Extracto
Antecedentes
La glicosilación es una modificación post-translacional importante y universal para muchas proteínas y regula las funciones de la proteína. Sin embargo, los métodos simples y rápidos para analizar los glicanos en las proteínas individuales no han estado disponibles hasta hace poco.
Métodos /Principales conclusiones
Una nueva técnica para analizar glicopéptidos de una manera muy sensible por asistida por matriz láser de desorción /ionización de espectrometría de masas (MALDI-MS) usando el 3AQ matriz líquida /CHCA fue desarrollado recientemente y que optimiza esta técnica para analizar una pequeña cantidad de proteína transmembrana separados por SDS-PAGE. Se utilizó el método MALDI-MS para evaluar el estado de glicosilación de tipo membrana de metaloproteinasas de matriz 1 (MT1-MMP).
O
-glycosylation de MT1-MMP se divulga para modular su actividad de proteasa y por lo tanto afectan a la invasión de las células cancerosas. MT1-MMP expresa en las células HT1080 de fibrosarcoma humano se inmunoprecipitó y se resolvieron por SDS-PAGE. Después de la digestión tríptica en gel de la proteína, se aplicó una sola gota de la digestión directamente a la matriz de líquido en una placa diana MALDI. Concentración de glucopéptidos hidrófilos dentro de la zona central se produjo debido a la evaporación gradual de la solución de muestra, mientras que los péptidos hidrófobos no glicosiladas se mantuvieron en la periferia. Esta separación específica y la concentración de los glicopéptidos habilitadas análisis exhaustivo de la MT1-MMP
O
-glycosylation.
Conclusiones /Importancia
Se demuestra, por primera vez, heterogénea
O
-glycosylation perfil de una proteína por un análisis de proteína entera usando MALDI-MS. Puesto que se informó que las células cancerosas tienen glicosilación alterada de proteínas, este método fácil de usar para el análisis de glicopéptido se abre la posibilidad de identificar los patrones de glicosilación específicos de proteínas que se pueden utilizar como nuevos biomarcadores para tumores malignos.
cita: Shuo T, N Koshikawa, Hoshino D, T Minegishi, Ao-Kondo H, Oyama M, et al. (2012) La detección de la heterogénea
O
-Glycosylation Perfil de MT1-MMP expresa en las células cancerosas mediante un método MALDI-MS simple. PLoS ONE 7 (8): e43751. doi: 10.1371 /journal.pone.0043751
Editor: Nikos K. Karamanos, Universidad de Patras, Grecia
Recibido: 5 de Abril, 2012; Aceptado: 27 Julio 2012; Publicado: 22 Agosto 2012
Copyright: © Shuo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención-en-Ayudas para jóvenes científicos (B) [22700375] (TS), una subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (S) [22220014] (MS) y el Programa Global COE "Centro de Educación e Investigación para el Genoma avanzada - Based Medicine - para la medicina personalizada y el control de enfermedades infecciosas en todo el mundo "(a TS y MS) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT) de Japón. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. SS y SI, y KT son empleados de Shimadzu Corporation. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
La glicosilación es una co común y altamente diversa y modificación de proteínas después de la traducción [1 ]. La acumulación de pruebas indica que la adición o modificación de uno o más restos de azúcar pueden tener diversos efectos sobre la función de proteínas y tales modificaciones han sido implicados en diferentes tipos de enfermedad [2]. En particular, los cambios, específicos en proteínas
O
-glycosylation han sido reportados en los tumores malignos [3], [4], [5].
O
-glycosylation se inicia por la adición de un
N -acetylgalactosamine (GalNAc)
a un grupo hidroxilo en un residuo de serina o treonina seguido de la posterior adición de galactosa o
N
acetilglucosamina (GlcNAc), que forma la estructura del núcleo de la cadena de glicano [6]. Core
O
-glycans se puede ampliar aún más por otros restos de carbohidratos tales como fucosa, ácido y /o siálico. Se ha informado de que las estructuras de núcleo de
O
-glycans están implicados en la capacidad metastásica de las células cancerosas. Por ejemplo, Iwai
et al
. mostró que la expresión forzada de β1,3-
N
-acetylglucosaminyltransferase 6, que añade β1,3-GalNAc ligado a GlcNAc en los término de reducción, en las células de fibrosarcoma humano FP-10 (una variante altamente invasiva de las células HT1080 ) dio lugar a una reducción significativa en
in vitro
capacidad de migración y en la formación de metástasis pulmonares
in vivo en ratones
[7].
