Extracto
Fondo & amp; Objetivos
El cáncer gástrico es el tumor gastrointestinal más frecuente en adultos y es la forma más letal de cáncer humano. A pesar de las mejoras en los tratamientos, el mecanismo subyacente de la carcinogénesis gástrica no es bien conocida. Para definir nuevos moduladores que regulan la susceptibilidad a la tumorogénesis, nos centramos en el miR-219-2-3p.
Métodos
RT-PCR cuantitativa se empleó para investigar el nivel de miR-219-2 -3P en el cáncer gástrico (CG) tejidos (n = 113) y sus tejidos adyacentes normales emparejados (n = 113). En la proliferación in vitro de células, ensayos de apoptosis, migración celular, y ensayos de invasión se llevaron a cabo para elucidar los efectos biológicos de miR-219-2-3p. Desde el silenciamiento de los genes miARN por el promotor de la isla CpG metilación puede ser un mecanismo importante en la tumorigénesis, las células fueron tratadas con GC 5-aza-2'- desoxicitidina y tricostatina A, y los cambios de expresión de miR-219-2-3p fueron examinadas posteriormente por cuantitativa RT-PCR. Por último, el estado de metilación de la isla CpG aguas arriba de miR-219-2-3p se analizó mediante PCR específica de metilación en los tejidos GC (n = 22).
Resultados
miR-219- 2-3p se había reducido regulado en líneas celulares y GC. Además, los experimentos documentaron la menor expresión de miR-219-2-3p en muestras de GC con un mayor grado y tumores en etapas posteriores. Mientras tanto, el miR-219-2-3p ejercida antiproliferativa, proapoptótico, y los roles antimetastásicas y niveles reducidos de p-ERK1 /2 en células de GC. Además, 5-aza-2 'desoxicitidina y tricostatina A aumentó la expresión (~ 2 veces) de miR-219-2-3p en células de GC. Por PCR específica de metilación, se detectó la metilación del ADN en la región aguas arriba de miR-219-2-3p tanto en los tejidos normales y tejidos de cáncer adyacente. Como era de esperar, el nivel de metilación fue considerablemente mayor en el grupo de miR-219-2-3p las reguladas que en el grupo hasta reguladas.
Conclusiones
miR-219-2-3p es potencialmente involucrados en la progresión del cáncer gástrico y metástasis mediante la regulación de las vías de señales relacionadas con el 2 ERK1 /, que pueden proporcionar una nueva estrategia terapéutica para el tratamiento del cáncer gástrico. mecanismo de metilación puede estar implicada en la modulación del nivel de expresión de miR-219-2-3p en el cáncer gástrico
Visto:. Lei H, Zou D, Li Z, Luo M, L Dong, Wang B, et al . Funciones (2013) microARN-219-2-3p como un supresor tumoral en el cáncer gástrico y está regulada por la metilación del ADN. PLoS ONE 8 (4): e60369. doi: 10.1371 /journal.pone.0060369
Editor: Arun Rishi, Wayne State University, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Diciembre, 2012; Aceptado: February 26, 2013; Publicado: 23 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Lei et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [2012, 91129716, a JY] y el Beijing Municipal de Ciencia & amp; Tecnología Comisión [2010B071, a JY]. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es el 4
º cáncer más común y la segunda causa de muerte por cáncer en todo el mundo. Hoy en día, los pacientes con la fase tardía de la CG con una supervivencia global a los 5 años de aproximadamente el 20% [1]. El cáncer se desarrolla como resultado de una acumulación de varias causas endógenas y exógenas. Los hábitos alimentarios y un aumento de Helicobacter pyloriinfection son importantes causas exógenas de GC [2], mientras genéticos, así como la dieta, los niveles de los otros factores que causan la inflamación gástrica crónica hormona gastrina [3], y se encuentran para ser asociado con la predisposición al desarrollo del cáncer. alteraciones de genes juegan un papel importante en GC, y alteraciones en un gran número de oncogenes y genes supresores de tumores ya han sido reportados en GC.
Algunos biomarcadores tumorales pronósticos en GC tales como el factor de crecimiento epidérmico humano receptor 2 (HER2 ), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR), se han asociado con características de la enfermedad y por lo tanto puede ser utilizado para informar a gestión de pacientes. Por ejemplo, los pacientes con tumores que dan positivo para HER2 pueden ser tratadas con trastuzumab más quimioterapia [4], y los pacientes con tumores que dan positivo para el VEGF pueden ser tratados con bevacizumab más quimioterapia [5]. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen en el desarrollo de GC siguen siendo un desafío, por lo tanto se necesitan con urgencia biomarcadores adicionalmente informativos.
