Extracto
La presencia de células madre del cáncer (CSC) o células iniciadoras del tumor puede conducir a la recurrencia del cáncer en una interacción célula-microambiente permisiva, la promoción de la invasión en el glioblastoma (GBM) y el neuroblastoma (NB). La matriz extracelular (ECM) proteoglicanos pequeños ricos en leucina (SLRPs) desempeñan múltiples funciones en la homeostasis del tejido por la remodelación de la matriz extracelular (ECM) componentes y la modulación de vías de señalización intracelular. Debido a sus propiedades pan-inhibidor contra los receptores tirosina quinasas (RTK), se reportan SLRPs para ejercer efectos anticancerígenos
in vitro
y
in vivo
. Sin embargo, su papel parece ser específica de tejido y que también están involucrados en la migración de células cancerosas y resistencia a los medicamentos, allanando el camino para diferentes escenarios complejos. El objetivo de este estudio fue determinar si la decorina SLRPs (DCN) y lumican (LUM) son reclutados en la plasticidad celular y la adaptación microambientales de las células cancerosas diferenciadas inducidas hacia el fenotipo de tallo similares. neuroesferas flotantes se generaron mediante la aplicación de medio de enriquecimiento CSC (medio libre de suero de células madre neurales, NSC SFM) a las líneas celulares de cáncer de SK-N-SH establecido SF-268 y, modelos celulares de GBM y NB, respectivamente. En ambos modelos, se observó la activación sinérgica dependiente del tiempo de DCN y LUM. Se detectó la expresión /proteína más alto DCN y LUM ARNm celular después de la exposición a la NSC SFM para el 8/12 días, teniendo en cuenta estas células como SLRP que expresan (SLRP
+) CSC-similares. imagen ultraestructural mostró la heterogeneidad celular, tanto de la MBG y neuroesferas NB y se identificaron las células vivas interiores. líneas celulares de sus padres tanto de GBM y NB sólo crecieron en agar blando + NSC SFM, mientras que las neuroesferas secundarias (originaron de SLRP
+ t
8-CSC similares) mostraron menores tasas de proliferación que neuroesferas primarias. Curiosamente, el SLRP
+ CSC-como de la MBG y neuroesferas NB fueron resistentes a la temozolomida (TMZ) a concentraciones & gt; 750 mM. Nuestros resultados sugieren que GBM y NB CSC-como promover la activación de grandes cantidades de SLRP en respuesta a CSC enriquecimiento, adquiriendo simultáneamente resistencia TMZ, heterogeneidad celular, y un fenotipo de reposo, lo que sugiere un papel fundamental novedoso para SLRP en resistencia a los medicamentos y la plasticidad celular de CSC-similares, que permiten la supervivencia celular y el potencial de modulación de ECM /nicho
Visto:. Farace C, Oliver JA, Melguizo C, P Alvarez, Bandiera P, Rama AR, et al. (2015) microambientales Modulación de la decorina y Lumican en temozolomida resistente glioblastoma y cáncer de Neuroblastoma células madre similares. PLoS ONE 10 (7): e0134111. doi: 10.1371 /journal.pone.0134111
Editor: Dragana Nikitovic-Tzanakaki, Universidad de Creta, Grecia
Recibido: 28 de abril de 2015; Aceptado: July 6, 2015; Publicado: 31 de julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Farace et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación la Marató de TV3, Proyecto n ° 111431.
