Extracto
Aplicaciones
Cáncer asociado fibroblastos del estroma (CAF) experimentan cambios fenotípicos de la transcripción y que contribuyen a la progresión del tumor, pero los mecanismos responsables de estos cambios no se conocen bien. metilación aberrante del ADN es una importante causa de alteraciones de la transcripción en células cancerosas, pero no se sabe lo importante que son las alteraciones de metilación del ADN con el comportamiento de la CAF.
Diseño Experimental
Se utilizó Affymetrix exón arrays para comparar los genes inducidos por el inhibidor de la metilación del ADN 5-aza-dC en cultivos de fibroblastos asociados cáncer pancreático, fibroblastos de control de páncreas y líneas celulares de cáncer de páncreas.
resultados
se encontró que los CAF pancreáticas y controlar los fibroblastos de páncreas eran menos sensibles a la reactivación de genes mediada-dC 5-aza que las células de cáncer de páncreas (media +/- SD de los genes inducidos ≥5 veces fue de 9 ± 10 genes en 10 cultivos CAF pancreáticos, 17 ± 14 genes en 3 de control cultivos de fibroblastos de páncreas, y 134 ± 85 genes en 4 líneas celulares de cáncer de páncreas). Examinamos los genes expresados diferencialmente entre CAF y los fibroblastos de control de genes candidatos metilado e identificamos la desintegrina y metaloproteasa,
ADAM12
como hypomethylated y sobreexpresado en líneas CAF pancreáticas y sobreexpresa en fibroblastos adyacentes a los adenocarcinomas pancreáticos primarios.
Conclusiones
en comparación con las células de cáncer de páncreas, algunos genes se reactivan por la inhibición DNMT1 en CAF pancreáticas que sugiere que estas células no albergan muchas alteraciones funcionalmente importantes en la metilación del ADN. CAF también puede no ser muy sensible a la orientación terapéutica con inhibidores de la metilación del ADN
Visto:. Yu J, Walter K, N Omura, Hong S-M, Young A, Li A, et al. (2012) A diferencia de las células de cáncer de páncreas del cáncer pancreático Los fibroblastos asociados Pantalla mínimo de inducción de genes después de 5-Aza-2'- desoxicitidina. PLoS ONE 7 (9): e43456. doi: 10.1371 /journal.pone.0043456
Editor: Brock C. Christensen, Escuela Geisel de Medicina de Dartmouth, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 10, 2012; Aceptado: July 24, 2012; Publicado: 11 Septiembre 2012
Copyright: © Yu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por las becas del National Cancer Institute (CA62924 y RC2148346), y la Fundación Michael Rolfe. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los cambios epigenéticos en la expresión génica son una característica fundamental de las células del cáncer [1]. Una de las mejores alteraciones epigenéticas caracterizadas es la metilación del ADN. los patrones de metilación del ADN son hereditarios y se mantienen después de la división celular, principalmente por el ADN metiltransferasa Dnmt1. hipermetilación aberrante del ADN se produce a menudo en las islas CpG en los promotores de genes y se asocia con una represión del estado y el gen de la cromatina cerrado. evidencia considerable indica que la hipermetilación aberrante y silenciamiento de los genes de los supresores de tumores y otros genes reguladores contribuye al desarrollo de otros tipos de cáncer de páncreas y [2]. hipometilación aberrante de genes normalmente metiladas y silenciados también se ha descrito en el páncreas y otros tipos de cáncer como una causa de la sobreexpresión de genes aberrantes [3], [4].
Los mecanismos responsables de estos patrones de metilación aberrante en los cánceres no son comprenden bien, pero se sospecha mecanismos incluyen la sobreexpresión de
DNMT1
, acumulación de alteraciones de metilación del ADN con la edad [5], [6] y las influencias ambientales [7], la actividad alterada de la
de novo
enzimas metiladoras
DNMT3a
y
DNMT3b
[8], [9], y, posiblemente, de alteración microambiente celular como de la inflamación crónica [3], [10].
