Extracto
Los microARN (miRNA) se ha demostrado que participar en muchos procesos celulares importantes incluyendo radiosensibilización. la familia VEGF, un importante regulador de la angiogénesis, también juega un papel crucial en la regulación de la radiosensibilidad de las células cancerosas. VEGFR2 media las principales acciones de crecimiento y de permeabilidad de VEGF de una manera paracrina /autocrina. Mir-200c, en el nexo de transición epitelio-mesenquimal (EMT), se prevé que apuntar a VEGFR2. El propósito de este estudio es poner a prueba la hipótesis de que la regulación de la vía de VEGFR2 por miR-200c podría modular la radiosensibilidad de las células cancerosas. El análisis bioinformático, los ensayos de reportero de luciferasa y ensayos bioquímicos se llevaron a cabo para validar VEGFR2 como objetivo directo de miR-200c. Los efectos radiosensibilizadores de miR-200c en las células A549 se determinaron mediante ensayos por clonación. El mecanismo de regulación aguas abajo de miR-200c se exploró con los ensayos de Western Blot, FCM, ensayos de formación de tubo y los ensayos de migración. Se identificaron VEGFR2 como una nueva diana de miR-200c. El ectópico miR-200c aumenta la radiosensibilidad de A549, mientras que miR-200c baja regulación disminuyó ella. Además, hemos demostrado que el miR-200c radiosensitized células A549 por la orientación vía VEGF-VEGFR2 en concreto, lo que conduce a la inhibición de la transducción de señalización corriente abajo favor de la supervivencia y la angiogénesis, y sirve como un objetivo potencial para la investigación radiosensitizition.
cita: Shi L, Zhang S, H Wu, Zhang L, X Dai, Hu J, et al. (2013) Mir-200c aumenta la radiosensibilidad de no pequeñas de pulmón de células A549 línea celular de orientación VEGF-VEGFR2 Camino. PLoS ONE 8 (10): e78344. doi: 10.1371 /journal.pone.0078344
Editor: Junming Yue, la Universidad de Tennessee Health Science Center, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Julio, 2013; Aceptado: September 11, 2013; Publicado: 30 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Shi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el proyecto de la Fundación Provincial de Hubei de Ciencias Naturales (n: 2009CDA061). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los pacientes sufrían de cáncer de pulmón no microcítico cuenta (CPNM) aproximadamente el 85% de todos los casos de cáncer de pulmón [1], [2]. La radioterapia (RT) es una modalidad de gran alcance ampliamente utilizado en clínica contra las células cancerosas. Sin embargo, muchos de ellos exhiben radioresistance intrínseca o adquirida a RT que lleva al fracaso [3] tratamiento. La acumulación de pruebas muestra que radioresistance es no sólo por las características intrínsecas sino el resultado de las interacciones entre las células cancerosas y los factores microambiente. El paracrina /autocrina papel del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) mediante la unión a sus receptores es un componente importante de microambiente tumoral y su autorregulación. Represión de la expresión del gen VEGF podría aumentar la radiosensibilidad de las células del cáncer [4], [5]. Y VEGFR2 se considera generalmente para mediar en la función principal atribuida a VEGF. La terapia de radiación combinada con VEGFR2 y el bloqueo de EGFR causó una mejora significativa de los efectos antitumorales en un modelo ortotópico de cáncer de pulmón [6]. inhibición de VEGFR2 Molecular podría mejorar la respuesta de la radiación del tumor a través de la orientación molecular de la vasculatura del tumor [7]. Así señalización paracrina de VEGF sede de célula de cáncer de VEGFR2 podría ser un componente importante de los fracasos RT [8]
.
Los microARN (miRNA) son un grupo de pequeños ARN no codificantes que suprimen la expresión diana mediante la unión a la 3 'no traducida (3'UTR). Un estudio que identificó miRNAs específicos de pulmón de rata por miARN microarrays reveló que el miR-200c expresa específicamente en los tejidos normales del pulmón de rata [9]. Y la pérdida de expresión de miR-200c podría inducir un fenotipo agresivo, invasivo y quimioresistente en el cáncer de pulmón de células no pequeñas [10]. Además, estudios independientes mostraron que la restauración de miR-200c podría aumentar la sensibilidad a agentes de quimioterapia en diversos tumores [11], [12]. Lo mismo ocurre con el miR-200c jugar un papel similar en la radioterapia del cáncer de pulmón de células no pequeñas?