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Antecedentes
el glioblastoma (GBM) y el neuroblastoma (NB) son el sistema nervioso cánceres malignos más frecuentes y letales en pacientes adultos y pediátricos, respectivamente. La Organización Mundial de la Salud considera que el GBM astrocitoma más agresivo, y se puede convertir en GBM secundaria de gliomas de bajo grado, o
de novo
con rápida progresión a la muerte [1]. En contraste, NB surge principalmente a partir de células de la cresta neural como un cáncer neuroendocrino del sistema nervioso simpático, y 60% de los pacientes pediátricos muestran enfermedad metastásica en el momento del diagnóstico [2]. Aunque la temozolomida (TMZ) -un agente de alquilación que induce la muerte celular por toda la alquilación de ADN /metilación de residuos de guanina-en combinación con otros fármacos o radioterapia representan un tratamiento de primera línea el aumento de la supervivencia global (SG) de los pacientes con GBM o NB [ ,,,0],3, 4], resistencia a los medicamentos y la progresión del cáncer son comunes. Debido GBM es altamente invasiva en el cerebro y NB tiende a invadir otros órganos, OS paciente sigue siendo pobre (& lt; 1,5 años en los pacientes con GBM y 4 años en pacientes NB). [5, 6],
El fracaso del tratamiento en pacientes con cáncer ha sido previamente relacionados con subpoblaciones de células madre del cáncer (CSC), que aseguren el mantenimiento de la heterogeneidad del cáncer, y estas subpoblaciones CSC son más resistentes a los fármacos selectivos a través de múltiples pasos concertados de auto-renovación y diferenciación [7-9]. Metástasis y la recurrencia del cáncer también están relacionados con el comportamiento de las células madre cancerosas, incluyendo su fenotipo quiescente, capacidad migratoria, y la evasión del sistema inmune [10]. abundante investigación sugiere que las células madre similares a las células están equipadas con maquinaria innata que los protege de la radio /quimioterapia [11, 12]. Esto incluye mecanismos relacionados madre, tales como nichos de protección de células y los cambios en la expresión de genes implicados en la regulación del ciclo celular, reparación del ADN, el metabolismo de fármacos, y de eflujo de fármaco [13]. La resistencia a los medicamentos y el potencial de invasión celular de células madre cancerosas también aumentan en la transición reversible epitelio-mesenquimal fenotípica (EMT) [14, 15], que recapitula la EMT en la organogénesis y el desarrollo [16, 17] normal.
Varias señales microambientales, incluyendo la reorganización de la matriz extracelular (ECM), la hipoxia y factores autocrinos /paracrinos, pueden determinar madre y células de cáncer de Fates [18-25], y el gatillo o inhibir los procesos de EMT [26, 27]. Por lo tanto, glicoproteínas y proteoglicanos de ECM que son capaces de modificar tanto el medio ambiente ECM y vías de señalización intracelular son de suma importancia en el microambiente del cáncer [28-30]. Los proteoglicanos pequeños ricos en leucina (SLRPs), que comparten estratégicamente dominios conservados, representan un claro ejemplo del concepto antes mencionado. El núcleo de la proteína rica en leucina (40-50 kDa) se unen a una serie de factores de crecimiento (GF) y receptores de membrana, mientras que la ramificación de cadenas laterales glycosaminoglycanic intervengan en el montaje ECM-colágeno y también en receptor de membrana de unión. Curiosamente, a pesar de sus propiedades pan-inhibidora contra tirosina quinasas receptoras (RTK) y las vías de crecimiento del cáncer, el "guardián de la matriz" decorina (DCN) y lumican (LUM) SLRPs podría ejercer efectos anticancerígenos
in vivo
y
in vitro
[31-33]. Sin embargo, estudios recientes han arrojado luz sobre las propiedades específicas de tejido recién identificados, tanto de DCN y LUM en tejidos normales y en el microambiente del cáncer maligno. Según lo informado por otros autores, la inhibición parcial de glioma por DCN en experimentos de terapia génica en ratas trae consigo una marcada reducción de la infiltración de células de la microglia [34], lo que podría afecta a la inhibición del cáncer
in vivo
. DCN también mejora la evasión del sistema inmune y la invasión del músculo en el cáncer de próstata
in vivo
[35], y ejerce efectos protectores y antiapoptóticos inesperados en líneas de células de glioma en condiciones hipóxicas [36]. En las células de carcinoma de células escamosas orales malignos, la localización nuclear de DCN parece mejorar la invasión celular
vía
el receptor del factor de crecimiento epidérmico nuclear (EGFR) vía [37, 38], el crecimiento, mientras que en células de osteosarcoma, mediada por DCN arresto se evita
a través de
la activación prolongada de la membrana EGFR [39]. Clínicamente, DCN se ha propuesto como mecanismo regulador de la quimioresistente en el cáncer oral [40] y en relación con la resistencia a fármacos y la reducción de la supervivencia en pacientes con GBM [41]. De manera similar a DCN, LUM se informa para mediar en la supresión de tumores. Sin embargo, LUM se expresa en los cánceres de páncreas de alta calidad con un bajo grado de diferenciación [42] y en pacientes con GBM, también. LUM también inhibe la adhesión celular y promueve la migración de células de osteosarcoma mediante la regulación de la β2 factor de crecimiento transformante (TGF-β2) /SMAD2 vía [43], y un proteoglicano 70-kDa LUM parece aumentar la proliferación de células de cáncer e inhibe la migración de páncreas Células cancerígenas. Además, junto a DCN, LUM se upregulated en cabeza y cuello células cancerosas resistentes al cisplatino [44].