Los microARN (miARN) son una clase de pequeñas moléculas de ARN implicadas en la regulación de la traducción y la degradación de los ARNm [6 ]. MiRNAs se unen a secuencias complementarias en las regiones 3 'no traducidas (UTR) de sus ARNm diana e inducen la degradación del ARNm o la represión de traducción [7]. funciones más conocidas de miRNAs están relacionados con la regulación de genes negativos: la expresión de genes miARN silencio, por lo general, al interferir con la estabilidad del mRNA o la traducción de proteínas. En los últimos años, se creía que miRNAs para actuar como oncogenes o genes supresores de tumor, y contribuir a la iniciación y progresión del cáncer mediante la regulación de la expresión génica [8]. El descubrimiento de cáncer-específica región aguas arriba hipermetilación de numerosos miRNAs ha demostrado un mecanismo epigenético para la expresión aberrante de los genes miARN [9], [10].
En humanos y ratones, hay dos loci del genoma (miR-219- 1 y miR-219-2) que codifican precursor transcripciones de miR-219. miR-219-1 se encuentra en el cromosoma 6 (MI0000296) y miR-219-2 se encuentra en el cromosoma 9 (MI0000740) [11] (fig. 1A). El procesamiento de los precursores transcripciones por Dicer genera tres miRNAs maduros: MIR-219-5p de los extremos 5 'de ambos precursores, y miR-219-1-3p y miR-219-2-3p desde el extremo 3' de pre miR-219-1 y pre-miR-219-2, respectivamente. Puesto que la región de semillas de estos tres productos maduros es única, cada uno de los genes miARN se prevé para regular objetivos únicos. A pesar de que se conoce el miR-219-5p que las reguladas en el cáncer de múltiples tales como astrocitoma maligno [12] y el carcinoma hepatocelular [13], la expresión de miR-219-1-3p y miR-219-2-3p no tiene sido estudiado. Curiosamente, miR-199b y miR-219-2-3p genes se encuentran en la proximidad de un segmento de cromosoma 9q34.11 (Fig. 1A). Un estudio previo demostró que el miR-199b-5p se había reducido regulado en el meduloblastoma por metilación de una isla CpG 3 kb aguas arriba del sitio 5 'del promotor de miR-199b-5p [14]. Dado que la metilación del ADN puede afectar a grandes regiones de la cromatina y regular la transcripción de genes distantes, es necesario investigar si el miR-219-2-3p es el regulado y regulada por metilación como miR-199b-5p en cáncer. En este estudio, encontramos que el miR-219-2-3p se había reducido regulado en los tejidos GC y se asocia con fenotipos progresivas de GC. Por otra parte, la reintroducción de miR-219-2-3p redujo la viabilidad de las células de GC y la apoptosis celular inducida, lo que sugiere que el miR-219-2-3p era un supresor tumoral candidato en GC. Además el análisis de metilación del promotor de miR-219-2-3p indicó que su expresión está regulada por la metilación de islas CpG correlacionados en cierta medida. Por último, encontramos que el miR-219-2-3p actuó como un supresor de tumores a través de la inhibición de la actividad de ERK1 /2 vía de señalización en las células de GC.