MT1-MMP es un tipo I proteinasa transmembrana que juega un papel crucial en la invasión de células tumorales, debido a su capacidad para escindir un amplio espectro de macromoléculas de la matriz extracelular incluyendo colágenos y lamininas, y para activar proMMP-2 [8]. MT1-MMP tiene una estructura de múltiples dominios con un dominio catalítico (Thr
112-Gly
285), un dominio bisagra (Glu
286-Ile
318), un dominio hemopexina ( Cys
319-Cys
508) y un dominio del tallo (Pro
509-Ala
541) en la región extracelular [9]. Estudios recientes indican que la MT1-MMP es modificado después de la traducción por
O
-glycan en múltiples sitios dentro del dominio bisagra. Esta modificación ha sido implicado en el reconocimiento de sustrato [10], estabilidad de la proteína [11], y la rotación de la enzima [12]. Por ejemplo, Wu
et al
. mostró que MT1-MMP
O
-glycosylation afecta a la activación de proMMP-2 en la superficie celular [10]. Posibles sitios de glicosilación de MT1-MMP fueron sugeridas por análisis de la secuencia de aminoácidos y la mutagénesis dirigida al sitio [10], [13] y los restos de glicanos fueron analizados mediante lectinas y glicosidasas [10], [11]. MT1-MMP se expresa generalmente en niveles bajos (1-2 x 10
5 moléculas /célula), incluso en las células del cáncer [14]. Por lo tanto, estos métodos bioquímicos no son adecuados para analizar el estado de glicosilación heterogénea de MT1-MMP, en particular en muestras clínicas.
MALDI-MS [15], [16] es una herramienta analítica indispensable para dilucidar tanto el péptido y restos de glicanos de glicopéptidos [17]. Sin embargo, glicopéptidos son generalmente más ineficiente ionizados que los péptidos no glicosilados, y además, la cantidad de glicopéptido generado por la digestión de la proteasa de una muestra de proteína es por lo general bastante pequeña en comparación con la del péptido no glicosilada. Por lo tanto, se requiere inevitablemente separación previa de péptidos glicosilados y no glicosilados para el análisis de MS [18]. Una técnica MALDI desarrollado recientemente el uso de una matriz líquida 3AQ /CHCA, que se compone de ácido 3-aminoquinolina y α-ciano-4-hidroxicinámico, permitió la separación en-blanco de péptidos glicosilados y no glicosilados en base a las diferencias en su carácter hidrófilo después de una gotita de proteasa digestión se aplica sobre la matriz de líquido en una placa diana MALDI [19]. Se empleó este método de separación en el blanco para analizar
N
-glycosylation de la ribonucleasa B, que se utiliza como modelo glicoproteína. Aquí hemos aplicado y optimizado el nuevo método MALDI-MS para analizar el
O
-glycosylation perfil de MT1-MMP expresada en las células cancerosas en un nivel bajo y tratamos de detectar el estado de modificación heterogénea.
resultados
Separación en el blanco de los péptidos en un líquido de matriz 3AQ /CHCA
los péptidos de diferente carácter hidrófilo se puede separar de la matriz líquida 3AQ /CHCA manchas sobre una placa diana MALDI [19] . La matriz 3AQ /CHCA forma un punto viscoso de color amarillo cuando se aplica a la placa del objetivo como se ilustra en la Fig. 1A. Una sola gota de proteolítica Recopilación de una muestra de proteína que contiene péptidos tanto glicosiladas y no glicosiladas es luego manchado sobre la superficie de la matriz de líquido. La muestra se extienda uniformemente en la matriz líquida y la solución de muestra se evapora poco a poco dentro de aproximadamente 12 min (fig. 1B). Durante la evaporación, los componentes hidrófilos tales como los glucopéptidos se concentran en la zona central. En contraste, los péptidos hidrófobos tienden a ser excluidos de la solución se evapora y se dejan en la periferia de la matriz de líquido.