Es de destacar que SLRPs se expresan en nichos de células madre en el embrión de pollo [45], en endotelial cerebral las células [46], en progenitores de diversos tipos de células [47], y en una subpoblación de células NB que no responde al crecimiento de neuritas nervio del factor de crecimiento mediada por [48]. DCN derivados de astrocitos también inhibe la diferenciación de células madre de células /progenitoras neurales hacia una estructura de células similares a neuronas [49]. La alteración de las características mecánicas de tres dimensiones (3D) de las matrices de colágeno, SLRPs son reclutados durante el ontogénica (desarrollo) de EMT [50], la migración precursor celular y la diferenciación [51], y la cicatrización de heridas /reparación de los tejidos en respuesta a una lesión del sistema nervioso central y la inflamación [52]. En este contexto, es concebible que los pequeños proteoglicanos DCN y LUM juegan un papel en la biología de las células madre cancerosas de origen sistema nervioso. Con este fin, se determinó la participación de DCN y LUM en GBM y NB CSC-como modelos, la simulación de los fenómenos de pérdida de anclaje y la separación de las células tumorales diferenciadas que subyacen en el proceso de la EMT, y su relación con el comportamiento de CSC-like y la la respuesta celular a TMZ. En este estudio, se presenta por primera vez la expresión sinérgica masiva de DCN y LUM SLRPs en GBM y NB líneas celulares sometidas a flotante basado en el enriquecimiento neurosphere 3D CSC-similares. micrografías Neurosphere ponen de manifiesto la heterogeneidad y la polarización de células madre similares a las de los modelos 3D y NB GBM. Por otra parte, SLRP
+ NB y GBM CSC-como aislado de las neuroesferas mostró menores tasas de proliferación, menos la apoptosis, y una mayor resistencia a los medicamentos que las líneas celulares de sus padres, lo que sugiere un papel fundamental y sinérgicos para DCN y LUM en la resistencia a TMZ, la supervivencia y el mantenimiento de reposo, lento-ciclismo, subpoblaciones de CSC-como.
Métodos
líneas celulares y CSC enriquecimiento
En este estudio, dos GBM establecido y NB líneas celulares se inscribieron. La línea de células SK-N-SH es una línea de células epiteliales comercial derivado originalmente de la metástasis de médula ósea de un 4 años de edad, de raza caucásica mujeres que sufren con NB, y se enriquece con anterioridad en CSC-similares. Por el contrario, SF-268 es una línea celular epitelial derivado de un astrocitoma anaplásico de alto grado, que nunca se ha utilizado para el enriquecimiento de CSC-similares. El-N-SH SK establecida (de los American Type Culture Collection) y SF-268 líneas celulares de cáncer (amablemente proporcionados por el Centro de Instrumentación Científica de la Universidad de Granada) se mantuvieron rutinariamente como cultivos adherentes (monocapas) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM ) suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina /estreptomicina, en una atmósfera humidificada a 37 ° C con 5% de CO
2. Las células confluentes se separaron en 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) de ácido -ethylenediaminetetraacetic (EDTA) a 37 ° C durante 10 minutos, se lavaron dos veces en PBS, y se subcultivaron como monocapas. CSC enriquecimiento de las líneas celulares de cáncer se realizó mediante la generación de neuroesferas en medio libre de suero de células madre neurales (NSC SFM) [53, 54], que contiene KnockOut DMEM /F12 más factor de crecimiento de fibroblastos básico 20 g /ml (bFGF), 20 g /ml de factor de crecimiento epidérmico, 1 × StemPro Neural Suplemento (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), 1% de L-glutamina, y 1% de penicilina /estreptomicina. NSC SFM fue reemplazado cada 2 días después de la centrifugación leve de las neuroesferas.
