Extracto
Recientemente, inhibidores de histona deacetilasa (HDAC) han surgido como una clase prometedora de medicamentos para el tratamiento de cánceres, especialmente linfoma de células T subcutáneo. En este estudio, hemos demostrado que MPT0E028, una novela derivada de -hydroxyacrylamide
N
inhibidor de HDAC, inhibe el crecimiento de células de colon HCT116 cáncer humano
in vitro
y
in vivo
. Los resultados de NCI-60 screening mostraron que MPT0E028 inhibió la proliferación en ambas líneas celulares de tumores sólidos y hematológicos en concentraciones micromolares, y fue especialmente potente en células HCT116. MPT0E028 tenía una actividad apoptótica fuerte y inhibió la actividad de HDAC más potentemente que SAHA, la primera HDAC terapéutico inhibidor probado por la FDA.
In vivo
modelo murino, el crecimiento de xenoinjerto de tumor HCT116 se retrasó y se inhibe después del tratamiento con MPT0E028 de una manera dependiente de la dosis. Sobre la base de
in vivo
estudio, MPT0E028 mostró una eficacia contra el cáncer más fuerte que SAHA. No hay diferencia significativa de peso corporal u otros efectos adversos se observaron en ambos grupos tratados con SAHA MPT0E028-y. Tomados en conjunto, nuestros resultados demuestran que MPT0E028 tiene varias propiedades y potencial como fármaco terapéutico contra el cáncer prometedor
Visto:. Huang NS, Lee HY, Tsai AC, Peng CY, Lai MJ, Wang JC, et Alabama. (2012) Actividad anticáncer de MPT0E028, una novela potente inhibidor de la histona deacetilasa, en células de cáncer colorrectal humano HCT116
in vitro
y
En Vivo
. PLoS ONE 7 (8): e43645. doi: 10.1371 /journal.pone.0043645
Editor: Manfred Jung, Albert Ludwig Universidad, Alemania |
Recibido: 20 Marzo, 2012; Aceptado: July 24, 2012; Publicado: 22 Agosto 2012
Copyright: © Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado por una beca del Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción inhibidores de la deacetilasa
histonas (HDACI) son una nueva clase prometedora de agentes contra el cáncer. HDACi inhibir la progresión del tumor a través de su capacidad para regular la expresión génica mediante la promoción de la acetilación de histonas y proteínas no histonas [1], [2]. En la actualidad, varios HDACi, incluyendo SAHA, LBH589, PXD101, MS-275, y FK228, se están estudiando en ensayos clínicos para determinar su capacidad para el tratamiento de diversos tumores malignos sólidos y hematológicos [3], [4]. La Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU. (FDA) ha aprobado recientemente SAHA y FK228 para el tratamiento del linfoma cutáneo de células T [5]. inhibidores de HDAC (HDACi) modulan la expresión de varios genes que regulan la apoptosis, la angiogénesis [6], [7], la progresión del ciclo celular y la diferenciación celular. Tienen una toxicidad mínima contra las células normales [8] - [10]. Tomados en conjunto, estos hallazgos son críticos en el diseño de inhibidores de HDAC objetivo de para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades.
Una vista cercana de estos ensayos clínicos con moléculas pequeñas HDACi indicó el ácido hidroxámico o
N
grupo -hydroxyacrylamide juegan un papel importante en la actividad HDAC [11], [12]. Hemos informado anteriormente de identificación de los compuestos 1-sulfonamida que contiene indolina-con actividad aparente contra el cáncer [13], [14]. Sobre la base de las observaciones anteriores, hemos diseñado y sintetizado una serie de nueva clase de inhibidores de la histona desacetilasa. Entre ellos, 3- (1-bencenosulfonil-2,3-dihidro-1H-indol-5-il) -
N
-hidroxi-acrilamida (MPT0E028) tiene la mejor actividad inhibidora de HDAC. En este estudio se analizaron las actividades antitumorales de MPT0E028 en varias líneas celulares de cáncer desde el panel de células de cáncer del NCI-60. Se investigaron los efectos de MPT0E028 en la progresión del ciclo celular y la apoptosis y exploramos posibles mecanismos moleculares que subyacen a su actividad contra el cáncer. Además, se analizó el efecto de MPT0E028 sobre el crecimiento de las células HCT116 de cáncer colorrectal humano
in vivo
, utilizando un modelo de xenoinjerto de tumor, lo que confirma el efecto antitumoral de MPT0E028. Nuestros resultados sugieren que MPT0E028 es un candidato terapéutico prometedor para el tratamiento de cánceres humanos.
