Extracto
witaferina A (WA), un componente bioactivo principal de la hierba de la India
Withania somnifera
, induce la muerte celular (apoptosis /necrosis) en múltiples tipos de células tumorales, pero el mecanismo molecular que subyace a esta citotoxicidad sigue siendo difícil de alcanzar. Presentamos aquí que 2 M WA induce la muerte celular selectiva en las células andrógeno-insensible PC-3 y DU-145 de adenocarcinoma de próstata, mientras que su toxicidad era menos grave en células de adenocarcinoma de próstata LNCaP sensibles a los andrógenos y los fibroblastos humanos normales (TIG-1 y KD ). WA también mató a las células PC-3 en un medio de formación de esferoides. el análisis de microarrays de ADN reveló que WA aumentó significativamente los niveles de mRNA de 11 proteínas de choque térmico (HSPs) en PC-3 y c-Fos y DU-145, pero no en LNCaP y TIG-1. El análisis de Western reveló una mayor expresión de c-Fos y redujo la expresión de la proteína c-FLIP anti-apoptótica (L). La expresión de HSP como HSPA6 y Hsp70 se elevó notablemente; sin embargo, porque el agotamiento de siRNA mediada de HSF-1, un factor de transcripción HSP-inducir, reduce la viabilidad de células PC-3, es probable que estos genes de choque térmico estaban implicados en la protección contra la muerte celular. generación Además, WA inducida de especies de oxígeno reactivas (ROS) en PC-3 y DU-145, pero no en los fibroblastos normales. La inmunocitoquímica y microscopía inmunoelectrónica reveló que WA interrumpió el citoesqueleto de la vimentina, posiblemente induciendo la generación de ROS, la expresión de c-Fos y c-FLIP supresión (L). Estas observaciones sugieren que múltiples eventos, seguido de la interrupción del citoesqueleto vimentina juegan papeles fundamentales en la muerte celular mediada por WA
Visto:. Nishikawa Y, Okuzaki D, Fukushima K, Mukai S, Ohno S, Ozaki Y, et Alabama. (2015) witaferina Un induce la muerte celular selectiva en las células del cáncer de próstata andrógeno-independiente, pero no en las células normales de fibroblastos. PLoS ONE 10 (7): e0134137. doi: 10.1371 /journal.pone.0134137
Editor: Hiroyasu Nakano, Escuela de Medicina de la Universidad de Toho, Japón
Recibido: 13 Febrero, 2015; Aceptado: July 6, 2015; Publicado: 31 de julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Nishikawa et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones-en-ayudas a la Investigación Científica S (Nº 15101006), Investigación Científica B (Nº 20370081 y 23370086) y la investigación exploratoria (Nº 21.651.085) para HN e Investigación Científica C (N ° 22.570.185) a Nueva York desde el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón (http://www.mext.go.jp/Inglés /)
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
witaferina a (WA), un componente importante de la bioactivo medicinal ayurvédica planta de
Withania somnifera
, induce la muerte celular en muchas células tumorales [1-3]. Específicamente, WA induce dependiente de la dosis la muerte celular apoptótica mediada por la respuesta de la proteína desplegada (UPR), que se activa por la acumulación de proteínas mal plegadas en el retículo endoplasmático (ER), y también hace que la apoptosis mediada por especies reactivas del oxígeno (ROS) en las células humanas de cáncer renal (Caki) [4], [5]. WA ejerce efectos antiproliferativos potentes inhibiendo la actividad chaperona Hsp90, de ese modo la inducción de la degradación de proteínas cliente de Hsp90 en líneas celulares de cáncer de páncreas Panc-1, MiaPaca2, y BxPC3; este efecto se invierte por el inhibidor de proteasoma MG132 [6]. WA suprime la expresión del virus del papiloma humano oncogenes E6 /E7, restaura actividad de la vía p53, e induce la apoptosis en las células CaSki de cáncer cervical [7]. WA provoca la detención del ciclo celular en la fase G2 /M en las líneas celulares de cáncer de próstata [8], e induce la apoptosis en células de melanoma humano mediante la generación de ROS y abajo de la regulación Bcl-2 [9].