las células del estroma no neoplásicas dentro del microambiente del tumor también se someten a cambios fenotípicos de la transcripción y otras en relación con las células normales que se cree que contribuyen a la progresión del tumor. El cáncer de páncreas es una enfermedad mortal [11] y es bien conocido por su extensa respuesta del estroma desmoplásico que comprende un 75% promedio de las células en la masa del tumor [12]. Se sospecha que el componente del estroma contribuye a la resistencia de los cánceres pancreáticos a las terapias de drogas [13], y varios estudios implican diferencias en el comportamiento del estroma con el resultado del paciente en páncreas y otros tipos de cáncer [14], [15], [16], [ ,,,0],17], [18]. fibroblastos cáncer asociado (CAF), el tipo celular predominante en el microambiente del estroma, adoptan un fenotipo activado durante la tumorigénesis, sufriendo morfológica, y la expresión del gen funcional cambia en relación con los fibroblastos normales [19]. Estos CAF activados se caracterizan por actina α-músculo liso (α-SMA) expresión [20], el aumento de la capacidad contráctil y secretora, y aumento de la síntesis de colágenos, proteínas de la matriz extracelular [21] y factores de crecimiento incluyendo el factor de crecimiento epitelial, plaquetas factores de crecimiento (PDGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico, factor de crecimiento de hepatocitos y factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) [22]. A través de estas y otras señales, CAF interactúan íntimamente con células tumorales para promover su crecimiento, y por lo tanto CAF son de considerable interés como una diana terapéutica. De hecho, las estrategias recientes para orientar CAF incluyen el uso del inhibidor de quinasa, imatinib para bloquear los receptores del estroma de PDGF [23], los anticuerpos para bloquear el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) derivado de tanto las células cancerosas y CAF para inhibir la angiogénesis del tumor [24] y el uso de inhibidores de smoothened (SMO) para bloquear la señalización de Hedgehog-tumor del estroma y agotar los fibroblastos del estroma que sobreexpresan el receptor de hedgehog (Hh) Smo [25], [26], [27], [28]. Que los ensayos iniciales de los inhibidores de smoothened en cánceres pancreáticos no mostraron evidencia de beneficios pone de relieve la necesidad de estudios que investigan las interacciones básicas del estroma tumoral. Otro beneficio potencial de la orientación estroma cáncer es mejorar la accesibilidad de los agentes terapéuticos a las células de cáncer de páncreas. Por ejemplo, el fármaco nab-paclitaxel (Abraxane), una formulación de nanopartículas de paclitaxel, se une a Sparc, una proteína de la matriz estromal a menudo altamente expresado en el estroma del cáncer pancreático que media interacciones estroma tumoral, con lo que potencialmente mejorar la administración de fármacos al tumor [29] , [30]. Los ensayos clínicos de Abraxane en pancreática cáncer muestran promesa y en modelos animales existen evidencias que sugieren que la entrega de gemcitabina al tumor se mejora con Abraxane, y con inhibidores hedgehog [25]. La eficacia de la combinación de fármacos /Abraxane Gemcitabina sigue en espera de los resultados de la fase 3 de ensayos clínicos.
La influencia de la CAF en el crecimiento del cáncer se ha demostrado en numerosos estudios [31], [32], pero los mecanismos moleculares que subyacen a la CAF fenotipo no se conocen bien. A pesar de una mayor influencia de los CAF se sospecha que es el microambiente tumoral incluyendo influencias de las mismas células cancerosas, CAF conservan sus propiedades promotoras de tumores
in vitro
después del cultivo prolongado de células [33], lo que sugiere que los mecanismos hereditarios son responsables . Aunque se han descrito alteraciones genéticas en los CAF, estudios más recientes que investigan la posibilidad de que los CAF sufren alteraciones genéticas clonales similares a las células cancerosas se han encontrado ninguna evidencia de tales alteraciones [33], [34], [35], [36], [37 ], [38]. En ausencia de mutaciones genéticas generalizadas, es razonable sospechar que los mecanismos epigenéticos como la metilación del ADN, que son mitóticamente hereditarias, son responsables de los cambios de expresión génica estable en los CAF. De hecho, varios genes implicados en las interacciones con el tumor del estroma y se indujeron en los CAF por co-cultivo con células de cáncer, tales como
SPARC
[29], [30],
de la COX-2
y metaloproteinasas de matriz (MMP) [39] están regulados por la metilación del ADN. Por otra parte, los CAF se someten a las mismas influencias en el microambiente del tumor que se cree que contribuyen a los cambios de metilación en las células cancerosas, como la inflamación crónica [34].