(a) NaBH
3CN, AcOH, 0 ° C-t.amb .; (B) (i) cloruro de bencenosulfonilo, piridina, reflujo; (Ii) LiAlH
4, THF, 0 ° C-t.amb .; (Iii) dicromato de piridinio (PDC), tamices moleculares, CH
2Cl
2, Tiempo de retención .; (C) (i) de metilo (triphenylphosphorylidene) acetato de etilo, CH
2Cl
2, Tiempo de retención .; (Ii) 1 M LiOH
(ac), dioxano, 40 ° C; (D) (i) NH
2OTHP, PyBOP, Et
3 N, DMF, t.amb .; (Iii) de ácido trifluoroacético, CH
3OH, t.a. Abreviaturas: NaBH
3CN, cianoborohidruro de sodio; AcOH, ácido acetil; LiAlH
4 (LAH), hidruro de litio y aluminio; THF, tetrahidrofurano; PDC, dicromato de piridinio; NH
2OTHP,
O CD - (tetrahidro-2H-piran-2-il) hidroxilamina; PyBOP, hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorofosfato; Et
3 N, trietilamina; DMF, dimetilformamida; TFA, ácido trifluoroacético.
Materiales y Métodos
Materiales
MPT0E028 y SAHA fue sintetizado por el laboratorio del Dr. Jing Ping-Liou. (Facultad de Farmacia, Facultad de Farmacia, Universidad de Medicina de Taipei, Taiwán), y la pureza es superior al 98% (datos S1). RPMI 1640, M199, suero bovino fetal (FBS), penicilina, estreptomicina, y todos los demás reactivos de cultivo de tejidos se obtuvieron de Life Technologies (Grand Island, NY, EE.UU.). Los anticuerpos contra diversas proteínas se enumeran de la siguiente manera: a-tubulina, PARP, actina, conjugado con HRP anti-ratón y anti-IgG de conejo eran de Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE.UU.); histona 3, la actina, la acetil-μ-tubulina eran de la señalización celular eran de Tecnologías de Señalización Celular (Boston, MA, EE.UU.); caspasa 3 era de imgenex (San Diego, CA, EE.UU.); histona acetil-3 fue de Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, EE.UU.). yoduro de propidio (PI), sulfordamina B (SRB), y todos los demás reactivos químicos se obtuvieron de Sigma Chemical (St. Louis, MO, EE.UU.).
Cell Culture
La línea celular de cáncer colorrectal humano HCT116, línea celular de cáncer de mama MDAMB231 y células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). línea celular de cáncer de ovario NCI-ADR se obtuvo de la pantalla Línea celular tumoral humana DTP (Developmental Therapeutics Program, NCI). células HCT116, MDAMB231 y NCI-ADR fueron cultivadas en RPMI 1640 con 10% de suero inactivado por calor bovino fetal (v /v) y penicilina (100 unidades /ml) /estreptomicina (100 mg /ml). HUVEC se cultivaron en M199 con suero 20% inactivado por calor bovino fetal (v /v) y penicilina (100 unidades /ml) /estreptomicina (100 mg /ml). Todas las células se mantuvieron en un incubador humidificado a 37 ° C en 5% de CO
2/95% de aire.
(A) Efecto dependiente de la concentración de MPT0E028 y SAHA sobre el crecimiento celular. células HCT116 se incubaron con o sin las concentraciones indicadas de MPT0E028 o SAHA para 48 h. El crecimiento celular se evaluó por el ensayo de SRB. Los datos se expresaron como media ± E.E.M. de al menos 3 experimentos independientes. (B) los efectos dependientes de la concentración de MPT0E028 y SAHA en la progresión del ciclo celular. células HCT116 se trataron con o sin las concentraciones indicadas de MPT0E028 o SAHA durante 24 h y se analizaron por citometría de flujo para la distribución del ciclo celular. (C, D) Los datos expuestos son las medias de al menos 3 experimentos independientes. (E) Los efectos dependientes del tiempo de MPT0E028 y SAHA sobre la población subG1. células HCT116 se trataron con o sin 1 mM MPT0E028 o SAHA para el intervalo de tiempo indicado y se analizaron por citometría de flujo para la población subG1. (F) MPT0E028 inducida por la caspasa 3 y la activación de PARP. células HCT116 se trataron con o sin la concentración indicada de MPT0E028 o SAHA por 24 h sujetos a transferencia de Western para la caspasa 3 y el análisis PARP. inducida por apoptosis de las células casepase-dependiente (G) MPT0E028. HCT116 células fueron tratadas sin o con 3 M MPTE028, o SAHA 20 M z-VAD-FMK durante 24 horas y se sometieron a western blot para la caspasa 3 y el análisis PARP.