La extracción de ARN y la transcripción inversa cuantitativa (QRT)-PCR
La expresión de DCN y LUM ARNm se evaluó en t
0 y células neuroesferas después de 4 (t
4), 8 (t
8), y 12 días (t
12) de enriquecimiento CSC. Las líneas celulares de sus padres en DMEM que fueron utilizados como control (t
0). Se extrajo el ARN con el Mini Kit RNeasy (Qiagen, MD, EE.UU.) y se cuantificó con un NanoDrop (Thermo Scientific, DE, EE.UU.). El ARN (1 g) de cada muestra se invirtió transcrito con M-MLV transcriptasa inversa (Sigma, Italia), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y la amplificación basada en verde SYBR (Applied Biosystems, Foster City, CA) se realizó con el CFX96 real Sistema de Detección de PCR -Tiempo (Bio-Rad, Italia), como se informó anteriormente [55]. El programa de ciclo de PCR fue: 50 ° C (2 min), 95 ° C (2 min), 42 ciclos de: desnaturalización a 95 ° C (30 s), hibridación a 56 ° C (30 s), y extensión a 72 ° C (40 s), seguido de un análisis de la curva de fusión (intervalo de 56 a 95 ° C) con incrementos de 0,5 ° C /5 s para evaluar la especificidad del cebador. Las secuencias de los cebadores fueron: adelante 5'-GGA CCG TTT CAA CAG AGA GG-3 ', 5'-GAC inversa CAC TCG ATG AAG GCA TT-3' (DCN); adelante 5'-TGG AGG TCA ATC AAC TTG AGA A-3 ', 5'-CAA inversa ACG ATG CAA GAT CTT CTT-3' (LUM); adelante 5'-GGA CAA GTA AGA CCC CTG CAG-3 ', 5'-TCT revertir ACA TGG AAC CTG TGA GGA G-3' (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, GAPDH); adelante 5'-GGC ATC CTC CAC CTG AAT GA-3 ', 5'-AGG inversa TGT GGT GCC AGA TTT TC-3' (β-actina, ACTB). Las transcripciones objetivo fueron independientemente normalizaron a GAPDH y ACTB (genes de limpieza), y el ARN de las células t
0 se utilizó como el control de calibración. Los resultados se expresaron en una escala logarítmica como cambios veces (FCS), con el 2
-ΔΔCt método.
Western Blot
extractos de proteínas enteras se obtuvieron con el tratamiento con ultrasonidos pulsada de celular gránulos en 200 l de tampón de extracción que contiene 50 mM Trizma-base, sacarosa 0,25 mM, EDTA 5 mM (pH 7,4), 0,5% de Triton X-100 y 1% de cóctel inhibidor de la proteasa. Las concentraciones de proteína se determinaron con el método de Bradford. Las proteínas (50 g) se mezclaron 1: 1 con 2 x tampón de Laemmli, se calentó a 95 ° C durante 5 min, y se cargaron en un gel desnaturalizante de SDS-PAGE 12% con el Kaleidoscope estándares preteñidos. Las proteínas se separaron por electroforesis a una tensión constante (90 V) durante 90 min y se transfirieron a una membrana de 0,45 micras de nitrocelulosa bajo condiciones semisecos con la Trans-Blot SD Semi-Dry electroforética de la célula de transferencia (Bio-Rad, España) durante 25 min a 200 mA. Las membranas se bloquearon con 5% de leche desnatada en PBS, se incubaron a 4 ° C durante la noche con anticuerpo anti-LUM policlonal de conejo (diluido 1: 100; sc-33785, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) o anticuerpo monoclonal de ratón anti-DCN anticuerpo (1:50; sc-73896, Santa Cruz Biotechnology) en tampón de bloqueo, se lavó 4 veces en solución de lavado (0,1% Tween en PBS), se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h con el anticuerpo secundario con peroxidasa de rábano conjugada monoclonal apropiado (1: 5000; Sigma Aldrich), y se lavó de nuevo en solución de lavado. Las transferencias se detectaron con ECL Western Blotting reactivos de detección (Amersham; Reino Unido). Se utilizó el sistema 4000 Molecular Imager VersaDoc MP (Bio-Rad, Hercules, CA) para la visualización de quimioluminiscencia. Los blots fueron despojados y se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón anti-β-actina de anticuerpos. (1: 30.000; Sigma Aldrich) como el control de carga
culturas agar blando
Las líneas celulares se cultivaron en suave agar para evaluar su colonia o neurosphere formación en condiciones independientes de anclaje, en DMEM o NSC SFM. Para explorar la proliferación de la SLRP
+ CSC-como después de CSC enriquecimiento durante 8 días (T
8-CSC similares), neuroesferas secundarias fueron generados a partir de t
8-CSC similares. Brevemente, StemPro Accutase Cell disociación del reactivo (Invitrogen) se utilizó para disociar las t
8 neuroesferas. Se realizó un ensayo de exclusión con azul de tripano y se recogieron 5 × 10
3 /ml células en 2 × NSC DMEM o SFM. Las células se mezclaron 1: 1 con una solución precalentada que contiene 0,6% de agarosa ultrapura en PBS (0,3% de concentración de agar final), se sembraron por triplicado en placas de seis pocillos en 2 ml de agar inferior solidificado 0,6%, y se incubaron en una atmósfera humidificada a 37 ° C con 5% de CO
2. Los cultivos de agar blando se fotografiaron diariamente bajo un microscopio de contraste de fases invertido (Nikon Eclipse TE 2000-S).