WA une directamente para vimentina mediante la modificación covalente de un resto de cisteína (Cys328), haciendo que los filamentos de vimentina para agregar y colocalize con F-actina y alterando de esta manera el citoesqueleto vimentina [10], [11]. la agregación inducida vimentina-WA se acompaña de cambios en la forma celular, disminución de la motilidad, y la fosforilación vimentina elevado en Ser38 [12]. Estas observaciones sugieren que WA se podría utilizar para dirigirse a las células tumorales metastásicas [12], [13]. Aunque WA inhibe la transición epitelial-mesenquimal (EMT) mediante la supresión de la función vimentina [14], el efecto sobre la vimentina por sí sola no puede dar cuenta de todos los acontecimientos subcelulares mediadas por WA que conducen a la muerte celular. De hecho, WA también se une β-tubulina, la inducción de graves trastornos de la morfología normal del huso [15], y también interrumpe la organización celular de varias redes de otros filamentos intermedios (IF), incluyendo periferina, proteína de los neurofilamentos-triplete, y queratina [12]. Por lo tanto, para entender completamente el mecanismo molecular de la muerte celular inducida por WA, debemos identificar dianas moleculares adicionales de WA.
El factor de transcripción c-Fos oncogénico regula la expresión génica, en asociación con Jun u otro leucina básica proteínas de la cremallera, como un componente de la proteína activadora 1 (AP-1) complejo dímero. Aunque c-Fos ejerce funciones anti-apoptóticas, informes recientes sugieren que también puede promover la apoptosis [16], [17]. Activado c-Fos /AP-1 ceba células PC-3 y el cáncer de próstata LNCaP (PCA) para someterse a apoptosis por directamente la unión de la región promotora del gen c-FLIP anti-apoptótica (L), reprimiendo de ese modo su transcripción [18]. La apoptosis también requiere la activación del factor de necrosis tumoral (TNF) relacionados con la PI ligando inductor de apoptosis (TRAIL) /Apo-2L; esta apoptosis inducida por TRAIL es apenas detectable en las células normales [18]
La patogénesis de los tumores de próstata es inicialmente dependiente de andrógenos.; Sin embargo, muchos pacientes progresan a CaP metastásico resistente a la castración (independiente de andrógenos) (mCRPC) [19]. células de CaP andrógeno-independiente (por ejemplo, PC-3 y DU-145) exhiben características similares a madre, mientras que sensibles a andrógenos células de CaP (por ejemplo, LNCaP) no lo hacen [20-22]. Anexina A1, una proteína de unión a fosfolípidos y regulador de glucocorticoides inducen [23]. NANOGP8, un retrogene que codifica una proteína NANOG1 similar, también juega un papel en la regulación de las células madre CaP-como [24]. células de lado a la población a partir de líneas celulares humanas y tejidos con CaP xenoinjertos someterse a EMT más completo y son más agresivos que las células de selección por homólogos [25]. Por lo tanto, la EMT parece estar estrechamente asociado con el desarrollo de mCRPC. Hasta la fecha, no se han desarrollado medicamentos que matan con eficacia y de forma potente mCRPCs pero no las células normales.
En este estudio, hemos tratado de investigar si WA puede matar mCRPCs pero no las células normales, y si es así, para identificar el diana molecular esencial de WA. Se encontró que WA (2 M) induce selectivamente la muerte celular en PC-3 y DU-145 células de CaP independientes de andrógenos, pero no en células de CaP sensibles a andrógenos LNCaP o TIG-1 fibroblastos normales. microarrays de ADN y análisis de Western reveló nuevas dianas moleculares de WA que pueden definir las distintas respuestas de estas líneas celulares a WA. Debido WA mató células PC-3 en cultivos de formación de esferoides, proponemos que WA puede servir como una molécula de partida para el desarrollo de fármacos que inducen la muerte celular en las células madre del cáncer (CSC).
Resultados
TIG-1 y LNCaP son menos sensibles a WA que
PC-3 y DU-145
primera encontramos que WA indujo eficazmente la muerte celular en PC-3 y DU-145, pero LNCaP fueron menos sensibles al tratamiento WA (Fig 1). Para determinar si los fibroblastos humanos normales (TIG-1) también muestran resistencia alterada para WA, se comparó la viabilidad de TIG-1 expuesto a 2 M o 4 M WA a las viabilidades de LNCap, PC-3 y DU-145. Viabilidad de la PC-3 y DU-145 se redujo significativamente después de 8 h 4 M tratamiento WA (flechas de color rosa en la figura 1A). Por el contrario, la viabilidad de TIG-1 se mantuvo elevada, en un nivel similar al de LNCaP, hasta 8 horas después de 4 micras tratamiento WA, cuando más de la mitad de PC-3 y DU-145 había muerto (flechas verdes en la figura 1A ). La viabilidad celular de DU-145 fue mayor que la de PC-3 a las 4, 8, y 24 h.