NCI-60 líneas celulares de rastreo
la proyección líneas celulares de cáncer del NCI-60 se llevó a cabo por el Programa de Desarrollo Terapéutica del Instituto Nacional del cáncer (DTP; http://www.dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.html).
sulforodamina B Ensayo
HCT116, las células MDAMB231 y NCI-ADR se sembraron en placas de 96 pocillos en medio con 5% de suero bovino fetal durante la noche. Las células fueron fijadas con tricloroacético al 10% que representa la población de células en el momento del tratamiento farmacológico (
T
0). Después de la incubación con vehículo (0,1% DMSO), o SAHA MPT0E028 durante 48 h, las células se fijaron con ácido tricloroacético al 10% y después se tiñeron con sulforrodamina B al 0,4% (w /v) en 1% de ácido acético. El exceso de sulforodamina B se eliminó por lavado con ácido acético 1% y las células que contienen un colorante se lisaron con 10 mmol base /L Trizma. La absorbancia se leyó en virtud de longitud de onda de 515 nm. Por el momento cero de medición (
T
0), el crecimiento de control (
C
), y el crecimiento celular en presencia del fármaco (
T
x
), se calculó el porcentaje de crecimiento. Porcentaje de inhibición del crecimiento se calculó como 100 - [(
T
x CD -
T
0) /(
C CD -
T
0)] × 100. La inhibición del crecimiento de 50% (GI
50) se determina en la concentración de fármaco que resulta en la reducción de 50% de aumento total de proteínas en células de control durante la incubación compuesto.
Crystal Violet Ensayo
El HUVECs se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos (5000 células /pocillo) por cuadruplicado. Después de 24 h de incubación, las células se fijaron con 0,1% de cristal violeta /metanol al 20%, lo que representa la población de células en el momento de tratamiento de drogas (
T
0). Otras células se trataron con MPT0E028 o SAHA durante 48 h. Después de 48 h de incubación a 37 ° C, las células se tiñeron con 0,1% de cristal violeta /20% de metanol durante 10 minutos y se lavaron 3 veces. A continuación, el colorante se eluyó por 0,1 M de citrato de sodio /75% de etanol, y la absorbancia se mide a 550 nm.
(A) La inhibición de la actividad HDAC en extractos nucleares HeLa. Los datos se expresaron como la media de al menos 3 experimentos independientes. (B) La inhibición de la actividad total de HDAC por MPT0E028 y SAHA. células HCT116 se trataron con las concentraciones indicadas de MPT0E028 y SAHA durante 24 h, y se aislaron las proteínas nucleares para determinar la inhibición de la actividad total de la enzima HDAC. Los datos se expresan como la media ± E.E.M. de al menos 3 experimentos independientes.
FACScan Citometría de Flujo
Después de que el tratamiento de vehículo (DMSO al 0,1%), MPT0E028 o SAHA para los cursos de tiempo indicados, las células fueron cosechadas por tripsinización, se fijaron con 75% (v /v) de alcohol a 4 ° C durante la noche. Después de la centrifugación, las células se incubaron en 0,1 mol-cítrico fosfato tampón de ácido /L [/L NaHPO
4, ácido cítrico 0,2 mol 0,1 mol /L (pH 7,8)] durante 20 min a temperatura ambiente. Entonces, se centrifugaron y se resuspendieron con 0,5 ml de solución que contiene PI Triton X-100 de las células (0,1%, v /v), RNasa (100 mg /ml), y PI (80 mg /ml). contenido de ADN se analizó con el software FACScan y CellQuest (Becton Dickinson).
células HCT116
(A) fueron tratados con MPT0E028 y SAHA por 24 h en las concentraciones indicadas. Los lisados celulares se prepararon y se sometieron a SDS-PAGE e inmunotransferencia usando acetil-histona H3, H3 histona, acetil-α-tubulina, y los anticuerpos a-tubulina. El análisis cuantitativo de Western blot con ImageQuant (Molecular Dynamics, USA); acetil-histona H3 (B) y acetil α-tubulina (C) se analizaron en células HCT116.
HDAC Ensayos bioquímicos
El
HDAC in vitro
actividades de HDAC humana recombinante 1, 2, 4, 6 y 8 (BPS Biosciences) fueron detectados por liberación fluorigenic de 7-amino-4-metil-cumarina de sustrato sobre la actividad deacetilasa enzimática. La mitad de la concentración inhibitoria máxima (IC
50) se determina en la concentración de fármaco que resulta en la reducción de 50% de aumento de la actividad HDAC en los pocillos de control durante la incubación compuesto.