(A) Esquema que muestra humana MIR-219-1 y Mir -219-2 estructuras genómicas. El procesamiento de los precursores transcripciones genera el mismo miR-219-5p y dos miRNAs únicos, 219-1-3p y 219-2-3p. (B) miR-219-2-3p se detectó en 113 pacientes con cáncer gástrico por tiempo real-PCR. Los datos se presentan como log 2 de veces el cambio de los tejidos de GC con relación a los tejidos adyacentes no tumorales. (C) Los niveles de expresión (como log 2 del factor de cambio de los tejidos GC relativos a la no-tejidos tumorales adyacentes) de miR-219-2-3p en estadios I-II (n = 39) frente a los estadios III-IV (n = 71 ) de los pacientes con cáncer. (D) Los cuatro pacientes que fueron diagnosticados como cáncer gástrico en H & amp; E tinción (ampliación original, x100). (E) Los niveles de expresión de miR-219-2-3p fueron examinados por PCR en tiempo real en cuatro pacientes como se describe en fig.1D y cuatro líneas celulares GC. Los experimentos se realizaron tres veces. Todos los datos utiliza la prueba t independiente y se muestran como media ± desviación estándar. *,
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Resultados
miR-219-2-3p se expresan diferencialmente en GC y GC líneas celulares
Para evaluar la expresión de miR-219-2-3p en GC, el análisis TaqMan RT-PCR se llevó a cabo en 113 pares de tejidos GC y muestras de tejidos normales adyacentes emparejados. En comparación con muestras de tejido normal, más de la mitad de los tumores primarios expuestos bajos niveles de miR-219-2-3p (58%, 65 de 113; Fig. 1B). Por otra parte, cuatro pacientes cuya expresión de miR-219-2-3p fueron significativas las reguladas fueron elegidos (Fig. 1D). La expresión de miR-219-2-3p en esos pacientes y cuatro líneas de células GC (MGC-803, HGC-27, MKN-45, SGC-7901) se analizó para revelar que el miR-219-2-3p también fue abajo regulado en células GC (Fig. 1E). Estos resultados sugieren que las reguladas miR-219-2-3p fue un acontecimiento frecuente en GC humana y podría estar implicado en la carcinogénesis gástrica. Debido a la baja regulación universal de miR-219-2-3p en líneas celulares ensayadas GC, MGC-803 y HGC-27 fueron elegidos al azar para el estudio adicional.
La relación entre los factores clínico-patológicos y miR-219- 2-3p expresión en GC
Este estudio incluyó a 113 pacientes con cáncer gástrico. Para evaluar la correlación entre la expresión de miR-219-2-3p y las características clínico-patológicas, los pacientes fueron divididos en grupos con baja regulación y sobre regulación. Como se muestra en la tabla 1 y la figura 1C, se observó una asociación estadísticamente significativa entre la expresión de miR-219-2-3p y el estadio clínico GC. Los pacientes con niveles más bajos de expresión de miR-219-2-3p parecen estar asociadas con tumores de alto grado y la fase tardía (p = 0,047, T para muestras independientes de pruebas). Estos datos sugieren que las alteraciones de miR-219-2-3p podrían estar implicados en la progresión del GC.
La sobreexpresión de miR-219-2-3p en las células GC inhibe la proliferación celular y la supervivencia celular
la notable reducción de la expresión de miR-219-2-3p en muestras de GC nos impulsó a explorar la posible significación biológica de miR-219-2-3p en la tumorigénesis. Dado que el miR-219-2-3p jugó un papel en la regulación de la proliferación celular [15], las células MGC-803 y HGC-27 fueron transfectadas con imita el miR-219-2-3p y revueltos y se analizó el crecimiento de las células, las células apoptosis y la progresión del ciclo celular, respectivamente. En primer lugar, RT-PCR se utilizó para medir el nivel de miR-219-2-3p después de los experimentos de sobreexpresión. Encontramos que el miR-219-2-3p aumentado en más de 100 pliegues en miARN transfectadas MGC-803 y HGC-27 células (Figura 2a). Además, el ensayo de proliferación de CCK-8 muestra que la tasa de crecimiento de las células se redujo en miR-219-2-3p imita-transfectadas MGC-803 y HGC-27 células en comparación con las células transfectadas revueltos o las células no tratadas (Fig. 2B). Después de la transfección, la relación de inhibición fue del 26% (48 h) y 28% (96 h) en las células MGC-803 y 13% (72 h) y 14% (96 h) en HGC-27 células. Estos resultados sugieren que el miR-219-2-3p fue efectivamente implicada en la regulación negativa del crecimiento celular. Sin embargo, no hubo ningún efecto significativo sobre la detención del ciclo celular en las células tratadas GC miR-219-2-3p (Fig. S1). Para determinar si la regulación de miR-219-2-3p induciría la apoptosis de células de GC y la muerte celular, el número de principios apoptótica MGC-803 y HGC-27 células después del tratamiento con imita el miR-219-2-3p fue examinado. Como era de esperar, pocas células apoptóticas temprana (10% en el MGC-803 o el 2,9% en HGC-27) se detectaron en las células tratadas con mucho revuelo, mientras que el tratamiento imita el miR-219-2-3p aumentado el porcentaje de células apoptóticas tempranas (17,5 % en el MGC-803 o 8.3 en HGC-27) según la opinión de Anexina V tinción (Fig. 2C). Por lo tanto, llegamos a la conclusión que el miR-219-2-3p podría afectar a la supervivencia celular en las células de GC.