(A) Representación esquemática del método de separación en-blanco se describe en este estudio. 3AQ /CHCA se detecta primero sobre la placa diana de MALDI, y luego los digiere las proteínas enteras proteolíticas que contienen péptidos tanto glicosiladas y no glicosiladas se aplica a la superficie superior de la matriz de líquido. (B) Tiempo de monitoreo curso de la gota de muestra en la matriz líquida. La evaporación de la solución de la muestra permite la gotita para reducir el tamaño de tal manera que los componentes hidrofílicos se concentran gradualmente en una gotita enfocada.
Detección de glucosilada péptidos de Endógeno MT1-MMP
MT1-MMP es una proteinasa de membrana integral expresado en la superficie de células de cáncer agresivos. Primero se intentó detectar el espectro MS generado a partir de los glicopéptidos de MT1-MMP expresada en células cancerosas. Endógeno MT1-MMP se inmunoprecipitó a partir de lisados de membrana de células de fibrosarcoma HT1080 humano usando un anticuerpo monoclonal anti-MT1-MMP preparado en nuestro laboratorio como se describe en
Materiales y Métodos
. ácidos siálico, que resisten la ionización en el análisis de MS [20], fueron eliminadas mediante sialidasa. Las muestras fueron luego separados por SDS-PAGE (Fig. 2A). Diluciones de albúmina de suero bovino (BSA) también se aplicaron al gel para estimar la cantidad de proteína (datos no mostrados). El gel se tiñó con azul de Coomassie y se cortó aproximadamente 150 ng de la proteína MT1-MMP (Fig. 2A, la banda se encuentra entre corchetes). El fragmento de gel aislado se sometió a digestión en gel con tripsina y una sexagésima parte de la digestión se aplican directamente sobre la matriz 3AQ /CHCA en una placa MALDI objetivo.
(A) Endógeno MT1-MMP se inmunoprecipitó con la resina conjugada con anticuerpo anti-MT1-MMP a partir de lisados de membrana de las células HT1080 de tipo salvaje y se separó adicionalmente mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie. Sialidasa, que contiene BSA como proteína transportadora, se cargó en el carril de la luz (denotado por asterisco). Los números de la izquierda del panel representa masas moleculares en kilodaltons (kDa). (B) La banda de polipéptido que corresponde a MT1-MMP se escindió, se digirieron en gel con tripsina. Una alícuota de MT1-MMP digesto tríptico derivado de las células HT1080 se aplica directamente sobre la matriz líquida 3AQ /CHCA en la placa de MALDI objetivo. Se obtuvo el espectro MS dentro de la zona central de la matriz líquida (círculo abierto [○]). Una imagen de microscopio estereoscópico de punto de la muestra se muestra en el inserto superior izquierda. Número representa la intensidad acumulativa del pico superior (unidades arbitrarias).
El tríptico MT1-MMP compendio aplica a la matriz de líquido sobre una placa diana MALDI se dejó evaporar y la parte central de la muestra zona de carga se irradió con un rayo láser (Fig. 2B, imagen insertada). El espectro de MS generado compuesto por varios picos (
m /z
2,042.5, 2,245.1, 2,406.9, 2,609.7, 2,771.6, 2,974.0 y 3,135.8) y las distancias entre los picos correspondían exactamente a las masas de monosacáridos típicos: 162 y 203 Da de hexosa (Hex) y
N
-acetylhexosamine (HexNAc), respectivamente (Fig. 2B). Por lo tanto, se pensaba que estos picos que se derivan de un único péptido glicosilada diferencialmente.
Análisis de péptidos glucosilada
Para investigar más a fondo los picos de glicopéptidos derivados de MT1-MMP por etapas segunda y tercera de la esclerosis múltiple análisis (MS
2 y MS
3), se utilizó una bandera de etiquetado MT1-MMP (MT1-FLAG) expresado en las células HT1080 debido a la razón por la que una gran cantidad de la proteína marcada con FLAG se puede purificar fácil y eficiente. Para reproducir el patrón de glicosilación nativo de MT1-MMP en las células, MT1-FLAG se expresó de forma estable en un nivel comparable a la de la proteína endógena en las células de tipo salvaje. Hemos expresado MT1-FLAG en un derivado HT1080 en la que la expresión endógena de MT1-MMP fue derribado mediante shRNA. Los niveles de expresión de MT1-MMP en las células se confirmaron por análisis de transferencia Western (Fig. S1A). MT1-FLAG se purificó a partir de lisados de membrana de las células revertientes utilizando anticuerpos anti-FLAG. Aproximadamente 400 ng de la proteína MT1-FLAG se resolvió por SDS-PAGE (Fig. S1B) y después se analizaron por el método de separación en blanco a través de MALDI-MS.