Todos los tumores crecieron a la 1200-mm
3 volumen de punto final. Los tumores (A) se midieron con regularidad y retraso en el crecimiento se calculó para los grupos de tratamiento en relación con el control de los tumores (TGD). análisis de supervivencia (B) de Kaplan-Meier se basó en el punto final de crecimiento del tumor. (C) La inhibición de las curvas de crecimiento del tumor representado una media ± SEM y cambio porcentual en el volumen medio del tumor (TGI por ciento). Se midieron (D) Los pesos corporales diariamente durante la primera semana y luego 2 veces por semana. La relación en peso corporal se calculó con relación a la medida de referencia. (E)
En vivo
efecto de MPT0E028 en la expresión de caspasa 3, PARP, H3 y la histona acetil-acetil-μ-tubulina en los xenoinjertos de tumores HCT116 a lo determinado por el Western Blot.
HeLa nuclear extracto de Ensayo de la actividad de la HDAC
se midió la actividad de HDAC extracto nuclear HeLa utilizando HDAC fluorescente actividad Kit de ensayo (Biovision, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante [15]. Brevemente, se añadieron el tampón de sustrato fluorométrico y ensayo de HDAC a los extractos nucleares HeLa en un formato de 96 pocillos y se incubó a 37 ° C durante 30 min. La reacción se detuvo mediante la adición de desarrollador lisina, y la mezcla se incubó durante otros 30 minutos a 37 ° C. controles negativos adicionales incluyen la incubación sin el extracto nuclear, sin el sustrato, o sin ambos. TSA en 1 M sirvió como control positivo. Un lector de placas de fluorescencia con excitación a 355 nm y emisión a 460 nm se utilizó para cuantificar la actividad de HDAC. La mitad de la concentración inhibitoria máxima (IC
50) se determina en la concentración de fármaco que resulta en la reducción de 50% de aumento de la actividad HDAC HeLa en el grupo de control durante la incubación compuesto.
Total HDACs enzimática Ensayo de actividad se determinó
HDAC actividad enzimática total con el Boc-Lys (Ac) -AMC kit de ensayo de la actividad HDAC fluorométrico (Biovision, Mountain View, CA, EE.UU.). células HCT116 se trataron con MPT0E028 y SAHA durante 24 h. Las células se recogen luego y los lisados celulares totales se analizaron mediante un Kit fluorométrico HDAC Ensayo de actividad (k330-100; BioVision). Un lector de placas de fluorescencia con excitación a 355 nm y emisión a 460 nm se utilizó para cuantificar la actividad de HDAC. La mitad de la concentración inhibitoria máxima (IC
50) se determina en la concentración de fármaco que resulta en la reducción de 50% de aumento total de la actividad HDAC en el grupo control.
Western Blot Analysis
Después del tratamiento de vehículo (0,1% DMSO), o SAHA MPT0E028 a las concentraciones indicadas, las células se lavaron con PBS enfriado. Para total de lisado, las células se lisaron con el 120 l enfriado en hielo tampón de lisis [10 mmol /L de Tris-HCl (pH 7,4), 150 mmol /L de NaCl, 1 mmol /L EGTA, 1 mmol /L de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 10 mg /ml de aprotinina, 10 mg /ml leupeptina, 1 mM de sodio orthovandate, mM NaF 1, y 1% de Triton X-100]. Los lisados celulares se centrifugaron a 13.000 rpm durante 30 min. Para el análisis de transferencia de Western, la cantidad de proteína (40 mg) se separó por electroforesis en un gel de poliacrilamida al 10% o 15% y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Después de 1 h de incubación a temperatura ambiente en /5% de leche sin grasa PBS, la membrana se lavó con PBS /0,1% y se incubaron con los anticuerpos indicados a 4 ° C durante la noche. Después de lavados con PBS /0,1% de Tween 20, los anticuerpos secundarios correspondientes se han aplicado a las membranas durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron con PBS /0,1% de Tween 20 y se realizó la detección de la señal con un kit de detección de quimioluminiscencia (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido).
