrollo CAC [32].