(A) Los niveles de expresión de miR-219-2-3p fueron examinados por PCR en tiempo real después de la transfección con 50 nmol /L de imita el miR-219-2-3p o despegue en tiempo mínimo o ningún transfección. (B) El crecimiento de MGC-803 y HGC-27 células se demostró después de la transfección con 50 nmol /L de imita el miR-219-2-3p o despegue en tiempo mínimo o ningún transfección. El índice de crecimiento se evaluó en 1, 2, 3, 4, y 5 d. (C) MGC-803 y HGC-27 células fueron teñidas con anexina V PE y 7-AAD 72 h después del tratamiento con imita o scramble miR-219-2-3p. A principios células apoptóticas se muestran en el cuadrante derecho. *,
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La sobreexpresión de miR-219-2-3p en las células GC inhibe la migración celular y la invasión
Para detectar más si miR-219-2-3p se asocia con la progresión de la GC, la curación y la herida transwell ensayo se realizaron para analizar el efecto de la expresión de miR-219-2-3p en el comportamiento migratorio e invasivo de MGC-803 y las células HGC-27 . Hemos encontrado que la introducción de miR-219-2-3p en MGC-803 y HGC-27 células dio lugar a una reducción significativa de la migración celular durante el cierre de una herida artificial creado más de una monocapa confluente (Fig. 3A). Estas células se mantuvieron en medio libre de suero durante el curso de la cicatrización de heridas para asegurar que cualquier comportamiento migratorio aumentada no podría verse afectada por la proliferación celular alterado. Además, la restauración de miR-219-2-3p inhibió drásticamente la normalidad fuerte capacidad invasiva de MGC-803 y HGC-27 células, lo que lleva a bajo nivel endógeno de miR-219-2-3p (Fig. 3B). Estos resultados indicaron que la sobreexpresión de miR-219-2-3p contribuye a la regulación de la motilidad celular y la progresión GC in vitro.
-27 HGC células (A) MGC-803 y no fueron transfectadas o transfectadas con 50 nmol /se hicieron L de imita el miR-219-2-3p o despegue en tiempo mínimo durante 24 horas, y las heridas. Se muestra la proporción relativa de cierre de la herida por campo. (B) MGC-803 y HGC-27 células no fueron transfectadas o transfectadas con 50 nmol /L de imita o despegue en tiempo mínimo durante 24 horas miR-219-2-3p, y se realizó transwell ensayo de invasión. Se muestra la proporción relativa de células invasivas por campo. Ampliación para la identificación de la migración es × 400 y la invasión es × 40. Todos los datos se muestran como media ± desviación estándar.
miR-219-2-3p expresión es regulada epigenetically
Sobre la base de las conclusiones anteriores, se concluye que el miR-219-2- 3p era un importante regulador en GC. Sin embargo, los mecanismos de regulación de la expresión de miR-219-2-3p eran todavía desconocidos. Dado que muchos miRNAs fueron identificados como objetivos de la regulación de metilación, como miR-9, miR-34b /cy miR-148a en los carcinomas metastásicos [16], y miR-137 y miR-193a en el cáncer oral [17], miR 193b y miR-145 en el cáncer de próstata [18], [19], se decidió analizar el mecanismo de regulación de la expresión de miR-219-2-3p de su metilación genómica. Tras el análisis de la región genómica que abarca el gen miR-219-2-3p, hemos identificado una gran isla CpG (Fig. 4A). Para investigar si el miR-219-2-3p se reguló epigenetically en GC, MGC-803, HGC-27 células fueron tratadas con inhibidor demethyltransferase, 5-aza-2'- desoxicitidina (5-Aza-CdR) y la histona deacetilasa- inhibidor de tricostatina A (TSA). A continuación, se analizó la expresión de miR-219-2-3p por RT-PCR (Fig. 4B). Los resultados muestran que la expresión de miR-219-2-3p estaba regulado en dos situaciones: para el tratamiento con 5-Aza-CdR, la expresión de miR-219-2-3p fue hasta reguladas en el MGC-803 ( 5-Aza-CdR 1,5 mol /L; 2,14 veces) y HGC-27 (5-Aza-CdR 0,5 mol /L; 3,07 veces) en comparación con DMSO tratados grupo de control; para el tratamiento de combinación 5-Aza-CdR y TSA, la expresión de miR-219-2-3p fue mucho mayor en MGC-803 (5-Aza-CdR 1,5 mmol /l; 1,98 veces) y HGC-27 (5 -Aza-CDR 1,5 mmol /l; 1,28 veces) en comparación con el grupo de control TSA. Estos resultados indican que los factores epigenéticos podrían afectar a la expresión de miR-219-2-3p en GC. Sinergia de inhibición desmetilación y la histona deacetilasa dio lugar a la re-expresión de miR-219-2-3p en GC. Para detectar también si miR-219-2-3p se asoció con la metilación de GC, se analizó el estado de metilación de la región aguas arriba de miR-219-2-3p mediante PCR específica de metilación (MSP; Fig. 4C). 