La heterogeneidad de los CAF de diferentes tumores e incluso dentro de la mismo tumor [14], [30] sugiere también que los CAF tienen múltiples fuentes que podrían contribuir a las diferencias epigenéticas. Además de la activación de los fibroblastos residentes en el microambiente tumoral, algunos CAF son la médula ósea células precursoras mesenquimatosas derivadas [40], [41] y las células epiteliales tal vez o endoteliales en transición mesenquimales [21], [42]. Debido a que estos procesos de diferenciación y transdiferenciación están regulados por mecanismos epigenéticos [43], los CAF derivados de diferentes fuentes tienen diferentes epigenética y los perfiles de transcripción en comparación con su contraparte de tejidos residentes.
Sólo unos pocos estudios han comenzado a explorar los mecanismos epigenéticos de estos cambios transcripcionales en los CAF. Uno de los primeros estudios para proporcionar evidencia de diferencias de metilación del ADN entre las células normales y tumorales asociados estromales tomó un enfoque de todo el genoma utilizando el cariotipo digital específico de metilación (MSDK) para perfilar las células epiteliales, células mioepiteliales y los fibroblastos del estroma durante la progresión del tumor de mama [35] . Otra láser microdisección de captura de enfoque que combine con la PCR específica de metilación (MSP) de los genes candidatos identificados frecuente la metilación del promotor de
GSTP1
y
RARB2
en las células del estroma asociados a tumores de próstata en relación con las células normales del estroma de próstata [ ,,,0],44]. Un tercer enfoque utilizando sensible a la metilación SNP análisis array (MSNP) demostró ganancias focales en la metilación y la hipometilación global en miofibroblastos asociados con el cáncer gástrico [36].
Una estrategia útil para identificar eventos de metilación es llevar a cabo una reactivación gen pantalla usando inhibidores de la metilación de ADN, tales como 5-aza-2 'desoxicitidina (5-aza-dC), que se dirige selectivamente la enzima DNMT1 para el agotamiento. Este método tiene la ventaja de identificar las alteraciones de metilación del ADN que regulan la transcripción y por lo tanto más probable que sea funcionalmente importante. Aunque este enfoque ha identificado con éxito eventos de metilación en células de cáncer de varios tipos de tumores [45] a nuestro conocimiento, este enfoque no se ha utilizado para identificar genes regulados por metilación en CAF. Para determinar si la metilación del ADN son los reguladores, también importantes, de los cambios de expresión génica en los CAF como para las líneas celulares de cáncer, se realizó un análisis de la reexpresión de todo el genoma de los fibroblastos asociados con el cáncer de páncreas humano y líneas celulares de cáncer de páncreas usando 5-aza-DC.
Materiales y Métodos
Cultura de líneas celulares
Los cultivos primarios de fibroblastos del estroma, fibroblastos asociados con el cáncer designados (CAF) CAF9, CAF11, CAF12, CAF13, CAF14, CAF15, CAF16, CAF18, CAF19, CAF20, CAF21, CAF22, CAF25, y CAF35 se establecieron a partir de tejido de cáncer de páncreas resecado quirúrgicamente de 13 pacientes (6 varones media ± desviación estándar (dE) de edad de 58 ± 7 años), con clínicamente esporádica adenocarcinoma ductal pancreático. Los cánceres eran todos de moderada a pobremente diferenciado con un tamaño medio del tumor de 3,5 cm. Se establecieron estos cultivos primarios CAF como se describe anteriormente [27] al igual que dos fibroblastos de control de hTERT-inmortalizado (SC2 y SC3, establecidas a partir de tejido pancreático no neoplásico resecado quirúrgicamente de 2 mujeres (edad media, 63 años) [27]. La inmortalizado (HPNE) línea de células que expresan nestina pancreático humano fue proporcionado generosamente por el Dr. Michel Ouellette (Universidad de Nebraska Medical Center) [46]. Cuatro líneas celulares de cáncer de páncreas, incluyendo A32-1, Panc2.8, Panc3.014 y Panc215 establecieron de adenocarcinomas ductales pancreáticas primarios en nuestra institución y descrito anteriormente [47] también se utilizaron en este estudio Todas las líneas celulares se mantuvieron en DMEM (4,5 mg /ml de glucosa; Invitrogen). que contiene 10% de FBS en condiciones estándar como se describe anteriormente [48] . los estudios se realizaron con la aprobación del Comité de Johns Hopkins para la Investigación clínica.