Transmisión y electrónica de barrido de imágenes microscópicas
Ocho días (t
8 se recogieron) neuroesferas, se lavaron en PBS, y se fijaron en glutaraldehído al 2,5% en PBS 0,1 M (pH 7,4) durante 2 horas a 4 ° C. Las neuroesferas fijadas se lavaron cuidadosamente cuatro veces en PBS, se fijaron posteriormente en tetróxido de osmio al 1% (OSO
4) en 0,1 M PBS durante 1 hora a 4 ° C, y se almacenaron en PBS a 4 ° C hasta que la incrustación. Las muestras utilizadas para la microscopía electrónica de transmisión (TEM) se deshidrataron en series de concentraciones crecientes de acetona y se embebieron en resina epoxi para ultrafina seccionar a 60 ° C durante la noche. Las lonchas cortadas ultrafinas con un Ultratome 8800 (LKB, Bromma, Suecia) se tiñeron con acetato de uranilo al 4% y citrato de plomo y vistos en un Zeiss EM 109 a 902 microscopio electrónico de transmisión (Zeiss, Alemania Oberchochen). Por microscopía electrónica de barrido (SEM), las neuroesferas se fijaron posteriormente se incubaron en hexametildisilazano puro durante 1 hora a 4 ° C, se seca en un secador de punto crítico (Polaron, Watford, Reino Unido), y metalizados en un S150A Sputter (Edwards, Crawley, Reino Unido) para la exploración en Quanta 200 (FEI, Eindhoven, Países Bajos) o DSM 962 instrumentos SEM (Zeiss, Oberchochen, Alemania).
tratamiento TMZ y MTT ensayo
las células individuales de las monocapas y t
8 neuroesferas de ambas líneas celulares se recogieron como se describe anteriormente. La viabilidad celular fue probado con exclusión de azul de tripano y 5 × 10
3 células /pocillo fueron sembradas en placas de microtitulación de 96 pocillos, en DMEM o NSC SFM. El día siguiente, el medio se reemplazó con medio fresco con o sin diferentes concentraciones de TMZ (25 a 1500 g /ml, Sigma, Madrid, España). DMSO se incluyó como el control del vehículo. Cada condición se ensayó en seis pozos. Tres días más tarde, el medio se reemplazó con medio fresco para preservar la actividad de TMZ. El punto final del tratamiento TMZ fue establecido el día 6. Por último, un grupo 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) ensayo colorimétrico se realizó (Sigma). Brevemente, se añadieron 20 l de MTT /pocillo y las placas se incubaron a 37 ° C. Después de 4 h, el medio se retiró cuidadosamente y se añadió DMSO para disolver las sales de formazan. Las reacciones se midieron con un fotómetro de microplacas Multiskan EX (Thermo Scientific, Madrid, España) a 570 nm. La dosis-respuesta TMZ se expresó como el porcentaje de inhibición (%) de la célula metabólica actividad relativa a la de las células no tratadas y se ajusta con el control del vehículo. La inhibición del crecimiento celular por TMZ fue evaluada en experimentos por cuadruplicado.