(A, B) La viabilidad celular se midió a las 4, 8, y 24 h después de 2 M ( A) o 4 M (B) de tratamiento WA. NT, no tratado. Las flechas verdes y azules indican barras de células supervivientes, mientras que las flechas de color rosa y rojo indican las rejas por células que murieron en las mismas condiciones. Las flechas amarillas indican las muestras utilizadas para el análisis de microarrays de ADN. Las barras representan las medias ± SEM de tres experimentos independientes. púrpura flechas indican reducciones significativas en la viabilidad celular (*,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01).
Después del tratamiento con 2 M WA, viabilidad de PC-3 se redujo a 4, 8, y 24 h, mientras que DU-145 se convirtió en inviable solamente a las 24 h (flechas rojas en la figura 1B). Por el contrario, TIG-1 y LNCaP permanecieron viables a las 24 h (flechas azules en la figura 1B). La incubación de estas células durante períodos más largos demostró que TIG-1 se mantuvo viable, incluso a las 96 h, mientras LNCaP se convirtió en inviable a las 72 h (S1A y S1C FIG), lo que sugiere que 2 micras tratamiento WA no induce la muerte de TIG-1, pero la muerte de LNCaP solamente se retrasó. Otra línea de fibroblastos humanos normales (KD) también mostró resistencia al tratamiento 2 M WA (Fig S1B). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que las células TIG-1 y LNCaP son más resistentes a WA de células PC-3 y DU-145.
Sobre regulación de c-Fos después del tratamiento WA se correlaciona con la viabilidad celular
Para identificar los genes que estaban arriba o hacia abajo reguladas en estas líneas celulares después del tratamiento WA, se examinaron los transcriptomes de TIG-1, LNCaP, PC-3 y DU-145 utilizando Agilent SurePrint G3 Microarrays Humanos. Examinamos los niveles de mRNA de PC-3 y TIG-1 a 4 h y 24 h, respectivamente, después de 2 mM tratamiento WA, y para LNCaP y DU-145 en 4 h y 8 h, respectivamente, después de 4 tratamiento mu M WA (amarillo flechas en la figura 1A y 1B). Plegables cambios en la expresión génica se determinaron mediante la comparación de las intensidades de señal de hibridación entre las muestras tratadas con WA y los tratados con dimetil sulfóxido (disolvente). S1 tabla muestra una lista de genes expresados diferencialmente, dispuestas en orden de cambio veces en PC-3 descendente; todos los genes que figuran también fueron hasta reguladas por más de 4 veces en el DU-145. Diagramas de dispersión indican que los niveles de mRNA de los genes analizados fueron lo suficientemente alta (& gt intensidad de la señal en bruto; 10). Para permitir comparaciones fisiológicamente significativas (S2 FIG)
Debido a que la sobreexpresión de c-Fos induce apoptosis en células de carcinoma colorrectal humano [ ,,,0],17], nos centramos en los genes c-Fos y FosB, que eran notablemente hasta reguladas en PC-3 y DU-145, pero fueron débilmente regulados hasta en TIG-1 y menos aún en LNCaP (Tabla S1; rosada y las flechas de color turquesa en la figura S2). En PC-3, estas proteínas fueron significativamente hasta reguladas a las 4 h después de 4 tratamiento mu M WA, seguido de un aumento gradual a partir de entonces (Fig 2A). En DU-145, c-Fos era visible hasta reguladas a las 4 h, pero su expresión disminuye gradualmente después; un patrón similar se observó en TIG-1, a pesar de la sobre regulación era menos visible que en el DU-145 (Figura 2A). En LNCaP, el nivel de c-Fos fue muy baja, y era detectable sólo a las 24 h. En particular, el orden de rango de la viabilidad celular (véase la figura 1A) era idéntica a la orden del-Fos c nivel de expresión en 8 h después de 4 mM tratamiento WA (LNCaP & gt; TIG-1 & gt; DU-145 & gt; PC-3 ). Además, después de 2 mM tratamiento WA, un patrón similar de c-Fos regulación se observó tanto en PC-3 y DU-145; sin embargo, se observó muy poca expresión de c-Fos en TIG-1 y LNCaP (Fig 2B); Por lo tanto, inducida por WA expresión de c-Fos se correlacionó con la viabilidad celular. Por el contrario, FosB y FosB2 no fueron significativamente hasta reguladas, y sus niveles de expresión no se correlacionaron con la viabilidad celular (Figura 2A).