tratamiento con 5-aza-dC y la extracción de RNA
las células se sembraron a 2 x 10
5 células por matraz T75 y se trató al día siguiente con 1 mol /L 5-aza-2'- desoxicitidina (5-aza-dC, Sigma) [49] por 4 días durante la fase de crecimiento exponencial, con un cambio de los medios de comunicación y la droga todos los 24 horas. En el día 5, cuando las células estaban cercanas a la confluencia, se lavaron con PBS frío y el ARN total aislado utilizando un kit de Qiagen (Qiagen) o el kit de mirVana miRNA (Ambion), de acuerdo con las instrucciones del fabricante tal como se describe anteriormente [50].
exón gama y selección de genes para la validación
La plataforma Affymetrix GeneChip Human exón 1.0ST se utilizó para analizar los patrones de expresión génica en no tratados y 5-aza-dC fibroblastos y las líneas celulares de cáncer tratados, como antes se describe [27]. Estamos de acuerdo con la información mínima alrededor de un directrices de microarrays experimento, y hemos presentado nuestros datos de microarrays establecen en la Expresión Génica Omnibus repositorio (GEO adhesión#GSE20911).
RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR)
1 mg de ARN total se transcribió de forma inversa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). El cDNA resultante se amplificó en un ABI 7300 termociclador PCR en tiempo real utilizando SYBR Green PCR Master Mix y recomendó condiciones de PCR (Applied Biosystems). El gen de mantenimiento
GAPDH
se utilizó para la normalización. primer especificidad fue confirmada por análisis de curvas de fusión. Los resultados se expresan como valores de expresión normalizada en relación con la línea celular indicada (= 2
-ΔΔCt). Todas las reacciones de PCR se realizaron por triplicado. secuencias de los cebadores son las siguientes:
Stratifin
RTsense: 5'-TCTGATCCAGAAGGCCAAG-3 ';
Stratifin
RTantisense: 5'-GTTTCGCTCTTCGCAGGAG-3 ';
TKTL1
RTsense: 5'-AGCTCCGGCCACCCTACATCATG-3 ';
TKTL1
RTantisense: 5'-TGCCACATCCACAAACGACAGTCT-3 ';
ADAM12
RTsense: 5'-AAATGAAGGTCTCATTGCCAG-3 ';
ADAM12
RTantisense: 5'-AGAATTACCCGTGTAATTTCGAG-3 ';
GAPDH
RTsense: 5'-CAACAGCCTCAAGATCATCAG-3 ';
GAPDH
RTantisense: 5'-ACTGTGGTCATGAGTCCTTC-3 '.
bisulfito de Secuenciación
El estado de metilación de las islas CpG 5' de los genes candidatos se determinó mediante la secuenciación de bisulfito. modificación con bisulfito y PCR se realizaron como se describe anteriormente [51]. Bisulfito de modificación de secuenciación (BMS) cebadores fueron los siguientes:
TKTL1
BMS hacia adelante: 5'-TGTGTAGAGAAAGAAGATTTTGTATT-3 ',
TKTL1
BMS inversa: 5'-CCCTTTAAAATCTAAAAACCCACTC-3', y la secuencia interna imprimación
TKTL1
BMS-Sec: 5'-GATTGTAGGAGAGAAGATGAG-3 ';
ADAM12
BMS hacia adelante: 5'-TTTAGTTTTAGTTTGAAAAGTTGGA-3 ',
ADAM12
BMS inversa: 5'-CTAAACTCTTCTAACCTTTCAT-3', y el cebador de secuenciación interna
ADAM12
BMS-Sec : 5'-TTCTAACACAAACCAACCTTAACC-3 '. Los productos purificados fueron secuenciados en el Centro de Secuenciación del Core Johns Hopkins.
Análisis de transferencia Western de la expresión DNMT1
Western blot se realizó utilizando lisados de HPNE o CAF12 sin tratar o 5-aza-DC-tratados Células. Un ensayo de Bradford se utilizó para estimar la concentración de proteínas, utilizando albúmina de suero bovino (BSA, Invitrogen) como estándar. Cantidades iguales de proteína (40 g por carril) se separaron mediante electroforesis en gel de 4 a 12% SDS en gradiente (Invitrogen), se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, y se incubaron en solución de bloqueo (leche 5% en TBS con 0,1% de Tween 20) durante 30 minutos . Las membranas se incubaron durante 60 minutos con un anticuerpo policlonal anti-DNMT1 (generosamente proporcionado por el Dr. Bill Nelson, JHU) a una dilución 1:200 o un anticuerpo monoclonal contra GAPDH (Señalización Celular, Danvers, MA) a una dilución 1:2000. anticuerpos HRP-vinculada secundarias (Santa Cruz Biotechnology, y Amersham Biosciences) se aplicaron a una dilución 1:2000 y proteínas detectadas usando un kit ECL (Amersham Biosciences).