El espectro de MS obtenido de MT1-FLAG fue casi idéntica a la de la endógeno MT1-MMP (Fig. 3 en comparación con la Fig. 2B), a excepción de un FLAG-tag hidrófilo (DYKDDDDK) que contienen el pico de péptido a
m /z
1,786.9 en MT1-FLAG. La disociación inducida por colisión de iones protonada importante [M + H]
+ picos (
m /z
2,042.6, 2,245.0, 2,406.3, 2,608.6, 2,770.1, 2,972.6 y 3,134.2) a través de MS
2 indicaba que los iones de fragmentos corresponden a una serie de pérdidas de monosacáridos a partir del péptido glicosilada
299TTSRPSVPDKPK
310 (Fig. 4). Las glicoformas de este péptido contenían 2-5 Hex y HexNAc. Los espectros de iones fragmento también se obtuvieron de otra glicopéptido
278GIQQLYGGESGFPTK
292 como un ion sodiated [M + Na]
+ pico a
m /z
1,968.7 (Fig. S2A). El ion de productos MS
2 a
m /z
1,024.0 ha demostrado ser un Hex-HexNAc péptido que contiene
287SGFPTK
292 por MS
3 fragmentación (Fig. S2 B). Un resumen de los glicopéptidos identificados se indican esquemáticamente en la estructura de MT1-MMP (Fig. 5). Por lo tanto, hemos sido capaces de detectar péptidos glicosilados de MT1-MMP por análisis de MS de un extracto de proteína entera a partir de un gel. Tales picos de glicopéptidos no se obtuvieron cuando la misma muestra se analizó utilizando un DHB convencional sólido matriz [21] tal como se presenta en la Fig. S3. Estos resultados indican claramente la superioridad del nuevo método que utiliza la matriz líquida 3AQ /
Una alícuota del tríptico MT1-FLAG digerido se aplicó directamente sobre el líquido de matriz 3AQ /CHCA CHCA.. Se obtuvo el espectro MS dentro de la zona central de la matriz de líquido. Los restos de glicanos y las secuencias de aminoácidos de péptidos que incluyen sitios de glicosilación de estos glicopéptidos fueron asignados por MS
2 y MS
3. Número representa la intensidad acumulada del pico superior (unidades arbitrarias).
picos de iones derivados de la MS espectro de tríptico resúmenes MT1-FLAG a
m /z
2,042.6, 2,245.0, 2,406.3, 2,608.6, 2,770.1, 2,972.6 y 3,134.2 (Fig. 3) fueron sometidos a MS
2 análisis. Estos fragmentos de iones fueron asignados a la pérdida de monosacáridos individuales (162 y 203 Da para Hex y HexNAc, respectivamente) de la misma péptido de iones (
299TTSRPSVPD
307).
MT1- MMP es una transmembrana de tipo I de proteinasa, y tiene una estructura multidominio particular, con un dominio catalítico, un dominio de bisagra, un dominio de hemopexina y un dominio de tallo en la región extracelular. Subrayados indican glicopéptidos identificados en este estudio.
heterogénea glicosilación Perfil de MT1-MMP
Con el fin de preparar una muestra de proteína estándar para establecer las condiciones de ensayo para el análisis de los glucopéptidos, se preparó una soluble MT1-MMP, que carece del dominio transmembrana que se expresa en las células de riñón canino Madin-Darby (MDCK). Resultado del análisis MS de la soluble MT1-MMP se presenta en la Fig. S4. Sólo se detectó un pico principal glicopéptido para el péptido
299TTSRPSVPDKPK
310. Por otra parte, se detectaron múltiples picos de glicopéptidos de la misma péptido de MT1-FLAG expresa en las células HT1080 (Fig. 3). Por lo tanto, el patrón de glicosilación de MT1-FLAG obtenido a partir de células HT1080 representa un perfil de glicosilación heterogénea del péptido y no es debido a la degradación o modificación de los restos de hidratos de carbono durante la preparación de la muestra y su aplicación al análisis de MS. En conjunto, esto en el blanco método de separación puede convertirse en una poderosa herramienta fácil de usar para analizar los patrones de glicosilación de proteínas heterogéneas de elección.