(A, B) Western blot para detectar c-Fos (FosB) en TIG-1, LNCaP, DU-145, y las células PC-3 a las 4, 8, y 24 h después del tratamiento con 4 mM (a) o 2 mM (B) WA. NT, no tratado. (C) Análisis de transferencia Western para la detección de c-Fos, PARP, FLIP y GAPDH en células PC-3 a las 12 h después de 4 tratamiento mu M WA en presencia (+) o ausencia (-) de tres diferentes siRNAs (X-Z) de OriGene. (D) La viabilidad de las células PC-3 después del tratamiento Sifos. Los datos se representan como medias ± SEM de tres experimentos independientes; flechas rosas indican una reducción estadísticamente significativa en el número de células después del tratamiento Sifos (**,
P
& lt; 0,01). (E) Población de apoptosis, necrosis y células vivas claramente tiñeron con Anexina V-EnzoGold, 7-AAD-rojo, y GFP. Los datos se representan como medias ± SEM de tres experimentos independientes; rojo, azul y flechas verdes indican cambios estadísticamente significativas (**,
P Hotel & lt; 0,01). (F) El análisis de Western blot de c-Fos, PARP, FLIP, y GAPDH en DU-145, a las 12 h después del tratamiento 4 M WA en presencia (+) o ausencia (-) de siRNAs; Sifos o siGL2 (siCONTROL). (G) La viabilidad de las células DU-145 después de la sobreexpresión exógena de pcDNA3-FLIP o vector solo en presencia de DMSO (disolvente) o 4 M WA.
knockdown siRNA mediada de c-Fos ( Sifos) rescata la muerte celular en PC-3 [18]. Por lo tanto, investigamos qué tipo de muerte celular (es decir, la apoptosis o necrosis) es rescatado por Sifos. Para estos experimentos, se utilizó siFos_Z (Fig 2C). En primer lugar, se confirmó en el PC-3 que la viabilidad disminuyó de forma significativa a las 48 h y 72 h después del tratamiento WA (figura 2D). análisis FACS (S3 Fig) reveló que la tasa de necrosis fue menor en las células tratadas con Sifos que en las células tratadas con siGL2 (control negativo) 8 h después del tratamiento con solo DMSO o WA (2 M o 4 M), lo que sugiere que la sobreexpresión de c-Fos inducida por WA juega un papel en la inducción de muerte celular necrótica (flechas rojas en la figura 2E-i). Por el contrario, en las mismas condiciones, la viabilidad disminuyó (flechas azules en la figura 2E-II) y el porcentaje de células apoptóticas aumentó (flechas verdes en la figura 2E-iii y 2E-iv). Por lo tanto, la sobreexpresión de c-Fos se correlaciona con la muerte celular inducida por WA en PC-3. Sigue siendo difícil de alcanzar si c-Fos está involucrado en la determinación de la viabilidad celular o simplemente convierte el modo de muerte celular de la apoptosis de la necrosis sin afectar a la inducción de la muerte celular. No hemos podido examinar esta cuestión en DU-145 porque ambos siGL2 y Sifos causaron la muerte celular en un nivel similar.
c-Fos ejerce su función proapoptótico en células PC-3 y LNCaP, en parte, por la represión de la expresión de c- FLIP (L), al que nos referiremos en adelante como 'Flip' [18]. El nivel FLIP se redujo después del tratamiento WA en todas las células analizadas (Figura 2B); la reducción de la FLIP fue especialmente notable en DU-145, en particular a las 24 h después de 2 mM tratamiento WA (Figura 2B, carril 16), en relación con las reducciones en TIG-1, LNCaP y PC-3 (Figura 2B, carriles 4 , 8, y 12). Esta observación sugiere que la muerte celular mediada por WA se produce, en parte, debido a la reducción de la expresión de FLIP. El análisis de transferencia Western indicó que el nivel de FLIP no se redujo mediante el tratamiento siFos_Z en PC-3 (Fig 2C, carril 6), mientras que siFos_X o tratamiento siFos_Y reducen ligeramente el nivel de FLIP (Fig 2C, carriles 4 y 5). En DU-145, el nivel de FLIP se redujo de manera similar por tratamiento con siCONTROL o siFos_Z (Fig 2F, carriles 3 y 4). Estos resultados sugieren que la modulación del nivel de c-Fos es de alguna manera relacionada con, pero no afecta directamente el nivel FLIP reducida. No obstante, la expresión exógena de FLIP en DU-145 rescató la muerte celular inducida por WA (Fig 2G). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que WA causó dos eventos independientes, a saber, un aumento en el nivel de c-Fos y una reducción en el nivel de la FLIP, para inducir la muerte celular.