El análisis estadístico
de Student de dos colas
se utilizó t
prueba para determinar la significación estadística de las diferencias en las los resultados del tratamiento de TMZ para el SLRP
+ CSC-like y las líneas celulares de sus padres. Las diferencias en la expresión génica qPCR se evaluaron con análisis unidireccional de la varianza (ANOVA). La significación estadística se estableció en p. & lt; 0,05
Resultados
expresión DCN y LUM durante basada en el enriquecimiento neurosphere CSC
Las neuroesferas de ambos SF-268 y SK-N-SH líneas de células adquirieron conformaciones 3D regulares que resultan de la proliferación radial sostenida de la mayoría de las células, que alcanzan & gt; 50 micras después de 4 días (Fig 1A). Un análisis de QRT-PCR mostró que la expresión DCN y LUM mRNA, con la excepción de LUM en SF-268 t
12, el aumento en condiciones de enriquecimiento CSC en ambas líneas celulares, que muestra los más altos valores de expresión DCN y LUM de ARNm después de 8 días (t
8). En comparación con las líneas celulares de sus padres (T
0), y teniendo en cuenta ACTB como gen de mantenimiento, GBM CSC-como eran más enriquecida en ARNm LUM (FC
Lum
= t
0: 1; t
4: 11,00; t
8: 21.70; t
12: 9,51) que en DCN ARNm (FC
Dcn
= t
0: 1 ; t
4: 6,32; t
8: 17,87; t
12: 11,08) (p & lt; 0,01). mostraron niveles más altos de ARNm LUM Del mismo modo, el NB-CSC como (FC
Lum
= t
0: 1; t
4: 29.04; t
8: 105.78; t
12: 60.12) que los niveles de mRNA DCN (FC
Dcn
= t
0: 1; t
4: 23.02; t
8: 80,44; t
12: 40,22) (p & lt; 0,01; figura 1B)
(A) generación Neurosphere partir de líneas celulares SK-N-SH SF-268 y.. Bar, 50 micras. (B) Expresión de DCN y LUM ARNm en cultivos de enriquecimiento de CSC. QRT-PCR resultados se normalizaron a ACTB y se representan como cambios relativos de plegado (FC) entre neuroesferas en diferentes puntos de tiempo (t4, t8, y T12) y t adherente
0 con células de la 2
-ΔΔCt método. Todos los valores DCN y LUM FC para las neuroesferas fueron estadísticamente significativas (* p & lt; 0,01). (C) Análisis Western Blot de DCN y LUM. ß-actina se utilizó como control de carga. Los niveles totales de DCN y LUM fueron mayores en las neuroesferas que en las células adherentes de ambas líneas celulares. Una isoforma de 70 kDa LUM se upregulated en las neuroesferas de ambas líneas celulares, con la más alta expresión en las neuroesferas t8. Adherentes células SF-268 mostraron una expresión basal de la proteína nuclear de 37 kDa LUM.
El análisis de proteínas mostró un claro aumento de la proteína LUM (70 kDa) durante CSC enriquecimiento. Se detectó la expresión más alta LUM tanto en SF-268 y SK-N-SH t
8 neuroesferas (Fig 1C). Por el contrario, se detectó la proteína 40-kDa LUM con mucho menos expresión que 70-kDa LUM tanto en SF-268 y SK-N-SH, y especialmente en t
12 (Fig 1C). Por otra parte, se detectó un aumento significativo en DCN (& gt; 150 kDa) expresión de la proteína tanto en SF-268 y SK-N-SH t
12 neuroesferas mientras que la proteína 40-kDa DCN se detectó muy débilmente, con una evaluación de la expresión difícil. De acuerdo con los resultados de ARNm, 8 días SLRP
+ CSC-como (CSC-T8 similares) derivado de ambas líneas celulares NB GBM y se inscribieron en un análisis más detallado.
cultivos de agar blando de SLRP
+ líneas celulares CSC-al igual que los padres y
Para evaluar las diferencias en el crecimiento celular entre las líneas celulares como CSC-y parentales, las neuroesferas secundarias de SLRP
+ t
8-CSC como se generaron en agar blando y en comparación con las neuroesferas primarias derivadas de células de los padres. Los cultivos de agar blando independientes de anclaje mostraron colonias neurosphere en NSC SFM, mientras que no hubo bajas o colonias de células de los padres habían crecido en el ensayo de agar blando a base de DMEM después de 22 días (Figura 2A). Las primarias neuroesferas SK-N-SH eran más grandes que los SF-268 neuroesferas, alcanzando & gt; 200 m después de 3 semanas, y se había mostrado un núcleo oscuro claramente visible dentro de la estructura 3D. Los cultivos de agar blando de t
8 GBM y NB CSC-como (SLRP
+) crecieron tan pequeñas neuroesferas secundarios en NSC SFM, y curiosamente también como pequeñas colonias en DMEM después de 30 días (Figura 2B). Las neuroesferas secundarios fueron más pequeñas que las neuroesferas primarias y intrasphere destacaron células (núcleos oscuros) fueron sólo detectable en el secundario SF-268 neuroesferas después de 2 semanas, mientras que las neuroesferas SK-N-SH secundarios mantienen un aspecto translúcido.