El análisis bioinformático demostró que era un objetivo VEGFR2 buena predicho de miR-200c con dos sitios de unión. En este experimento, se investigó si VEGFR2 podría ser regulada por el miR-200c, que conduce a la modulación de la radiosentivitiy de las células A549.
Resultados
VEGFR2 es un objetivo directo de miR-200C
el análisis bioinformático reveló que VEGFR2 (factor de crecimiento endotelial vascular del receptor 2) es un objetivo previsto de miR-200c que puede inhibir directamente la expresión de genes (Fig. 1A). Las células A549 se transfectaron con imita el miR-200C (50 NM) o inhibidores de miR-200C (100 nm) para aumentar o disminuir la expresión de miR-200c. Imita controles (50 nM) o controles de inhibidores (100 nM) se transfectaron en células A549 como controles negativos respectivamente. PCR en tiempo real mostró que imita el miR-200C y los inhibidores de miR-200c podría aumentar de manera significativa o disminuir la expresión de miR-200c de A549 (datos no mostrados). Para confirmar aún más si miR-200c podría unirse directamente a 3'UTR de VEGFR2, se llevó a cabo el ensayo de doble gen indicador de luciferasa utilizando el plásmido pLuc-VEGFR2-3'UTR en las células A549. La transfección transitoria de las células A549 con pLuc-VEGFR2-3'UTR plásmido e imita miR-200C condujo a una disminución significativa de la actividad de luciferasa en comparación con los controles (Fig. 1B). Para examinar si el miR-200c podría afectar a la expresión de la proteína VEGFR2 en las células A549, llevamos a cabo ensayos de pernos occidentales y encontramos que imita el miR-200C redujeron la expresión de la proteína de A549 significativamente en comparación con los controles (Fig. 1C).
(A) miR-200c residuos en los puntos de destino en 3'-UTR del gen VEGFR2 inspeccionados por la bioinformática. (B) El constructo pLuc-VEGFR2-3'UTR contiene una secuencia de tipo salvaje de la 3'UTR de VEGFR2. El constructo pLuc-VEGFR2-3'UTR fue co-transfectadas con imita el miR-200C en células A549. La actividad de luciferasa se detectó 48 h después de la transfección. Y se muestra la relación entre el valor de la luciferasa normalizada. expresión de la proteína (C) VEGFR2 en células A549 se midió por Western blot 48 h después de la transfección. Cada experimento fue repetido tres veces. Los errores estándar de la media se muestran mediante barras de error. * Indica p. & Lt; 0,05 en comparación con el control
Imita Mir-200c El aumento de la radiosensibilidad de las células A549 mientras que los inhibidores de miR-200C Disminución él
Para estudiar si el miR-200c célula afectada radiosensibilidad, las células A549 se transfectaron con imita el miR-200C o inhibidores. ensayos de supervivencia de colonias, un estándar de oro para la estimación de la radiosensibilidad, se evaluaron después de 0-8 Gy de radiación. La transfección de células A549 con imita el miR-200C (50 nM) redujo significativamente la supervivencia celular después de la exposición a la radiación (SER
0,5 1,47, Fig. 2A). A la inversa, la transfección de las células A549 con inhibidores de miR-200C (100 nM) causó un aumento significativo de la supervivencia celular después de 0-8 Gy de radiación en comparación con los controles (SER
0,5 0,79, Fig. 2B).
sobreexpresión de miR-200c (a) mejoró la radiosensibilidad de las células A549 con el tratamiento IR, mientras que la inhibición miR-200c (B) mostró el efecto contrario. El si-VEGFR2 constructo VEGFR2 inhibe la expresión de proteínas de 48 h después de la transfección (C) dando como resultado la radiosensibilización de células A549 (D). Imita el control, control de inhibidores y el control de siRNA se transfectaron en células A549, respectivamente, como control negativo. Los ensayos de supervivencia clonogénico se repitieron tres veces con resultados similares. Los errores estándar de la media se muestran mediante barras de error.