22 pares de tejidos (tumores primarios y sus tejidos normales adyacentes pareados) en los 113 pares fueron seleccionados, incluyendo 11 pacientes que poseían los niveles más bajos de miR-219-2-3p (baja regulación de grupo) y 11 pacientes que poseen mayor de miR-219 -2-3p niveles (grupo de regulación). Se encontró que la metilación del ADN en las regiones aguas arriba de miR-219-2-3p existía tanto en tejidos normales y tejidos de cáncer adyacente. Sin embargo, la relación de la hipermetilación de la región de aguas arriba del gen miR-219-2-3p en el grupo de baja regulación fue 63,6% (7 de la 11), que fue mayor que el grupo de regulación (36.3%, 4 de la 11 ). Estos resultados sugieren que el nivel de metilación de CpG de la región aguas arriba de miR-219-2-3p fue mayor en el grupo de miR-219-2-3p el regulado que en el plano regulada uno.
( a) una ilustración esquemática de deleción de un segmento (90 M-141 M) del cromosoma 9q34.11 donde encuentran los genes miR-219-2-3p. (B) Efecto de 5-Aza-CdR y la TSA en la expresión de miR-219-2-3p en MGC-803 y HGC-27 líneas celulares de cáncer gástrico. 5-Aza-CdR combinación con TSA 5-aza-CDR o aumentaron significativamente los niveles de miR-219-2-3p. Resultados (C) Representante de metilación MSP miR-219-2-3p en los tumores de cáncer gástrico primario y tejidos tumorales adyacentes normales. El número de casos se muestran en la parte superior. M: cebadores metilados; U: cebadores no metilados. Los casos con hipermetilación fueron marcados.
La sobreexpresión de miR-219-2-3p amortigua ERK1 /2 vía de señalización
La activación de ERK1 /2 fue bien documentado en varios tipos de tumores, tal como GC [20], cáncer de páncreas [21] y el cáncer de mama [22]. Estudios previos han demostrado la importancia de la vía de señalización ERK1 /2 en la regulación de la migración, invasión y metástasis de las líneas celulares de cáncer [23]. Para investigar si el miR-219-2-3p afecta a las actividades celulares a través de ERK1 vía /2, el nivel de fosforilación de ERK1 /2 en MGC-803 y HGC-27 células fue examinado después de la sobreexpresión de miR-219-2-3p. los niveles celulares de p-ERK1 /2 disminuyeron significativamente en miR-219-2-3p células imita-transfectadas en comparación con las células transfectadas revueltos o no tratados. Sin embargo, no se observó ninguna diferencia obvia en total ERK1 /2 nivel (Fig. 5A). Estos hallazgos sugieren que el crecimiento de las células GC acelerada podría ser debido en parte a activado ERK1 /2 vías.
células (A) MGC-803 y HGC-27 sin tratar y se transfectaron con huevos revueltos o miR-219-2-3p imita se sometieron a análisis de transferencia Western de ERK1 fosforilados /2, ERK1 Total /2 y GAPDH (como control de carga). Los datos mostrados son representativos de tres western blot análisis individuales. (B) Los candidatos onco-objetivos de miR-219-2-3p pronosticadas por TargetScan versión 5.2, y miRDB. (C) bioinformatically y funcionalmente implicados miR-219-2-3p en GC.
enfoque de la bioinformática para buscar posibles objetivos de miR-219-2-3p
MiRNAs modular el gen expresión mediante la interacción con sus ARNm diana que resulta en la degradación del ARNm o la represión de traducción. Para investigar más a fondo el mecanismo de miR-219-2-3p en GC, que bioinformatically (TargetScan Release 5.2 y miRDB) y funcionalmente implicados miR-219-2-3p en GC, y encontraron los genes diana de miR-219-2- 3p (Tabla S2). Entre los 371 objetivos de predecir miR-219-2-3p, 31 de ellos muestran un alto potencial ya que fueron predichas por ambos programas, mientras que otros sólo fueron predichas por uno de los programas. De estos 31 genes, ErbB3, MAPK8, SCL7A11, YOD1, TBK1, SOX4 se encontró que los genes de oncogenes o relacionados con la apoptosis de los trabajos publicados anteriores. (Fig. 5B y 5C).