In vivo
Implantación y Tumor crecimiento
Las células de adenocarcinoma de colon HCT116 humanos utilizados para la implantación fueron cosechadas durante la fase logarítmica de crecimiento y se resuspendió en solución salina tamponada con fosfato a 5 × 10
7 células /ml. Cada ratón se inyectó s.c. en el flanco derecho con 1,0 × 10
7 células (0,2 ml de suspensión celular). Los tumores se monitorizaron dos veces por semana y luego diariamente como sus volúmenes se acercaron a 1.200 mm
3. El tamaño del tumor, en mm
3, se calculó a partir de: anchura donde
w =
y
l = longitud en mm
del tumor. El volumen del tumor = (
w
2 ×
l
) /2. Todos los experimentos con animales siguieron las normas éticas y protocolos han sido revisados y aprobados por el Comité de Dirección de la Universidad Nacional de Taiwán (IACUC Número de Registro: 20100225) Uso y Animales
Ratones
Mujer ratones desnudos atímicos-. fueron 8 semanas de edad, y tenía un rango de peso corporal (PC) de 17,2 a 22,0 g, en D1 del estudio. Los animales fueron alimentados ad libitum agua (ósmosis inversa, 1 ppm Cl) y PicoLab Rodent Diet 20 modificado y irradiado Lab Diet® que consiste en proteína de 20,0% crudo, 9,9% de grasa cruda, y 4,7% de fibra cruda. Los animales fueron alojados en la Universidad Nacional de Taiwán Laboratory Animal Center, NTUMC, en un ciclo de luz de 12 horas a 21-23 ° C y 60-85% de humedad.
Los análisis estadísticos y gráficos
se utilizó la prueba de rango logarítmico para determinar la significación estadística de la diferencia entre los valores TTE de dos grupos, a excepción de cualquier muerte NTR. Los análisis estadísticos y gráficos se realizaron con Prism 3.03 (GraphPad) para Windows. Los análisis estadísticos de dos colas se llevaron a cabo a
P = 0,05
. Kaplan-Meier parcelas muestran el porcentaje de animales que permanecieron en el estudio en función del tiempo. Los gráficos de Kaplan-Meier utilizan los mismos conjunto de datos como la prueba de rango logarítmico.
El crecimiento del tumor curvas muestran el volumen tumoral medio del grupo, en una escala logarítmica en función del tiempo. Cuando un animal abandona el estudio debido a el tamaño del tumor o la muerte TR, el volumen final del tumor registrado para el animal se incluye con los datos utilizados para calcular la mediana en puntos de tiempo posteriores. Por lo tanto, el volumen de tumor medio final que se muestra por la curva puede diferir de la MTV, que es el volumen medio del tumor para los ratones restantes en el estudio en el último día (con exclusión de todo con tumores que han alcanzado el punto final). Si se produce más de una muerte TR en un grupo, las curvas de crecimiento tumoral se truncan en el momento de la última medición que precede a la segunda muerte TR. curvas de crecimiento del tumor también se truncan cuando los tumores en más de 50% de los animales evaluables en un grupo se han convertido en el volumen de punto final. (*
p Hotel & lt; 0,05; **
p Hotel & lt; 0,01; ***
p Hotel & lt; 0,001, en comparación con el grupo de control respectivo).
in vitro
Análisis estadístico
los datos se expresaron como media ± SEM del número indicado de experimentos separados. El análisis estadístico de los datos se realizó con ANOVA de un factor seguido por el
t
prueba, y
p Hotel & lt; 0,05 se consideró significativo. (*
p Hotel & lt; 0,05; **
p Hotel & lt; 0,01; ***
p Hotel & lt; 0,001, en comparación con el grupo de control respectivo).
resultados
La síntesis de MPT0E028
La síntesis de MPT0E028 (1) se representa en la figura 1. disponible en el mercado de indol-5-carboxilato de (2) se hizo reaccionar con cianoborohidruro de sodio en presencia de ácido acético, proporcionando el metil indolina-5-carboxilato de metilo (3) con un rendimiento del 93%. La
N
1-sulfonilación de indolina (3) con cloruro de bencenosulfonilo en piridina y luego LiAlH reducción C5-éster
4 mediada por, seguido por la oxidación PDC produjo el deseado 1-benzenesulfonylindoline-5-carbaldehído (4) en el 42% de rendimiento (3 pasos). reacción de Wittig de acetato de metilo (trifenilfosforaniliden) con el 4T indolina-5-carboxaldehído y el tratamiento de hidróxido de litio (LiOH) en MeOH dio el ácido cinámico (5) con un rendimiento del 73%. La conversión de ácido carboxílico (5) en el ácido hidroxámico (1) se llevó a cabo con un rendimiento del 72% en el tratamiento de NH
2OTHP en presencia de PyBOP y Et
3 N, seguido de la desprotección mediada por ácido trifluoroacético. La información experimental detallado para la preparación de MPT0E028 está disponible en la sección suplementaria.