VEGFR2 caída hecho por la interferencia de ARN usando el reactivo de transfección lipo2000. ensayo de supervivencia de la colonia mostró la caída de los niveles de expresión de proteína VEGFR2 (Fig. 2C) resultó en un aumento de la radiosensibilidad de A549 (SER
0,5 1,34) (Fig. 2D).
VEGF Neutralización abolido la Radiosensibilización efecto de miR-200c
Hemos examinado la variación de secreation VEGF en el medio extracelular después de la expresión de miR-200c ectópico, usando un ensayo ELISA de VEGF. Y no hay cambios significativos de VEGF secreation siguientes intervención miR-200c se han demostrado después de las pruebas duplicadas (Fig. 3A). Bevacizumab (BEV, 1 mg /ml), un anticuerpo de bloqueo monoclony-VEGF específica, se añadió entonces al medio de cultivo de las células A549 para disminuir la concentración de VEGF extracelular 1 hora antes de la transfección. ensayos de supervivencia de colonias se llevaron a cabo para investigar el efecto de radiosensibilización miR-200c con o sin neutralización de VEGF. Los resultados mostraron que miR-200c no podría disminuir la fracción de supervivencia después de la radiación sin activación inducida por VEGF (Fig. 3B).
ensayo (A) Se utilizó ELISA para detectar los cambios de secreción de VEGF después de la transfección de miR imita 200C en células A549. Bevacizumab (B) y su1498 (C) se aplicaron a bloquear la vía VEGF-VEGFR2. Entonces ensayos por clonación se llevaron a cabo para examinar el efecto de radiosensibilización de miR-200c después de VEGF-VEGFR2 bloqueo. Cada experimento fue repetido tres veces. Los errores estándar de la media se muestran mediante barras de error.
VEGFR2 bloqueo abolió el efecto Radiosensibilización de miR-200c
VEGFR2 fue bloqueado por su1498, un inhibidor de la tirosina quinasa de crecimiento endotelial vascular receptor del factor de 2 (VEGFR2). Su1498 se añadió al medio de crecimiento de las células A549 a una concerntration final de 5 uM una hora antes de la transfección. ensayos clonogénicos se llevaron a cabo para acceder a la supervivencia de las células A549 después de diferentes dosis de radiación. Los resultados mostraron que rdiosensitization por la inhibición de VEGFR2 se bloqueó de manera significativa mediante la inhibición de VEGFR2 vía (Fig. 3C). Así que el miR-200c aumenta la radiosensibilidad de A549 principalmente por la orientación vía VEGFR2.
Mir-200c inhibió la activación de ERK1 /2 y Akt
Para estudiar más a fondo si las vías de transducción de señales de VEGFR2 estaban involucrados en la radiosensibilización de A549, hemos investigado las vías de MAPK y Akt que eran más importantes vías pro-supervivencia aguas abajo de VEGFR2. Las células A549 se transfectaron con imita el miR-200C o inhibidores. A continuación, se analizó el nivel de expresión y la activación de ERK1 /2 y Akt, que son las moléculas efectoras de MAPK y la vía AKT. En comparación con las células tratadas con los controles imita, la activación de ERK1 /2 y Akt indicado por p-ERK1 /2 y P-Akt fueron significativamente las reguladas en las células A549 tratadas con imita miR-200C (Fig. 4). Por el contrario, los inhibidores de miR-200C aumentó la activación de ERK1 /2 y Akt en comparación con inhibidor controles. Estos datos sugieren que la activación de ERK1 /2 y Akt modular el efecto radiosensibilización de miR-200c (Fig. 4).
expresión ectópica de miR-200c inhibe la fosforilación de Akt y ERK1 /2, la inhibición de miR 200c aumento de la activación de Akt y ERK1 vía /2. Cada experimento se repitió tres veces.