Discusión
En los últimos años, la evidencia acumulada ha llevado a especular que los oncólogos a factores moleculares no revelados, en particular los ARN no codificante previamente clasificados como "basura", juego un papel importante en la tumorigénesis y progresión tumoral. En función de sus objetivos de ARNm, los miRNAs puede funcionar como supresores de tumores o promotores de la oncogénesis. Sin embargo, los mecanismos que dysregulated miRNAs no han sido ampliamente estudiados, incluyendo aberrante biogénesis de miARN y la transcripción [24], [25], alteración epigenética [26], [27], y la amplificación o la pérdida de regiones genómicas que codifican miRNAs [28] .
Como se muestra en este informe, analizamos la expresión de miR-219-2-3p en 113 pacientes con cáncer gástrico y se encontró que los niveles parecen ser más bajos en GC. A pesar de que el miR-219-2-3p ha informado a estar estrechamente relacionado con la retinopatía diabética [29], los oligodendrocitos [15], la enfermedad de Alzheimer [30] y el glioblastoma [12], su función en GC queda por determinar. Además, hemos demostrado que re-expresión de miR-219-2-3p en células GC resultó en la inducción de la apoptosis de las células y la reducción de la viabilidad celular. Estos resultados nos han permitido especular que la baja regulación de miR-219-2-3p podría contribuir a la supervivencia de las células de GC. Sin embargo, el mecanismo responsable de miR-219-2-3p baja regulación en GC es aún desconocido. Debido a la pérdida en 9q34.11, donde se encuentra el miR-219-2-3p, rara vez se detecta en GC [31], es poco probable que la pérdida alélica es responsable de su regulación a la baja. Por otra parte, se encontró que el miR-219-2-3p fue notablemente hasta reguladas cuando las células de GC, MGC-803 y HGC-27, se trataron con tanto 5-aza-CDR y TSA. Además, el análisis computacional revela que miR-219-2-3p se encuentra en una isla CpG en el cromosoma 9q34.11. Por lo tanto, parece posible que la metilación del ADN y la desacetilación de histonas pueden estar asociados con la regulación de miR-219-2-3p. Por MSP, las frecuencias de metilación muestras detectadas en la región aguas arriba de miR-219-2-3p fue mayor en el grupo de miR-219-2-3p las reguladas que en el grupo en marcha regulada. Esta especificidad proporcionó la hipótesis de una relación entre la expresión de miR-219-2-3p y la metilación del ADN. En general, los resultados sugieren que la metilación es un mecanismo importante para miR-219-2-3p baja regulación en GC.
Se realizó la predicción de los programas y TargetScan miRDB y se encontró que 6 genes podrían ser objetivos potenciales de MIR -219-2-3p. Entre los objetivos de candidatos de miR-219-2-3p, el receptor tirosina quinasas ERBB3 (epidérmico familia de receptores del factor de crecimiento) llamó nuestra atención. Los altos niveles de ERBB3 está fuertemente asociada con la progresión tumoral y mal pronóstico de los pacientes con GC [32] - [34] y los inhibidores de EGFR cinasa gefitinib podrían prevenir EGFR y ErbB2 activación de ERBB3. Mientras tanto, la expresión ERBB3 también sirve como un predictor eficaz de sensibilidad a gefitinib [35]. Se sabe que la transcripción reprimida ERBB3 inhibe las cascadas de señalización de ERK1 /2 vías [36]. Sin embargo, los genes objetivo previsto necesitan ser más validada experimentalmente. Por otra parte, los miRNAs puede funcionar de acuerdo con un modelo de circuitos combinatoria, en los que un miARN se pueden orientar a múltiples ARNm, y varios miRNAs expresadas simultáneamente puede dirigirse a un único ARNm. Estudios recientes han sugerido que el concepto biológico de "un golpe de múltiples objetivos" podría ser utilizado en la terapéutica clínica [37]. Es probable que un miRNA específico puede funcionar a través de cooperativa baja regulación de múltiples objetivos y miRNAs función también por la supresión de la traducción de sus genes diana. Para explorar el impacto total de un miARN, estudios proteómicos en todo el genoma debe ser hecho
.