El efecto de MPT0E028 sobre la proliferación de líneas celulares de cáncer
Para determinar si MPT0E028 muestra actividad contra el cáncer en el cáncer humano células, hemos probado la actividad anti-proliferativa de MTP0E028 utilizando el panel de líneas celulares de cáncer de cribado del NCI-60 [16]. Como se muestra en la Tabla 1, MPT0E028 inhibió significativamente la proliferación celular en todas las líneas celulares de cáncer humano examinados a concentraciones micromolares, pero era especialmente potente en la línea celular HCT116. Por lo tanto, se optó por células HCT116 para estudios posteriores de la actividad anticancerígena de MPT0E028
in vitro
y
in vivo
.
MPT0E028 Significativamente inducido apoptosis de las células HCT116
en primer lugar, hemos demostrado que MPT0E028 inhibe el crecimiento de células HCT116 de una manera utilizando el ensayo SRB dependiente de la concentración (GI
50 = 0,09 ± 0,004 M) (Figura 2A). Otras dos líneas celulares, MDA-MB-231 y NCI-ADR desde el panel de selección NCI-60, también se eligieron para analizar la sensibilidad de MPT0E028 (MDAMB231, GI
50 = 0,19 ± 0,04 M; NCI-ADR, GI
50 = 0,14 ± 0,02 M). MPT0E028 también inhibió la proliferación celular significativamente en estas dos líneas celulares (datos S2A, S2B), pero mostró menos sensible en comparación con HCT116. También se determinó el margen de seguridad de MPT0E028 en las células normales humanas (HUVEC) por ejemplo, y se encontró que MPT0E028 muestran 20-40 pliega menos sensible frente a las células normales (GI
50 = 3,57 ± 0,45 M), lo que sugiere MPT0E028 se dirige específicamente a las células tumorales malignas (datos S2C). Para investigar el efecto de MPT0E028 en la progresión del ciclo celular, el contenido de ADN celular se midió por citometría de flujo. Hemos demostrado que el tratamiento con MPT0E028 aumentó el número de células en la fase sub-G1 del ciclo celular (Figura 2B y 2C). El compuesto de referencia era un HDACi, ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA; vorinostat), con un GI
50 de 0,82 ± 0,07 mM, que exhibe actividad antiproliferativa (Figura 2A) y la apoptosis inducida en células HCT116 (Figura 2B y 2D) en de una manera dependiente de la concentración, pero mostró menos eficaz en comparación con MPT0E028. Como se muestra en la Figura 2E, MPT0E028 también indujo la población sub-G1 de una manera dependiente del tiempo, mientras que SAHA mostró un efecto más débil y el retraso en la citotoxicidad. MPT0E028 también indujo la caspasa 3 y la activación de PARP en una manera dependiente de la concentración (Figura 2F). apoptosis inducida por MPT0E028 cuando se abolió el tratamiento concomitante con inhibidores de la caspasa-z-VAD-FMK, lo que sugiere que la apoptosis inducida por MPT0E028 través de la vía dependiente de caspasa. Estos resultados sugieren que MPT0E028 indujo células HCT116 citotoxicidad a través de la vía de la apoptosis.
MPT0E028 es un inhibidor de HDAC Actividad
examinó el efecto de MPT0E028 sobre la actividad de HDAC, utilizando un panel de proteínas HDAC recombinantes humanos, y compararon su actividad a SAHA. Como se muestra en la Tabla 2, MPT0E028 inhibió significativamente HDAC1 y HDAC2 de la clase I, así como HDAC6 de la clase IIb a bajas concentraciones nanomolares. Mientras MPT0E028 era más potente que SAHA contra HDAC1 recombinante y 2, tiene poca actividad contra HDAC4 recombinante y HDAC8, que es similar al patrón de inhibidor de SAHA. Se confirmó que MPT0E028 inhibió la actividad de HDAC nuclear en la línea celular de adenocarcinoma cervical HeLa (IC
50 = 11,1 ± 2,8 nM) y en las células HCT116 (IC
50 = 4,43 ± 0,5 M), que fueron de aproximadamente 9-30 veces más potente que SAHA (IC
50 = 118,8 ± 13,2 nM y 129,4 ± 13,9 mu M, respectivamente) (Figura 3A y 3B). El potentes HDACs efecto inhibidor de MPT0E028 también se pudo observar en MDAMB231 y las células NCI-ADR (datos S3). Estos resultados sugieren que MPT0E028 es un novedoso y potente inhibidor de HDAC.