Mir-200c inhiben la angiogénesis y la migración de las células HUVEC
Además, investigó si que miR-200c, un regulador directa de VEGFR2, podrían regular la angiogénesis de las células endoteliales. 48 horas después de la transfección, las células HUVEC se mantuvieron en ayunas durante la noche y se sembraron en placas de 96 pocillos que fueron pre-recubiertos con Matrigel. Después de la incubación durante 16 horas, las células transfectadas-miR-200c mostraron un deterioro significativo de la capacidad de formación de tubo. Además, la baja regulación de VEGFR2 por si-VEGFR2 podría también inhibir la angiogénesis de las células HUVEC. Dado que la migración es un paso importante de la angiogénesis, también detectó el impacto de miR-200c sobre la migración de las células HUVEC. Como se muestra en la Figura 5, la expresión ectópica de miR-200c inhibió significativamente la angiogénesis y migración de las células HUVEC. Por otro lado, la supresión de miR-200c aumenta la formación del tubo y la migración en un 30% para las células HUVEC.
HUVEC fueron transfectadas con imita el miR-200C, inhibidores de miR-200C o si-VEGFR2. HUVEC (A) se cultivaron en Matrigel 48 h después de la transfección. Se cuantificaron Imágenes representativas de estructuras similares a capilares formadas y (B) la longitud de la estructura capilar. (C) Las HUVEC transfectadas también fueron sembradas en la cámara superior del tamaño de poro de 8,0 mm placas de 24 pocillos Transwell para investigar la capacidad de la migración celular. (D) Se contaron las células migratorias y se analizaron estadísticamente. Cada experimento fue repetido tres veces. Los errores estándar de la media se muestran mediante barras de error. * Indica p & lt; 0,05 en comparación con el control
Discusión
El trabajo previo de nuestro grupo y otros han sugerido que el VEGF modula la supervivencia del tumor a través de una variedad de maneras, incluyendo radiosensibilización [13]. -[15]. VEGF induce efectos biológicos de una manera paracrina /autocrina mediante la unión a sus receptores, especialmente VEGFR2 (KDR, FLK-1). Algunos estudios preclínicos han demostrado que los beneficios terapéuticos de la radioterapia se podrían mejorar cuando se combina con inhibidores de VEGFR2 [16]. Orientación de vía de VEGFR2 proporciona una nueva manera de superar radioresistance en la terapia de radiación de diversos tipos de cáncer. Recientemente, algunos miRNAs se demostraron para modular la terapia de radiación de las células cancerosas. MiR-200c es el regulador clave de la transición (EMT) epitelio-mesenquimal que está asociado con la embriogénesis, la progresión del cáncer y la metástasis. Y miR-200c se expresa específicamente en los tejidos del pulmón de rata normales [9] mientras que la pérdida de expresión de miR-200c induce un fenotipo agresivo, invasivo y quimioresistente en el cáncer de pulmón de células no pequeñas [10]. VEGFR2 es un objetivo previsto de miR-200c mediante análisis bioinformático (http://www.targetscan.org). Por lo que es importante averiguar si el miR-200c podría modular la radiosensibilidad de las células cancerosas al dirigirse vía VEGFR2.
Por dual de luciferasa ensayos de gen reportero y Western blot, hemos demostrado VEGFR2 como objetivo directo de miR-200c . A continuación, hemos probado los efectos de la expresión ectópica de miR-200c en la radiosensibilidad de las células A549. Encontramos que la regulación de miR-200c con imita el miR-200C redujo significativamente la expresión de la proteína VEGFR2 y el aumento de la radiosensibilidad de las células A549 después de diferentes dosis de radiación. Sin embargo, la baja regulación de la expresión de miR-200c con inhibidores de miR-200c aumenta la supervivencia celular y la disminución de la radiosensibilidad. Hemos construido más si-VEGFR2 para inhibir la proteína VEGFR2 de las células A549. Los resultados mostraron que la disminución de la expresión de VEGFR2 utilizando si-VEGFR2 podría mejorar la radiosensibilidad en células A549, que fue consistente con los efectos de VEGFR2 baja regulación en otras líneas de células tumorales [17], [18]. Así que el miR-200c podría aumentar la radiosensibilidad de A549 mediante la inhibición de la expresión de VEGFR2.