La detección de los péptidos no glicosilada en la misma placa de destino
MS espectros de glicopéptidos se preferentemente obtenido a partir de la zona central de la matriz de la muestra cargada. Este resultado indica que hemos logrado la separación de péptidos glicosilados y no glicosilados de la matriz de líquido. Para confirmar aún más la separación de los péptidos no glicosilados de la matriz, se analizó la periferia del área de la muestra cargada en la matriz de líquido por la radiación láser. De hecho, muchos péptidos no modificados derivados de la MT1-MMP digesto se detectaron (Fig. S5, picos marcados por las estrellas), mientras que los glicopéptidos no se detectaron dentro de esta área.
En general, hemos logrado el 50% de cobertura de secuencia de aproximadamente la región extracelular de MT1-MMP usando este método (Fig. S6). Por lo tanto, un análisis de proteína entera de péptidos glicosilados y no glicosilados se llevó a cabo después de SDS-PAGE convencional, en la digestión-gel, y aplicación directa de una sola gota de una muestra a digerir en la 3AQ matriz líquida /CHCA en la placa diana MALDI.
Límite inferior de la cantidad de proteína para el ensayo
finalmente determinó la MS espectros generados a partir de glicopéptidos dentro de una cantidad más pequeña de la proteína de la muestra. Diferentes cantidades de proteína MT1-FLAG se sometieron a SDS-PAGE y el gel se tiñó con azul de Coomassie. La cantidad de la MT1-FLAG se estimó utilizando BSA como proteína estándar (Fig. 6A). Las porciones del gel que contiene las proteínas de la muestra se extirparon y se analizaron de manera similar (Fig. 6B). A pesar de las intensidades de los picos de los espectros de MS disminución de acuerdo con la cantidad de muestra, se podría detectar picos glicopeptıdicos incluso de la cantidad más pequeña de la muestra y la cantidad de proteína cargada en la matriz de líquido en este caso se estimó en aproximadamente 1,6 ng.
(A) MT1-FLAG se diluyó en serie y luego separado por SDS-PAGE y se tiñeron con azul de Coomassie. Sialidasa, que contiene BSA como proteína transportadora, se cargó en el carril de la izquierda (indicado por asterisco). Números de la izquierda de los paneles representan masas moleculares en kilodaltons (kDa). (B) Las bandas de polipéptido que corresponde a MT1-FLAG fueron extirpados, in-gel digerido con tripsina, y se analizó por MS usando la matriz 3AQ /CHCA líquido. Los glucopéptidos contenidas en toda la proteína digerir obtuvieron de MT1-FLAG fueron detectados (aproximadamente 1,6 ng basa en la comparación con un estándar de BSA) en el centro de la matriz de líquido. Los números representan la intensidad acumulada de los mejores picos (unidades arbitrarias). Las puntas de flecha indican los iones de glicopéptidos (consulte la Fig. 3).
Discusión
Muchas herramientas bioquímicas están disponibles para analizar
N
-glycosylation de proteínas, mientras que los de
O
-glycosylation son limitados. Por lo tanto, el análisis de la
O
-glycosylation estado de proteínas usando pequeñas cantidades de muestra ha sido un desafío técnico. Un en-blanco método de separación, haciendo uso de la matriz líquida 3AQ /CHCA para MALDI-MS, se desarrolló recientemente y se aplicó a analizar
N-
glicosilación de ribonucleasa B. Hemos aplicado este método para analizar
O
-glycosylation de MT1-MMP expresada en niveles bajos en las células cancerosas.
el método de separación en blanco usando la matriz de líquido es extremadamente fácil y rápida para analizar una mezcla de péptidos glicosilados y no glicosilados en comparación con análisis MS convencional usando DHB. Desde péptidos glicosilados son ionizados débilmente en comparación con las no glicosiladas, las señales de glicopéptidos no pudieron detectarse cuando la misma MT1-FLAG digerido se aplica a la matriz DHB (Fig. S3). Por lo tanto, DHB no se puede utilizar para el análisis de glicopéptido sin procesamiento previo para la separación de este último. Por el contrario, no es necesaria la separación previa de péptidos glicosilados y no glicosilados para el análisis de MS utilizando 3AQ /CHCA. Debido a que no se necesita una etapa de separación adicional después de la digestión proteolítica, sólo una pequeña cantidad de muestra de proteína fue suficiente para obtener resultados claros como se demuestra en la Fig. 6. Además, la 3AQ matriz líquida /CHCA es compatible no sólo con los análisis de muestras de proteínas teñida con azul de Coomassie, pero también la de los teñidos con plata (datos no mostrados). La tinción con plata permite la detección de la mayoría de las proteínas, ya que es más sensible que la tinción con azul de Coomassie. En conjunto, el método MALDI-MS usando 3AQ /CHCA puede hacer que sea posible investigar la glicosilación de una proteína que se expresa en cantidades muy pequeñas y /o presente en el área de superficie específica tal como balsas de lípidos, donde la purificación es más compleja.