Efectos de MPT0E028 en α-tubulina y la histona H3 acetilación en las células HCT116
Debido α-tubulina y la histona H3 son objetivos de abajo comunes de las HDAC, se examinaron los efectos de MPT0E028 en α-tubulina y la acetilación de la histona H3 en células HCT116 utilizando análisis de Western blot. Como se muestra en la Figura 4, MPT0E028 inducida hyperacetylation más fuerte de la histona H3 que la de SAHA (Figura 4A y 4B), que es consistente con su potente efecto inhibidor sobre la clase I HDAC1 y 2. Por el contrario, SAHA exhibió más potente acetilación α-tubulina que MPT0E028 (Figura 4A y 4C), lo que sugiere que SAHA es más potente contra la clase IIb HDAC6, que es coherente con nuestra conclusión en la Tabla 2.
MPT0E028 inhibe el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de colon humano
in vivo
por último, se evaluó la eficiencia de MPT0E028 y SAHA utilizando
in vivo
xenoinjertos tumorales HCT116 en un modelo de ratón desnudo (Figura 5A y 5B) (Tabla 3). Una vez que un tumor era palpable con el tamaño de aproximadamente 55 mm
3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en grupos de control y tratamiento de vehículo (8 ratones por grupo). Los ratones de control recibieron el vehículo (0,5% de carboximetilcelulosa + 0,1% Tween 80). Los tumores en los 3 grupos se les permitió llegar a un volumen de punto final de 1.200 mm
3. La mediana del tiempo hasta el punto final (ETT) para los ratones de control fue de 16,6 días. En los ratones que fueron tratados por vía oral con SAHA (200 mg /kg, diariamente), la TTE aumentó a 27,0 días, lo que corresponde a un T-C de 10,0 días y un retraso del crecimiento del tumor por ciento (TGD) de 63%. Según el análisis de rango logarítmico, SAHA produjo actividad antitumoral significativa (
P
= 0,0251). El tratamiento oral con MPT0E028 (200, 100, y 50 mg /kg, al día) aumentó el TTE medio para 36.9, 19.2, y 15.5 días, respectivamente, correspondiente a una TC de 20, 2,6 y 0 días y medio por ciento TGD de 122 %, 16% y 0%, respectivamente. Con base en el análisis del rango logarítmico, MPT0E028 muestra actividad antitumoral significativa, a 200 mg /kg (
P = 0,0031)
. Notablemente, 3 ratones en un grupo que fueron tratados con 200 mg /kg MPT0E028 y 1 ratón en otro grupo que fue tratado con 100 mg /kg MPT0E028 mostraron regresión completa del tumor después del tratamiento (Tabla 3). Además, los ratones también se les administró una vez al día durante 15 días a través de la administración oral para evaluar la inhibición del crecimiento del tumor después del tratamiento MPT0E028. se encontró que el crecimiento del cáncer HCT116 células xenoinjertos fue suprimida por 73,5%, 32,0% y 21,9% (por ciento de inhibición del crecimiento del tumor [TGI] valores) después del tratamiento con MPT0E028 en 200, 100, y 50 mg /kg, respectivamente, mientras SAHA a 200 mg /kg suprimió el crecimiento tumoral por 47,7% (% TGI) (Figura 5C). No hubo diferencias significativas en el peso corporal u otros efectos adversos se observaron tras el tratamiento con MPT0E028 (Figura 5D). También se determinó el efecto de MPT0E028 en la expresión de caspase3, PARP, H3 histona acetil-y acetil-μ-tubulina
in vivo
en los tejidos tumorales HCT116 de xenoinjerto. Los ratones fueron tratados con 200 mg /kg MPT0E028 o SAHA durante 7 días (oral, diario) y luego los tumores se retiraron cuidadosamente y se sometieron a análisis de transferencia Western. Como se muestra en la Figura 5E, la caspasa 3, PARP y H3 acetil-histona se indujeron sustancialmente en grupo tratado con MPT0E028 mientras acetil-μ-tubulina se encontraron más profundamente en el grupo tratado con SAHA, que es consistente con nuestro hallazgo
in vitro
. Tomados en conjunto, MPT0E028 indujo un retraso y la inhibición del crecimiento tumoral dependiente de la dosis y se muestra la actividad anti-tumor más fuerte
in vivo
de SAHA.