microarrays de tejidos adenocarcinoma pancreático y ADAM12 inmunohistoquímica
La expresión de la proteína ADAM12 se examinó la utilización de etiquetado inmunohistoquímica (IHC), de los microarrays de tejidos incluidos en parafina fijado en formol (TMA) utilizando un Dako Autostainer (Dako, Carpinteria, CA). Cuatro TMA que contienen un total de 72 adenocarcinomas ductales pancreáticas resecado quirúrgicamente diferentes y correspondientes tejidos normales del páncreas se construyeron como se describe anteriormente [29]. ADAM12 IHC tinción se realizó tal como se describe anteriormente [29] utilizando un anticuerpo de conejo anti-humano ADAM12 (A2601, Sigma) a una dilución 1:100 y un tiempo de incubación de 60 minutos. Etiquetado se realizó usando el kit de detección de Envision-Splus (DAKO).
Análisis estadístico
descriptiva valores estadísticos y parcelas fueron generados utilizando el paquete de Microsoft Excel o la v6.3 beta Partek® Genómica ™ Suite . El método robusto multichip media (RMA) se utilizó para normalizar las mediciones de la intensidad primas de todos los conjuntos de sonda. los valores de expresión génica se obtienen entonces utilizando el método de Tukey biweight de un solo paso. ANOVA de dos vías se llevó a cabo para identificar cambios significativos de expresión entre los fibroblastos tratados 5-aza-DC sin tratar y o líneas celulares de cáncer, o entre CAF y el control de fibroblastos. Las diferencias se consideraron significativas a
P Hotel & lt; 0,05, y los valores reportados son medias ± SD
Resultados
análisis de la expresión génica global de los fibroblastos pancreáticos humanos y líneas celulares de cáncer tratados. con 5-aza-dC
establecieron cultivos primarios de páncreas CAF y culturas de control de fibroblastos como se describe anteriormente [38]. El uso de perfiles de expresión génica global, que previamente identificado la expresión de genes diferencias en los CAF páncreas en relación con el control de fibroblastos [27]. La agrupación jerárquica de los perfiles de expresión génica de fibroblastos no tratados y de control CAF se proporciona en la figura S1. Ante la sospecha de que estos cambios en la expresión génica fueron en parte mediados por cambios en la metilación del ADN, se compararon los perfiles de expresión génica de la CAF y culturas de control de fibroblastos antes y después del tratamiento con 5-aza-DC usando Affymetrix Exon Arrays (ST 1.0) (CAF11, CAF12, CAF13, CAF15, CAF16, CAF18, CAF19, CAF22, CAF25, y CAF35 de CAF; HPNE, SC2, SC3 y para el control de las células de fibroblastos, respectivamente) guía
en primer lugar confirmó 5-aza-dC agotamiento. de la enzima Dnmt1 por Western blot. -5-aza dC tratamiento de las células HPNE y CAF12 resultó en el agotamiento de la proteína Dnmt1 en 1 M concentraciones pero no proteína de control GAPDH (Figura 1). Para examinar más a fondo el efecto de 5 aza-DC concentraciones, se comparó el número de genes inducidos por 1 M y 10 M de 5-aza-DC en dos CAF adicionales, CAF19 y CAF35, y encontramos ninguna diferencia importante en el número de genes inducidos entre estas concentraciones de fármaco (datos no mostrados). Por ello, utilizó 1 M concentraciones de 5-aza-DC para tratar cada CAF. Se han tratado las células de la CAF durante 4 días ya que esto era suficiente duración para la proliferación celular. tratamientos más largos (durante 5-7 días) a menudo dieron lugar a CAF en crecimiento hasta la confluencia (datos no mostrados). Consistente con esto, se realizaron ensayos de proliferación en CAF19 a diferentes concentraciones 5-aza-dC (0 m, 1 m, 5 m, 10 m, y 20 mM) y se encontró que el crecimiento no se vio afectada de manera significativa a la concentración 1 mM hemos empleado (Figura S2).