en este estudio, se utiliza principalmente la proteína MT1-FLAG expresada en células HT1080 para evaluar la versatilidad de la nueva aplicación de la matriz líquida para analizar glicoproteínas por MS. Esto es simplemente porque hemos estado estudiando MT1-MMP expresada en las células cancerosas y quería usarlo como una proteína transmembrana norma expresa en niveles bajos. Detectamos glicosilada picos de péptidos MT1-MMP derivados de
278GIQQLYGGESGFPTK
292 y
299TTSRPSVPDKPK
310 (Fig. 3). Por lo tanto, los residuos Thr y Ser dentro de estos péptidos representan posibles
O
-glycosylation sitios. Thr
291, Thr
299, Thr
300, y Ser
301 fueron sugeridos para ser sitios de
O
-glycosylation por análisis de mutación [10], [13]. Además, encontramos que Ser
304 también está glicosilada en células HT1080 mediante la detección de una señal de glicopéptido de
303PSVPDKPK
310 por MS
2 Análisis del ion sodiated [M + Na]
+ pico a
m /z
2,791.9 como en la Fig. 3 (datos no mostrados). Aunque estos resultados son en gran parte de confirmación, el análisis también reveló la heterogeneidad
O
-glycosylated péptido picos de
299TTSRPSVPDKPK
310 (Fig. 4). Por lo tanto, toda una proteína análisis MS usando matriz líquida es una poderosa herramienta para analizar la heterogeneidad de glicosilación. El método es fácil de usar incluso para muestras clínicas en las que los anticuerpos específicos están disponibles para la purificación por inmunoafinidad de proteínas diana de las células, los tejidos, sueros, y en la orina. Desde glicosilación alterada de proteínas se ha relacionado con la progresión del cáncer [3], [4], [5], el método de separación en-blanco usando 3AQ /CHCA acelerará análisis de heterogeneidad de
O
-glycosylation para diferentes proteínas relacionadas con el cáncer. Si hay variaciones específicas del cáncer, la identificaron
O
-glycans puede representar nuevos biomarcadores candidatos para los tumores malignos. Además, hay un creciente interés en productos farmacéuticos basados en la biotecnología que se fabrican utilizando células vivas. El estado de glicosilación de estos productos biológicos se ha demostrado que es importante para sus propiedades farmacológicas [22]. El actual método MALDI-MS puede convertirse en una herramienta valiosa para glycoanalysis de muestras clínicas, así como la evaluación de la calidad de los medicamentos biológicos.
Materiales y Métodos
Cell Culture
células de fibrosarcoma HT1080 humano (American Type Culture Collection, Manassas, VA) se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con suero bovino fetal 10%, 10 M MMI270 (un inhibidor de la metaloproteinasa de la matriz hidroxámico sintético, una especie don de Novartis Pharma AG, Basilea, Suiza), y 1% de penicilina /estreptomicina a 37 ° C en un 5% de CO
2 incubadora.