En conclusión, nuestra expresión y estudios funcionales sugerido que el miR-219-2-3p se expresa de forma diferente por el mecanismo de metilación y tenía una función de supresión tumoral mediante la regulación de las vías de señales relacionadas con el 2 ERK1 /en GC. Mientras tanto, la menor expresión de miR-219-2-3p en muestras de GC se correlacionó con un mayor grado y etapa posterior. La reintroducción de la expresión de miR-219-2-3p sobre las células GC suprimidas la proliferación celular, la migración, la invasión y la apoptosis inducida indicó que el patrón theraputic basados en miARN podría servir como base para el desarrollo de nuevas terapias potenciales en el cáncer gástrico.
Materiales y Métodos
muestras de tejido
los tumores gástricos y sus tejidos morfológicamente normales (ubicada & gt; 3 cm de distancia del tumor) se obtuvieron entre noviembre de 2009 y noviembre de 2011, de 113 pacientes sometidos a GC cirugía en el hospital del cáncer de la Academia china de Ciencias médicas (CICAMS, n = 21), el hospital general del EPL de china (301 hospital, n = 31), y el primer hospital Afiliado de la Universidad médica de Shanxi (n = 61). El uso de las muestras de tejido para todos los experimentos fue aprobado por el comité de ética del Instituto de Ciencias Médicas Básicas de la Academia China de Ciencias Médicas. Todos los participantes dieron su consentimiento informado verbal para participar en este estudio, y sus consentimientos informados verbal fueron escritas. Este proceso de consentimiento también fue aprobado por el comité de ética. Las muestras de tejido se cortaron en dos partes, una se fijó con formalina al 10% para el diagnóstico histopatológico, y el otro fue inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenó a -196 ° C en nitrógeno líquido hasta la extracción de ARN. Este grupo estaba formado por 95 hombres, 17 mujeres y uno sin información sobre el sexo con una edad mediana de 58 años (rango, 31-82 años) fijos-.Formalin bloques de tejido en parafina de GC fueron recogidos desde el Hospital del Cáncer de la Academia China de Ciencias médicas (CICAMS, n = 4) entre 2009 y 2011. Debido a las diferencias individuales entre los pacientes, que carecían de información de algunos datos clínico-patológicas. El uso de las muestras de tejido para todos los experimentos fue aprobado por todos los pacientes y por el Comité de Ética de la institución. Las características de los pacientes se describen en la Tabla 1.
Cultivos de Células y transfección
Un total de 4 líneas celulares humanas GC MGC-803 (cáncer gástrico mucinoso, pobremente diferenciado), HGC-27 ( ganglio linfático metastásico, carcinoma indiferenciado), MKN-45 (Signet anillo carcinoma poco diferenciado), SGC-7901 (adenocarcinoma, moderadamente diferenciado) se examinaron en este estudio. El MGC-803 HGC-27, MKN-45, SGC-7901 línea celular fue adquirido de la célula Centro de Recursos del Instituto de Ciencias Médicas Básicas de la Academia China de Ciencias Médicas y Pekín Unión Medical College (Pekín, China). MGC-803 se propagó en medio de Dulbecco modificado de Eagle (Gibco; Invitrogen; Life Technologies, Alemania), suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS; PAA, Pasching, Austria) y estreptomicina (100 mg /ml), penicilina (100 U /ml). La HGC-27, MKN-45, SGC-7901 se mantuvieron en medio RPMI 1640 (PAA) complementado con 10% de SFB (PAA). Las líneas celulares humanas GC MGC-803, HGC-27 fueron transfectadas con imita el miR-219-2-3p e imita el control negativo (miARN GenePharma; Shanghai, China, Tabla S1) a una concentración final de 10 nmol /L utilizando Dharmafect 1 (Thermo Fisher; IL, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante
TaqMan RT-PCR para los genes miARN expresión
el ARN total se extrajo de las células y los tejidos con el reactivo Trizol (Invitrogen, Calsbad. , CA, EE.UU.). MiRNAs se cuantificaron mediante PCR en tiempo real utilizando TaqMan ensayo de microARN (Invitrogen, EE.UU.). ADN complementario (ADNc) la síntesis de la primera cadena se llevó a cabo a partir de 1 g de RNA total en 12 l de volumen final que contiene cebador 2 M tallo-bucle, 10 mM dNTP Mix (Invitrogen, EE.UU.). La mezcla era de placas a 65 ° C durante 5 min, y luego se mezcla con 5 x tampón de RT, 0,1 M DTT, 200 U /l MultiScribe transcriptasa inversa y 40 U /l inhibidor de RNasa (Invitrogen, EE.UU.). La mezcla fue placa a 37 ° C durante 55 min, 70 ° C durante 15 minutos y después se mantuvo a -20 ° C. PCR en tiempo real se realizó utilizando un protocolo estándar de TaqMan PCR. Los 20 l PCRs reacciones incluyeron 1 l de producto de RT, 1 × TaqMan Universal Master Mix y 1 × sonda TaqMan /mezcla de cebadores (Invitrogen, EE.UU., el cuadro S1). Todas las reacciones de RT incluyendo los controles sin molde se realizaron por triplicado. Todos los datos de cuantificación de ARNm se normalizó a U6. La cantidad relativa de transcripción se calcula utilizando el método comparativo Ct.