DNMT1 proteína se agota (con respecto a GAPDH) en 5-aza-dC tratada células HPNE y CAF12.
Después de comparar los perfiles de expresión de cada uno antes de la CAF y después de 5-aza-dC tratamiento, se identificó por primera vez los genes que son regulados al alza en un promedio general de cambio de tapa de ≥2.0 en los diez CAF-tratados dC-5-aza relativos a los CAF no tratados. Elegimos un 2 veces de corte como se consideraron más probabilidades de estar relacionada con la variación experimental diferencias más modestas en el ARN. Ya que estaban interesados en la identificación de los genes silenciados en los CAF cuya expresión fue inducida por 5-aza-DC, que luego excluyó el subconjunto de genes que se expresan en los CAF no tratados. Este criterio identificado 42 genes candidatos (Tabla 1).
Para confirmar aún más la 5-aza-DC mediada por la inducción de genes se realizó qRT-PCR en el gen
Stratifin gratis (14- 3-3 sigma) y
transcetolasa-como la proteína 1 gratis (
TKTL1
) debido a que su expresión está regulada por metilación en otros tipos de células y la matriz de análisis exón identificó como su expresión inducida por 5- aza-dC [52] [53]. En consonancia con el resultado de exón matriz,
stratifin gratis (
SFN
) los niveles de mRNA fueron bajos o indetectables en todos los fibroblastos no tratados (CAF y el control de fibroblastos), y una mayor expresión de
SFN
mRNA se detectó en la mayoría de los fibroblastos 5-aza-dC tratados (Fig. 2 a y B). Hemos observado cerca de metilación completa de la
SFN
región promotora en todos los CAF por secuenciación de bisulfito (datos no mostrados). Del mismo modo,
TKTL1
niveles de mRNA fueron indetectables en los fibroblastos no tratados casi todos excepto células SC2, y el aumento de expresión de
TKTL1
se detectó en la mayoría de la 5-aza-dC tratada fibroblastos (Fig. 2 C). En consonancia con esto, hemos encontrado pruebas de metilación de CpG 5 'de
TKTL1 Hoteles en fibroblastos de MSP (datos no mostrados). secuenciación de bisulfito de 18 sitios CpG aguas arriba de la
TKTL1
sitio de inicio de transcripción (Fig. 2 D) reveló que la totalidad o la mayoría de los sitios CpG metilados eran plenamente en las líneas de fibroblastos que expresan, no HPNE y SC3 y en CAF19 y CAF25 (Fig. 2 E). Por el contrario, el
TKTL1
línea expresando, SC2, carecía de metilación de muchos de estos sitios, el apoyo a un papel de la metilación del ADN en la regulación de
TKTL1
expresión. También se identificó la regulación positiva de
DAZL
y
ANXA3 gratis (datos no mostrados), los genes se informó anteriormente a ser inducida por 5-aza-DC [36],
NDN
, informaron a imprimir [54], y
MT1G
, informó a ser metilado en otros tipos de cáncer [55].
(a) Affymetrix exón serie de análisis de
SFN
la expresión de ARNm en cinco CAF pancreáticas antes (verde) y después (rojo) tratamiento con 5-aza-dC. (B) y (C) Análisis cuantitativo de RT-PCR de
SFN
y
TKTL1
la expresión de ARNm en relación con
GAPDH
ARNm en cultivos de fibroblastos de páncreas antes (barras azules) y después (barras rojas) de tratamiento de 5-aza-dC. Cada ensayo se realizó por triplicado. Los datos son medias de tres experimentos independientes; barras son valores de DE. (D) Inicio:
TKTL1
estructura y distribución de los dinucleótidos CpG de genes. barras verticales cortas representan sitios CpG. La flecha señala el sitio de inicio de la transcripción. Abajo: el análisis de secuenciación genómica de bisulfito en los CAF pancreáticas y control de los fibroblastos. Los círculos abiertos representan los sitios CpG no metilados, círculos negros sólidos sitios CpG metilados, y eclosionaron círculos sitios CpG metilados parcialmente. (E) cromatogramas de secuenciación de bisulfito de la
TKTL1
promotor en un CAF de páncreas (CAF19) y líneas de fibroblastos de control (HPNE y SC2). Las flechas señalan los residuos de citosina.