Lentiviral vectores para la expresión ya los derribos
MT1-MMP
La secuencia shRNA utilizado para desmontables de MT1-MMP fue 5'-CACCGCAGCCTCTCACTACTCTTTCCGAAGAAAGAGTAGTGAGAGGCTGC-3 '. Un fragmento de ADN que codifica la secuencia se subclonó en pENTR /U6 TOPO (Invitrogen) y luego se transfiere a través de la recombinación en el vector de lentivirus pLenti6 bloquearlo (Invitrogen). Una construcción que codifica humano MT1-MMP etiquetada con el epítopo FLAG (DYKDDDDK) fue descrito anteriormente [23]. Un clon de ADNc de FLAG-tagged MT1-MMP (MT1-FLAG) se amplificó por la PCR usando los siguientes cebadores: 5'-CACCATGTCTCCCGCCCCAAGACC-3 'y 5'-TCAGACCTTGTCCAGCAGGG-3'. La secuencia de MT1-FLAG amplificado se subclonó en pENTR /D-TOPO y después se transfiere a través de la recombinación en el vector de expresión lentiviral pLenti6 /V5-DEST (Invitrogen). Estos vectores lentivirales se generaron y se utilizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
MT1-MMP Desmontables y revertientes línea celular
MT1-FLAG se expresó en células HT1080 lentivirus-infectada (células revertientes) en la que la expresión endógena de MT1-MMP se agota primero mediante la expresión del shRNA orientación endógena del MT1-MMP (desmontables células). MT1-FLAG se expresa en un nivel similar a la de la proteína de tipo salvaje basado en el análisis de Western blot.
lisado de células completas Preparación
35 cm
2 platos de cultivo celular que contiene de tipo salvaje subconfluent, desmontables MT1-MMP y MT1-FLAG células HT1080 revertientes suplementado con 10 mM MMI270 se lavaron con PBS y se lisaron mediante ebullición en tampón de 200 l Laemmli muestra [24], que contiene 5% β-mercaptoetanol. Una alícuota de 10 l de lisado se utilizó para el análisis de Western blot.
Membrana lisado preparación
Todos los procedimientos se llevaron a cabo a 4 ° C. Dieciséis 150 cm
2 platos de cultivo celular que contienen cultivos subconfluentes de tipo salvaje o células revertientes HT1080 MT1-FLAG supplementated con 10 mM MMI270 en los medios de comunicación se lavaron con PBS y se rasparon en 32 ml de tampón de sacarosa /Hepes (0,25 M sacarosa /20 mM Hepes-NaOH, pH 7,2) que contienen inhibidores de la proteasa (proteasa conjunto cóctel inhibidor I, Calbiochem, San Diego, CA). Las células en el tampón se Dounce-homogeneizada (10 veces). El homogeneizado se centrifugó a 1000 xg durante 7 min. El sedimento se volvió a homogeneizar en 16 ml de sacarosa /tampón Hepes, y la suspensión se centrifugó 1.000 × g durante 7 min. Los sobrenadantes se combinaron y centrifugaron a 2000 xg durante 30 min. El sobrenadante de esta centrifugación se ultracentrifugó a 105.000 xg durante 1 h. Los sedimentos se resuspendieron en 1 ml de tampón de lisis (1% Triton X-100/20 mM Hepes-NaOH, pH 7,2) que contiene inhibidores de la proteasa y después se centrifugaron a 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C. El sobrenadante se conoce como el lisado de la membrana, dando como resultado una concentración de proteína de aproximadamente 10 mg /mL. La concentración de proteína en el lisado se determinó usando un kit de Bio-Rad Protein Assay (laboratorios Bio-Rad, Hercules, CA) con BSA como patrón de referencia.
endógena MT1-MMP Aislamiento
un anticuerpo monoclonal para el aislamiento endógeno MT1-MMP se preparó en nuestro laboratorio por un método de inmunización genética [25] el uso de un plásmido de expresión humano MT1-MMP de longitud completa. Este anticuerpo reconoce una región dentro de un dominio de tallo de MT1-MMP (un papel en preparación). A 70 g de parte alícuota del anticuerpo específico MT1-MMP se unió covalentemente a 10 mg de perlas magnéticas de epoxi con funcionalidad siguiendo el protocolo proporcionado (Dynabeads M-270 epoxi, Invitrogen). Para la inmunoprecipitación, 1 ml de lisados de membrana preparados a partir de células HT1080 de tipo salvaje se incubó 24 horas a 4 ° C con 10 mg de perlas de anticuerpo conjugado anti-MT1-MMP. Después de la incubación, la resina se recogió con un imán y se lavó con tampón de lisis. El límite MT1-MMP se eluyó con 0,1 M glicina-HCl (pH 3,0), y después se neutralizó con 1 M Tris-HCl (pH 8,0). El eluato se concentró a 20 l (aproximadamente 7,5 ng de proteína /l) por diafiltración usando un Ultra dispositivo Amicon (corte: 10 kDa, Millipore, Billerica, MA).