(A) neuroesferas agar blando primaria de las líneas celulares de sus padres. Ausencia de formación de colonias en DMEM semisólida (22 días) y la formación de neuroesferas en semisólida NSC SFM (14 y 22 días). (B) neuroesferas secundarios de agar blando de SLRP
+ CSC-como aislado de t
8 neuroesferas. Neuroesferas se generaron en tanto semisólida DMEM y semisólida NSC SFM (14 y 22 días), lo que sugiere el comportamiento de ciclo lento de la actividad de evasión de la muerte CSC-like y residual en las neuroesferas secundarias adultos DMEM. Bar, 50 micras.
ultraestructuras Heterogeneic de GBM y la imagen NB neuroesferas
ultraestructural con TEM y SEM mostraron amplia heterogeneidad celular en las neuroesferas t
8 de ambas líneas celulares. SEM de formación de imágenes de las superficies de neuroesferas mostró más células empaquetadas en las neuroesferas NB que en las neuroesferas GBM, mientras que las células periféricas de las neuroesferas GBM tenían extroflections de membrana más delgadas que las neuroesferas SK-N-SH (Figs 3A, 3B, 4A y 4B ). No se observaron células electrones de alta densidad y de electrones-Lucent adyacentes y células apoptóticas esporádicos en las periferias neurosphere GBM (figura 3C-3E). se polarizaron las células periféricas de las neuroesferas NB, con más OsO _
4 tinción en el citoplasma de las células internas, y contenían gránulos densos, vesículas de endocitosis, y unos extroflections de membrana (Figura 4C-4E). Amplias zonas de muerte celular, que se caracteriza por formación de ampollas en la membrana, la formación de arrugas de células, cuerpos apoptóticos, y amplia heterocromatina compactado nuclear, se observaron en el medio de las neuroesferas de ambas líneas celulares (Figs 3G, 3H, 4G y 4H). Sin embargo, también se observaron mitosis activa y las células vivas cerca de los sitios estresados interiores, tanto en la MBG y neuroesferas NB (Figuras 3G, 3I, 3J, 4F y 4J). Curiosamente, estas células microambiente resistente en el núcleo neurosphere hipóxico mostraron núcleos dentados, grandes cantidades de eucromatina y aparatos mitocondrial claramente visible.
imagen (A) SEM de un todo SF-268 neurosphere (1,000 ×). imagen SEM de la superficie neurosphere (2,200 ×) (B). (C-J), las imágenes TEM de neuroesferas internas y periféricas. Los detalles de extroflection membrana delgada (C-D), las interacciones entre las células de alta densidad de electrones y electrón-Lucent (E), los detalles de la adhesión célula-célula (F), sufriendo los sitios en las esferas internas, con necrótico (G) y apoptosis ( las células H), las células vivas, y los detalles del aparato mitocondrial en las esferas internas (I, J). Tenga en cuenta que las células apoptóticas en la periferia de un neurosphere (D) y las células que viven cerca de los sitios de sufrimiento (I). Bar: (C-E) y (G-I), 5 micras; imagen SEM de toda neurosphere SK-N-SH (950 ×) (F y J), 1 micra.
(A). (B) de formación de imágenes SEM de la superficie neurosphere (3000 ×). (C-J) imágenes TEM de neurosphere interior y periférica. Los detalles de las vesículas celulares, polarización de las células, y el desprendimiento (C-E), las células vivas en las neuroesferas y detalles del aparato mitocondrial (F) interiores, que sufren sitios en las esferas internas, con necrótico (G) y las células apoptóticas (H y I), y un evento mitótico intrasphere (J). Bar: (C-J), 5 micras
tratamiento TMZ y ensayo MTT de SRLP
+ líneas celulares de CSC-al igual que los padres y
de rango bajo concentraciones de TMZ (. 0-500 M) no indujo diferencias significativas en las actividades metabólicas de las células parentales SF-268 y SRLP
+ t
8-CSC similares. Como se muestra en la figura 5A, la actividad metabólica de las células parentales varió de 76,14% a 100% (94,63% ± 7,10%), mientras que la actividad metabólica de SRLP
+ t
8 CSC-como osciló entre 80,71% a 100% (88,22% ± 5,43%). Las concentraciones más altas de TMZ (750-1500 M) indujeron diferencias significativas entre el SLRP
+ t
8 CSC-like y la línea celular de sus padres. A estas concentraciones, la actividad metabólica de la línea celular de sus padres SF-268 varió de 38,99% a 58,86% (51,80% ± 7,59%), mientras que la de SF-268 SRLP
+ t
8 CSC-similares osciló de 79,09% a 79,64% (78,94% ± 0,45%) (p & lt; 0,05). El SF-268 padres IC
50 fue de alrededor de 1.250 m, y no alcanzó la IC
50 de la SF-268 SRLP
+ t
8-CSC similares.