Hemos examinado los perfiles de ARN para determinar si había alguna respuestas diferenciales a 5-aza-DC en los CAF en comparación con el control de los fibroblastos. Treinta y cinco de los 42 genes inducidos en CAF por 5-aza-DC (Tabla 1) también fueron inducidos en uno o más del control de líneas de fibroblastos pancreáticas que indican que pocos o ningún genes son upregulated selectivamente y consistentemente por 5-aza-dC en los CAF.
DAZL
era el gen más altamente inducida en cuatro CAF (CAF12, CAF15, CAF16, y CAF19) y fue uno de los diez mejores genes inducidos en dos CAF (CAF18 y CAF22) y fibroblastos de un control (HPNE) ( datos no mostrados). Se realizó la agrupación jerárquica de los genes inducidos por 5-aza-DC en los CAF y los fibroblastos de control para determinar si había diferencias observables en los patrones generales de genes de respuesta a 5-aza-DC, pero no había ninguna agrupación por clase de fibroblastos (Figura S3). Cinco de los siete CAF agrupados juntos, los otros dos CAF clustering con los fibroblastos de control.
Otra prueba de esta escasez de genes silenciados por la metilación del ADN en los CAF proviene de la evaluación de los genes underexpressed en los CAF. Se identificaron genes que se underexpressed en una media de ≥4.0 veces en todos los CAF en relación con el control de fibroblastos pancreáticas (Tabla S2). Cabe destacar que no hubo coincidencia entre esta lista de 86 genes underexpressed y los genes inducidos por una media de 2 veces por 5-aza-DC en los CAF (Tabla 1). Estos datos indican que muy pocos o ningún gen underexpressed consistentemente en los CAF son silenciados por la metilación del ADN.
Identificación de genes candidatos para el análisis de la hipometilación
Hemos identificado 200 genes previamente, como
Smo
, aumentada en los CAF páncreas en relación con el control de fibroblastos de páncreas [27]. Para identificar los genes candidato hypomethylated en los CAF, fusionamos esta lista de genes sobreexpresados en los CAF pancreáticas con la lista de 581 genes inducidos por ≥3.0 veces en al menos una línea celular de fibroblastos mediante tratamiento con 5-aza-DC. Este criterio identificado 49 genes candidatos (Tabla S1) algunos de los cuales puede estar regulada por metilación, y potencialmente hypomethylated en los CAF pancreáticos con relación al control fibroblastos.
tratamiento con 5-aza-DC de la CAF de páncreas humano, fibroblastos de control y líneas celulares de cáncer
a continuación comparó las respuestas de los CAF y los fibroblastos de control de 5-aza-dC con las respuestas de las líneas celulares de cáncer de páncreas. Hemos generado una lista de genes individuales para cada línea de fibroblastos o línea celular y luego contó el número total de genes inducidos por ≥5 veces en cada línea (Figura 3). Por último, comparamos el número medio de los genes inducidos por ≥5 veces por 5-aza-DC en los diez CAF, las líneas de fibroblastos 3 de control, y las 4 líneas celulares de cáncer de páncreas. Significativamente menor número de genes fueron inducidos por 5-aza-DC en los CAF que en líneas celulares de cáncer pancreático (
P = 0,0009)
. El número de genes inducidos por ≥5 veces en los diez CAF fue de sólo 9 ± 10 genes (media +/- desviación estándar) en comparación con 17 ± 14 genes inducidos por ≥5 veces en los tres fibroblastos de control pancreáticas, y 123 ± 86 genes inducidos por ≥5 veces en las 4 líneas celulares de cáncer pancreático (Figura 3). No hubo diferencia significativa en el número de genes inducidos por ≥5.0 veces en cafés y en los fibroblastos de control pancreáticas. Para asegurarse de que habíamos seleccionado un corte factor de cambio razonable para la comparación, también comparamos el número de genes inducidos por ≥3 veces. También se observaron diferencias similares: El número de genes inducidos ≥3 veces por 5-aza-DC se indujo 83 ± 47 genes en fibroblastos de control y 48 ± 42 genes inducidos en los CAF y 430 ± 271 genes en las líneas celulares de cáncer pancreático (
P = 0,0006
de CAF en relación con las líneas celulares de cáncer). No hubo diferencias significativas relacionadas con la edad del paciente o de género en el número de genes inducidos por 5-aza-DC.