FLAG-tagged Aislamiento MT1-MMP
Aislamiento de MT1-FLAG se llevó a cabo utilizando anticuerpos anti-FLAG M2 perlas magnéticas (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, 1 ml de lisados de membrana preparados a partir de células HT1080 revertientes MT1-FLAG se incubó 16 horas a 4 ° C con 20 l de la resina. El MT1-FLAG se eluyó con 3 porciones de péptido FLAG en TBS que contiene 0,1% de CHAPS. El eluato se concentró a 20 l (aproximadamente 25 ng de proteína /l) como se describió anteriormente.
Soluble MT1-MMP Preparación
Un MT1-MMP transmembrana supresión mutante se purificó a partir del medio de acondicionado (MDCK) de riñón canino Madin-Darby como se describe anteriormente [26].
Tratamiento sialidasa
Para desialilación, 500 ng de analito se trató con 5 mU de sialidasa /F neuraminidasa (CE 3.2 .1.18. de
Streptococcus
, Seikagaku Co., Tokio, Japón) a 37 ° C durante 16 h en 20 l de TBS que contiene 0,1% de CHAPS.
SDS-PAGE
las muestras en tampón de muestra de Laemmli que contiene el 5% β-mercaptoetanol se hirvieron durante 5 min y después se centrifugó a 20.000 × g durante 5 min a 25 ° C. Los sobrenadantes se sometieron a discontinua Tris-glicina-SDS-PAGE usando un gel de apilamiento al 4% y un gel separador al 10%.
Western Blot
Después de la electroforesis, los materiales en geles de SDS-PAGE se electrotransferred a membranas de PVDF (Millipore), y las membranas se bloquearon con leche desnatada 5% en PBS. materiales inmunorreactivas se detectaron por tinción con los anticuerpos indicados utilizando el sustrato de quimioluminiscencia Western relámpago (Perkin Elmer Inc., Waltman, MA). Los siguientes anticuerpos fueron utilizados en este estudio: un anticuerpo anti-MT1-MMP monoclonal (222-1D8, un generoso regalo del Dr. Kazushi Iwata, Daiichi Fine Chemicals, Takaoka, Japón), un anticuerpo policlonal anti-FLAG (Sigma-Aldrich ), un anticuerpo monoclonal anti-β-tubulina (E7, Estudios sobre el Desarrollo del Banco hibridoma, Universidad de Iowa, EE.UU.), rábano anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa y el anticuerpo anti-IgG de conejo (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ).
Densitometría
La intensidad de la proteína teñida con azul de Coomassie se cuantificó usando ImageJ 1,43 software (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
3AQ /CHCA líquido de matriz
concentrado 3AQ /CHCA se preparó disolviendo 35 mg de 3-aminoquinolina (Fluka analíticos, Sigma-Aldrich) en 150 l de una solución saturada de α-ciano-4-hidroxicinámico (LaserBio Labs, Sophia-Antipolis Cedex, Francia) en metanol. La solución 3AQ /CHCA concentrado se diluyó 10 veces utilizando fosfato de amonio 100 mM, y se refirió como el líquido de matriz 3AQ /CHCA. Una solución saturada de CHCA se preparó disolviendo 10 mg de CHCA en 540 l de 50% de acetonitrilo /ácido trifluoroacético 0,1% y 60 l de fosfato de amonio 100 mM.
DHB Matrix
DHB (2 , solución matriz de ácido 5-dihidroxibenzoico) se preparó disolviendo 10 mg de DHB (LaserBio Labs) en 1 ml de 50% de acetonitrilo /ácido trifluoroacético al 0,1%. Para el análisis de matriz DHB, una alícuota de 0,5 l de tríptico MT1-MMP digest que se habían mezclado con un volumen igual de solución de matriz DHB fue vista sobre una placa de objetivo y se deja secar.
en-gel tríptico digestión
En la digestión-gel se llevó a cabo de acuerdo con el método de Shevchenko
et al
[27]. Una región del gel que contiene la proteína MT1-MMP se tiñeron con azul de Coomassie coloidal G-250 (SimpleBlue SafeStain, Invitrogen) se escindió y se corta en trozos pequeños. Las piezas de gel MT1-MMP se destiñeron con bicarbonato de amonio 50 mM en 50% de metanol y después se secó a centrifugación al vacío.