5-Aza-CdR y tricostatina A Tratamiento de las líneas celulares
líneas celulares GC MGC-803 fueron tratados con 5-aza- 2 'desoxicitidina (5-Aza-CdR; Sigma-Aldrich, EE.UU.) a 0,7 mmol /L, 1,5 mmol /L, 3 mol /L y HGC-27 fueron tratados con 5-Aza-CdR en 0,5 mol /L, 1 mol /L, 1,5 mmol /L durante 3 días o 300 nmol /L tricostatina a (TSA; Sigma-Aldrich, EE.UU.) durante 24 horas. Para el tratamiento de combinación, las células fueron tratadas con 5-Aza-CdR durante 48 horas en primer lugar. A continuación se añadió TSA (300 nmol /L), y se trataron las células durante 24 horas adicionales. El medio de cultivo que contiene el fármaco se sustituyó cada 24 horas. RNA de las líneas celulares se purificó con reactivo de TRIzol siguiendo las instrucciones del fabricante. la síntesis de ADNc se llevó a cabo como se describió anteriormente, y 1 ml de la cDNA diluido para cada muestra se amplificó por RT-PCR utilizando el protocolo descrito anteriormente.
aislamiento del ADN y modificación con bisulfito
ADN genómico se obtuvo de -196 ° C en tumores primarios de nitrógeno líquido, y su igualaron los tejidos normales adyacentes (n = 22, 11 pacientes incluyen los que la expresión de miR-219-2-3p se redujeron reguladas y los otros fueron hasta reguladas) y usado Biomed Kit DNA (Biomed, Beijing, china) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. tratamiento con bisulfito y la recuperación de las muestras se llevaron a cabo con el kit de Epitect bisulfito (Qiagen; Hilden, Alemania). se utilizó ADN genómico (2 g) en 20 l de agua para cada reacción y se mezcla con 85 l de la mezcla de bisulfito y 35 l de ADN proteger buffer. conversión de bisulfito se realizó en un termociclador de la siguiente manera: 99 ° C durante 5 min, 60 ° C durante 25 min, 99 ° C durante 5 min, 60 ° C durante 85 min, 99 ° C durante 5 min, 60 ° C durante 175 min y 20 ° C de forma indefinida. El tratado con bisulfito de ADN se recuperó mediante columna de centrifugación Epitect y posteriormente se secuenció para confirmar la eficacia de la conversión de bisulfito.
El análisis de metilación
MSP se utilizó para analizar la metilación de miR-219-2-3p región aguas arriba en líneas celulares y tejidos. Methprimer se utilizó para diseñar MSP cebador (Tabla S1). reacciones MSP sobre nuevos cebadores fueron optimizados utilizando el control positivo metilado (M-ADN), que usando ADN humano normal de linfocitos periféricos tratadas in vitro con SSS I metiltransferasa (New England Biolabs, Beverly, MA). Se utilizó el ADN de dos linfocitos periféricos humanos normales como control normal. Touchdown PCR consistió en dos fases: fase 1 incluyó una desnaturalización inicial de 95 ° C durante 5 min, seguido de 45 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 30 s, recocido a temperaturas variables durante 30 s, y extensión a 72 ° C durante 40 s. En el primer ciclo, la temperatura de hibridación se fijó a 58 ° C y, en cada uno de los 10 ciclos posteriores, la temperatura de hibridación se redujo en 0,6 ° C. Fase 2 consistió en 35 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 52 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 40 s. productos MSP se analizaron en geles de poliacrilamida al 3%
proliferación celular, apoptosis, y el ciclo celular ensayo
Las células se incubaron en 10% CCK-8. (Dojindo; Kumamoto, Japón) diluido en normales medio de cultivo a 37 ° C hasta que la conversión de color visual ocurrió.