Un promedio de 123 ± 86 genes fueron inducidos 5 veces o más por 5-aza-DC el tratamiento en cuatro líneas celulares de cáncer de páncreas, 9 ± 10 genes en diez CAF pancreáticas (
P = 0,0009
) y 17 ± 14 genes en tres líneas de fibroblastos de control de páncreas.
metilación diferencial del candidato gen ADAM12 hypomethylated
Nuestro análisis de los genes regulados positivamente selectivamente por 5-aza-dC en los CAF no produjo ningún genes que se sabe están regulados por la metilación del ADN que influyen en el comportamiento de los fibroblastos del estroma. También examinamos nuestras listas de genes expresados diferencialmente en relación con el control CAF fibroblastos pancreáticas para los candidatos que influyen en las interacciones tumor /estroma. Uno de los candidatos sobreexpresa en los CAF fue
ADAM12
.
ADAM12
(una desintegrina y metaloproteasa 12), un regulador de las interacciones célula-célula y célula-matriz, se sobreexpresa en los fibroblastos asociados con el cáncer y está implicada en la progresión del tumor [56]. En primer lugar confirmó la regulación positiva de
ADAM12
mRNA en relación con el control CAF fibroblastos utilizando RT-PCR cuantitativa. De acuerdo con nuestro resultado exón matriz (Fig. 4a),
ADAM12
ARNm fue altamente sobreexpresa en los fibroblastos de control de páncreas derivada de una muestra de pancreatitis (SC3) y nueve CAF en relación con el control de los fibroblastos HPNE y SC2 (fig. 4b).
(a) Affymetrix exón matriz de análisis de
ADAM12
la expresión de ARNm en los CAF pancreáticas y control de los fibroblastos. (B) Análisis de RT-PCR cuantitativa de
ADAM12
la expresión de ARNm en los CAF pancreáticas y fibroblastos de control después de la normalización de
GAPDH
niveles. Cada ensayo se realizó por triplicado. Los datos son medias de tres experimentos independientes; barras son valores de DE.
Para determinar si
ADAM12
fue metilado diferencialmente en los CAF en comparación con el control de los fibroblastos, se realizó la secuenciación de bisulfito de la
ADAM12
promotor del gen de 9 CAF y 3 líneas de fibroblastos de control. Que amplifica una región de aguas arriba 481 pb del
ADAM12
sitio de inicio de transcripción que contiene 38 sitios CpG (Figura 5a). secuenciación de bisulfito reveló que 29 de 38 (76%) eran sitios CpG metilados totalmente en la línea de control de fibroblastos HPNE (Figura 5b). Por el contrario, seis de nueve CAF (CAF12, CAF14, CAF15, CAF16, CAF20, y CAF22) eran completamente (100%) no metilado en todos los sitios CpG. Los restantes fueron parciales CAF metilado en 2 a 7 de 38 sitios CpG no metilado y completamente a todos los otros CpG (Figura 5a). Los fibroblastos de control SC2 y SC3 fueron totalmente metilados en CpG cerca del extremo 5 'de la región secuenciada y parcialmente metilados en CpG cerca del extremo 3' de esta región. Eran totalmente metilado en todos los otros CpG. Por lo tanto, no había hipometilación relativa en múltiples CpG entre los fibroblastos que expresaban
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y los que no lo hizo, lo que implica la hipometilación aberrante de
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como un mecanismo para su sobreexpresión en los CAF de páncreas en comparación con el control fibroblastos pancreáticas
(A) Inicio:.
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estructura y distribución de los dinucleótidos CpG de genes. barras verticales cortas representan sitios CpG. La flecha señala el sitio de inicio de la transcripción. Abajo: el análisis de secuenciación genómica de bisulfito en los CAF pancreáticas y control de los fibroblastos. Los círculos abiertos representan los sitios CpG no metilados, círculos negros sólidos sitios CpG metilados, y eclosionaron círculos sitios CpG metilados parcialmente. (B) cromatogramas de secuenciación de bisulfito de la línea de control y fibroblastos
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promotor en un CAF de páncreas (CAF19) (HPNE). Las flechas señalan los residuos de citosina.
Para determinar si la proteína ADAM12 se sobreexpresa en el estroma de los adenocarcinomas de páncreas primarios, se realizó inmunohistoquímica en microarrays de tejidos. Si bien la expresión de proteínas ADAM12 no se detectó en los fibroblastos que rodea el conducto pancreático normal (Figura 6b), CAF de adenocarcinomas de páncreas primarios fueron positivos para la expresión de proteínas ADAM12 (Figura 6c).