Discusión
HDACs son objetivos importantes para la terapia de cáncer debido a su capacidad para regular transcripcionalmente la expresión de genes que están involucrados en la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis [17], [18]. HDACi están actualmente en ensayos clínicos para el tratamiento de tumores sólidos y en pacientes con leucemia. Dos HDACi, SAHA y FK228, han recibido la aprobación de la FDA para el tratamiento de pacientes con linfoma cutáneo de células T. En este estudio, se presenta la síntesis de un nuevo compuesto químico 3- (1-bencenosulfonil-2,3-dihidro-1H-indol-5-il) -
N
-hidroxi-acrilamida (MPT0E028), que tiene una actividad potente HDACi. MPT0E028 fue diseñado sobre la base de nuestra investigación previa con agentes desestabilizantes de microtúbulos utilizando indolina-1-arilsulfonamidas como una estructura de núcleo [13], [14]. Tras el acoplamiento de un
N
-hydroxyacrylamide grupo funcional en la posición 5 del anillo de indolina, que dio como resultado el MPT0E028 deseada.
Además, se evaluó la actividad anti-cáncer de MPT0E028 i
n vitro
y
in vivo
. Se encontró que la citotoxicidad inducida MPT0E028 en numerosas líneas celulares de cáncer humano de los paneles NCI-60 y llevamos a cabo estudios sobre el mecanismo en las células HCT116, que mostraron una alta sensibilidad a MPT0E028. Cuando se compara con SAHA, el tratamiento con MPT0E028 indujo inhibición más fuerte de la célula de cáncer (GI
50 = 0,82 ± 0,07 M y 0,09 ± 0,004 M, respectivamente), pero no el crecimiento celular normal (GI
50 = 3,57 ± 0,45 M) y produjo un número significativamente mayor de células sub-G1 (apoptosis) como se determinó mediante citometría de flujo. Además, MPT0E028 inducida con mayor profundidad la caspasa 3 y la activación de PARP. Tomados en conjunto, MPT0E028 inhibe el crecimiento de células cancerosas e induce la apoptosis la muerte celular.
Hemos demostrado que MPT0E028 inhibe la actividad de HDAC1, HDAC2 y HDAC8 en la clase I, así como HDAC6 en la clase IIb, pero no en la clase HDAC4 IIa, e induce constantemente la acetilación de las histonas H3 y α-tubulina. HDACs de clase I se ha demostrado que se sobreexpresa en células de cáncer colorrectal humano [19], que pueden contribuir a la proliferación de células de cáncer perturbado, diferenciación y apoptosis por tanto la modificación epigenética o no epigenética [20], [21]. La inhibición de la actividad HDAC induce la vía intrínseca y extrínseca de apoptosis, lo que lleva a la muerte celular del cáncer [22], [23]. Además, HDACi podría inducir la expresión de p21 mediante la estabilización y la inducción de la actividad transcripcional de RUNX3, lo que lleva a la inducción de apoptosis de las células del cáncer [24], [25]. La inhibición de la actividad HDAC por MPT0E028 era 10-30 veces más fuerte que la de SAHA en HeLa y células HCT116.
Finalmente, se analizó la eficacia de MPT0E028 contra el crecimiento de células de adenocarcinoma colorrectal humano HCT116 en ratones. La mediana del crecimiento tumoral y análisis de la curva de Kaplan-Meier demostraron una fuerte actividad antitumoral de MPT0E028. La administración diaria de MPT0E028 resultó en una actividad antitumoral significativa. Por otra parte, en comparación con SAHA, MPT0E028 muestra actividad antitumoral más fuerte. Basándose en estos resultados, MPT0E028 es una novela HDACi sintético con propiedades farmacológicas únicas que se debe probar en la terapia del cáncer colorrectal humano.
En resumen, hemos identificado un nuevo inhibidor de la actividad de HDAC, MPT0E028, con actividad antitumoral
in vitro
y
in vivo
. Los resultados presentados aquí muestran que MPT0E028 inhibe la actividad de HDAC y tiene propiedades antitumorales que son más potentes que SAHA, que está actualmente en uso clínico en el linfoma de células T subcutáneo. Por lo tanto, MPT0E028 es adecuado para pruebas adicionales como un nuevo agente anti-cáncer.
Apoyo a la Información
datos S1.
Química. resonancia magnética nuclear (
1H RMN) se obtuvieron con DRX-500 espectrómetro Bruker (que funciona a 500 MHz), con desplazamiento químico en partes por millón (ppm,
δ
) campo abajo de TMS como interna estándar. Los espectros de masas de alta resolución (HRMS) se midieron con un espectrómetro de masas por impacto de electrones JEOL (JMS-700) (EI).