Sin embargo, una sola miARN podría regular cientos de genes diana. Lo mismo ocurre con las células A549 radiosensibilizar miR-200c principalmente a través de la orientación vía VEGFR2? Su1498 es un inhibidor de tirosina quinasa específico para VEGFR2. Encontramos que el miR-200c no podía radiosensibilizar A549, mientras que VEGFR2 fue inhibida por su1498. Dado que el VEGF es el ligando principal de VEGFR2 funcionaba de una manera paracrina /autocrina, que examinó por primera variación de la secreción de VEGF después de la transfección de miR-200c y encontramos que imita el miR-200C no podían afectar a la secreción de VEGF de A549. A continuación, neutralizamos VEGF secretada fuera de las células A549 con bevacizumab antes de la transfección de miR-200c, y nos dieron un resultado negativo al igual que la inhibición de VEGFR2. Así que esto sugiere que el miR-200c podría radiosensibilizar células A549 por la orientación vía VEGF-VEGFR2.
A continuación, investigaron aún más los mecanismos de aguas abajo de radiosensibilización miR-200c. MAPK y PI3K /AKT vías de transducción de dos importantes vías de señalización corriente abajo de VEGFR2 [19]. la orientación directa y la inhibición de estas dos vías pueden aumentar la radiosensibilidad de las células cancerosas. La fosforilación de p44 /42-MAPK (Thr202 /Tyr204) y Akt (Ser473), que son moléculas clave de MAPK y la señalización /Akt vías PI3K, por lo general aumenta la supervivencia de las células cancerosas después de la radiación. En nuestro estudio, se tomaron ensayos de Western blot para examinar los cambios en el nivel de fosforilación de Akt y ERK1 /2 (p44 /42 MAPK) después de tansfection imita el miR-200C o inhibidores en células A549. Se encontró que mientras que el aumento de expresión de miR-200c condujo a una inhibición de Akt y ERK1 /2 fosforilación, disminución de la expresión de miR-200c mejorada Akt y ERK1 /2 fosforilación en A549.
hipóxico microambiente extrínseca a las células cancerosas contribuye significativamente a radioresistance de la radioterapia [7]. Supresión de la angiogénesis mejora de forma significativa la radiosensibilidad de las células cancerosas. Y VEGFR2, un mediador clave de la angiogénesis, podría afectar a la microenviroment tumor (TME) que modulan la radiosensibilidad de células de cáncer. Nuestros datos sugieren que la expresión ectópica de miR-200c suprime la angiogénesis de las células HUVEC.
Además, también se investigó otros mecanismos de interacción de miR-200c-VEGFR2. Con ensayos de MTT o FCM, no se encontraron efectos significativos de miR-200c en el ciclo celular, la apoptosis o la proliferación de células A549 (datos no mostrados).
En conjunto, nuestros resultados indican que la inhibición de miR-200c-mediada de la cascada de señalización de VEGF-VEGFR2 podría radiosensibilizar células A549 línea celular de NSCLC humano a la radiación, que es un objetivo terapéutico de radiosensibilización.
Conclusiones
Nuestros datos sugieren que el miR-200c podría A549 significativamente radiosensibilizar al dirigirse a las células vía VEGF-VEGFR2.
Materiales y Métodos
Cell Culture
células A549, obtenida a partir del Banco de células de la Academia china de Ciencias (Shanghai, china), se cultivaron en medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10% a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 atmósfera. células HUVEC de la American Type Culture Collection (ATCC) se cultivaron en medio de células endoteliales (ECM; Sciencell, EE.UU.). El medio de cultivo se renueva cada 2-3 días. Y las células se pasaron a 1:6 cada 4 días después de la tripsinización con 0,05% de tripsina-EDTA.