(A) SF-268 células adherentes
frente
SF-268 SLRP
+ t
8-CSC similares. (B) Las células adherentes SK-N-SH
frente
SK-N-SH SLRP
+ t
8-CSC similares. inhibición del crecimiento celular por bajas dosis de TMZ (0-500 mM) fue mayor en el t
8 CSC-como que en las líneas celulares parentales, con significación en las células SK-N-SH (* p & lt; 0,05, Fig 5B). En contraste, la inhibición por altas dosis de TMZ a, correspondiente a dosis farmacológicas (& gt; 750 mM) el crecimiento celular, fue mayor en las células parentales que en el t
células 8 CSC-como en los enriquecimientos de CSC de ambas líneas celulares (* p & lt; 0,05, Fig 5A y 5B). fondo DMSO se restó de las muestras y los valores de control, y los datos se muestran como la media (SD) de [(A
muestras-A
DMSO) /(A
Control-A
DMSO)] * 100 de cuatro experimentos independientes.
a concentraciones bajas y altas, TMZ indujo diferencias significativas en las actividades metabólicas de las células parentales SK-N-SH y la SRLP
+ t
8 CSC -me gusta. Como se muestra en la figura 5B, la actividad metabólica de las células tratadas con 0 a 500 mM TMZ varió de 75,08% a 100% (88,41% ± 6,70%) para células parentales y de 66,86% a 100% (74,70% ± 10,84%) para SRLP
+ t
8 CSC-como (p & lt; 0,05). Sin embargo, en las células tratadas con M 750-1500 TMZ, la actividad metabólica conmutada y varió de 42,91% a 68,56% (54,96% ± 9,61%) para células parentales y de 63,92% a 70,61% (66,64% ± 2,50%) para SRLP
+ t
8 CSC-como (p & lt; 0,05). El IC
50 en células parentales SK-N-SH fue de alrededor de 1.250 m, y no alcanzó la IC
50 de la SK-N-SH t
8 SRLP
+ CSC-similares.
Discusión
La teoría de células madre del cáncer es una nueva comprensión del desarrollo del cáncer que se considera ser la oncogénesis organogénesis aberrantes [56]. Debido a CSC-como están presentes en el cáncer como células iniciadoras de tumores y las células tumorales circulantes, puede ser que interactúan y reaccionan con el nicho CSC, que pueden modular las células destinos, lo que contribuye a la heterogeneidad del tejido del cáncer y la resistencia a los medicamentos [57]. Esta plasticidad facilita la pérdida de anclaje y la motilidad celular, las células tumorales circulantes generadoras
a través of the EMT en un microambiente instructiva. Diferentes subpoblaciones CSC se han encontrado dentro del mismo tumor [58], disipando todas las dudas acerca de las funciones de los CAC en la heterogeneidad del cáncer y la modulación microambiente, y por consiguiente en la resistencia a los medicamentos [59, 60]. Varios estudios previos informaron proteínas SLRP de mama [61], de páncreas [62], colorrectal [63], de cuello de útero [64], de próstata [30], y los cánceres de pulmón [65], entre otros, destacando los polémicos papeles de DCN y LUM en la biología del cáncer. Nuestros resultados proporcionan la primera evidencia de la importancia de la DCN y LUM a CSC la biología, lo que demuestra un aumento significativo de los niveles de ARNm y proteínas de ambos SLRPs en GBM y NB-CSC similares. Sin embargo, mientras que LUM ARNm y proteínas se incrementaron en t
8 neuroesferas, DCN ARNm se incrementó en t
8 y la proteína DCN en t
12. Este hecho podría explicarse por las diferencias entre DCN y LUM en intrasphere atrapamiento y tal vez por CSC mecanismos de regulación post-transcripcional específicos que todavía se desconocen. Además, la influencia de factores de crecimiento y sus receptores, tales aquellos de EGF y TGF-β1, de DCN modulación y el tráfico se ha demostrado en células adultas [66, 67], lo que sugiere la diafonía putativo de DCN y factores de crecimiento vías en CSC, los cuales merecen una investigación posterior mecanicistas.
El 3D tumorsphere culturas en medio libre de suero condicionados, que constituyen una evolución metodológica de los cultivos de neuroesferas usadas en madre neurales y la investigación de células progenitoras [68-70], se considera representativa
in vitro
modelos de cáncer útiles en el enriquecimiento CSC-como de primaria [71-75] y las líneas establecidas de células de cáncer [76, 77]. Aquí, se utilizó este modelo para lograr basada en neurosphere libre de suero CSC enriquecimiento de GBM humano y líneas celulares de cáncer de NB, la mejora de la plasticidad celular a través de la desdiferenciación de células hacia un fenotipo de tallo similares.