transfección transitoria y tratamientos con células
imita Mir-200c, inhibidores de miR-200C, si- VEGFR2, controles imita, controles de inhibidores, y siRNA controles fueron sintetizados por Ribobio (Guangzhou, República Popular china). Las células se sembraron a 4 × 10
5 por células en placas de 6 pocillos un día antes de la transfección. Se empleó Lipofectamine reactivo 2000 (Invitrogen) de transfección para transfectar células con imita miR-200C (50 nM), los inhibidores de miR-200C (100 nM) o ARN pequeño de interferencia VEGFR2 (si) (100 nM). No-dirigidos imita los controles (50 nm), controles de inhibidores (100 nm) o controles siRNA (100 nm) se transfectaron en células como controles negativos, respectivamente. 6 horas después de la transfección, el medio de crecimiento de células se eliminó y se incubó en un medio que contiene 5% de FBS durante otros 24-72 horas. Otros experimentos se realizaron con células transfectadas o lisis celular. Su1498 (Santa Cruz Biotechnology) o bevacizumab (Roche) fue administrada 60 minutos antes de la transfección.
identificación de objetivos de miR-200C
El uso de Lipofectamine 2000 (Invitrogen), las células A549 fueron transfectadas con el reportero de luciferasa construcciones que contienen el 3'UTR de VEGFR2 o los vectores de control negativo (Promega). Las mezclas de transfección contenían 100 ng de plásmido reportero fireflyluciferase y 50 nM de dúplex miR-200c sintético. Se recogieron las células A549 48 horas después de la transfección, y se midió la actividad de luciferasa usando el sistema Dual Luciferase reportero de ensayo (Promega).
clonogénico Ensayo
sensibilidad de las células A549 de la irradiación se determinó mediante ensayo clonogénico después de las dosis variables de radiación (0Gy, 2Gy, 4Gy, 6Gy, 8 Gy) usando un acelerador lineal Primus (K, Siemens, Munich, Baviera, Alemania). Después de la incubación durante 10-14 días, las colonias formadas se fijaron con metanol y se tiñeron con 1% de cristal violeta. Sólo se contaron las colonias que constan de más de 50 células. Los datos se ajustaron a la modelo lineal-cuadrática utilizando el software Sigmaplot, donde se generaron las curvas de supervivencia y se calcularon los parámetros de radiosensibilidad. Los experimentos se repitieron tres veces
medición del nivel de VEGF
El nivel de VEGF secreation por las células A549 se evaluó mediante el kit humano VEGF-ELISA (amp I +; D, EE.UU.). De acuerdo con el protocolo del fabricante .
Western Blotting
Las células de lisis se preparó y se separa por 8-12% de SDS-PAGE, seguido de la transferencia a membranas de PVDF (Millipore). Para la detección, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios específicos y anticuerpos secundarios secuencialmente. Los anticuerpos primarios contra VEGFR2 o β-actina se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology. Los anticuerpos primarios contra p-ERK1 /2 y P-Akt se adquirieron de señalización celular. ERK1 /2 de anticuerpos y anticuerpos Akt se adquirieron de Proteintech. Las bandas de proteínas fueron desarrolladas utilizando quimioluminiscencia mejorada en películas o imágenes de fluorescencia.
Tubo de Ensayo de Formación y migración celular Ensayo
Para el ensayo de formación de tubos, 1 × 10
4 células HUVEC se sembraron en placas de 96 pocillos que estaban pre-recubiertas con 50 l /pocillo Matrigel (BD Biosciences) y se incubaron a 37 ° C. Alrededor de 16 horas más tarde, los tubos capilares formados fueron evaluados en campos aleatorios. Para el ensayo de migración, intervinieron Se añadieron células HUVEC a la cámara superior de las placas de tamaño de poro de 24 pocillos Transwell de 8,0 mm (Millipore). La cámara inferior se llenó con medio de crecimiento completo como un quimioatrayente. Después de incubación a 37 ° C durante 24 horas, se retiraron las células de la superficie superior de la membrana. Las células migradas se fijaron y tiñeron con tampón de cristal violeta 0,5% durante aproximadamente 20 minutos. Los valores contados de campos aleatorios bajo el microscopio se analizaron estadísticamente.
Análisis estadístico
Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar y se analizaron estadísticamente utilizando
t
prueba de Student. valor de P & lt; 0,05 se consideró significativo un
.