La expresión de los genes HSP es hasta reguladas después del tratamiento WA
A continuación, nos dimos cuenta de que el 11 proteínas de choque térmico (HSP) genes (
HSPA6
,
DNAJA4
,
HMOX1
,
HSPA1B
,
HSPA1L
,
HSPA1A
,
DNAJB1
,
DNAJB4
,
HSPH1
, y
SERPINH1
) estaban entre los 45 genes regulados más arriba en PC-3 (S1 Tabla). HSPs son chaperones moleculares que están sometidas a la inducción rápida y fuerte por el estrés. En PC-3 y DU-145, HSPA6 fue abruptamente hasta reguladas 4 h después del tratamiento WA, mientras que en TIG-1 y LNCaP, el nivel de proteína HSPA6 fue muy baja (Figura 3A). Por el contrario, los niveles de expresión de DNAJA4 (HSP40 en adelante) y HSPA1B (en lo sucesivo HSP70) exhibieron aumentos graduales similares en estas células (Figura 3A).
(A) Western blot para detectar HSPA6, HSP40, HSPA70, EGR -1, PAR-4, y GAPDH (control de carga) en TIG-1, LNCaP, DU-145, y PC-3 células a 0, 4, 8 y 24 h después del tratamiento 4 M WA. La flecha indica la banda de buena fe EGR-1. (B) influencia de la expresión siHSPA6 sobre el crecimiento celular PC-3. (I) Esquema para este experimento. (Ii) análisis de transferencia de Western para confirmar la caída de la proteína HSPA6 por siHSPA6, en relación con las células tratadas con siGL2 (control negativo). (Iii) Influencia de siHSPA6 y siGL2 sobre el crecimiento celular PC-3, con o sin tratamiento WA. Flecha destaca la reducción en el crecimiento de células PC-3. (C) Influencia de siHSF-1 de expresión en el crecimiento de células PC-3. (i) Esquemas para este experimento. (Ii) análisis de transferencia de Western para confirmar la caída de la proteína HSP por siHSF-1, con respecto a las células tratadas con siGL2 (control negativo), y para determinar si HSF-1 desmontables afectó los niveles de proteína HSP por la detección de HSPA6, HSP40, HSPA70, y GAPDH en células PC-3. (Iii) Influencia de siHSF-1 y siGL2 sobre el crecimiento celular PC-3, con o sin tratamiento WA. Flecha destaca la reducción en el crecimiento de células PC-3. Los datos se representan como medias ± SEM de tres experimentos independientes; flechas de color rosa, verde y azul indican disminuciones significativas en la viabilidad celular (*,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01).
Para reducir el nivel de proteína en las células tratadas HSPA6-WA, se realizó la precipitación mediada por siRNA en PC-3 (Fig 3B-i). Se confirmó la precipitación con éxito por el Western Blot (Fig 3B-ii). Sin embargo, se observó poco cambio en la viabilidad celular en las células tratadas con siHSPA6 en relación con las células tratadas con un ARN control negativo (siGL2) (flechas rojas en la figura 3B-iii), lo que sugiere que la sobreexpresión de HSPA6 no es la causa de la muerte celular después de WA tratamiento.
a continuación realizó siRNA desmontables mediada por la proteína de choque térmico factor de 1 (HSF1), el principal factor de transcripción implicado en la regulación de los genes HSF [26], utilizando un diseño experimental similar (Fig 3C-i). El análisis de Western confirmó que HSF1 desmontables utilizando siHSF1 disminución de la expresión tanto de HSF1 y HSPA6 (Fig 3C-ii). Por el contrario, los niveles de HSP40 y HSP70 se inalterada (Fig 3C-ii), probablemente debido a los altos niveles de referencia de endógeno HSP40 y HSP70 (véase la figura 3A). No obstante, el tratamiento de células PC-3 con siHSF1 aumento de la muerte celular (verde y flechas azules en la figura 3C-iii), aunque el aumento no fue visible. Estos resultados sugieren que las proteínas desconocidas hasta reguladas por HSF1 protegen las células PC-3 contra la muerte celular.
Cuatro de la respuesta de crecimiento temprano (EGR) los genes se clasificaron entre las 40 genes inducidos-WA (S1 Tabla) . Los niveles de EGR-1 y EGR-3 se mantuvo constante después del tratamiento WA (S3 Fig); Por lo tanto, hemos ignorado estas proteínas en los análisis posteriores. En contra de un informe anterior [27], la apoptosis de próstata respuesta-4 (PAR-4) no fue regulada hasta después del tratamiento WA, ya sea en el ARNm (puntas de flecha verde en la figura S1) o nivel de proteína (Figura S3). Por lo tanto, estos genes no pueden estar involucrados en la determinación de la viabilidad celular (véase la figura 1).
WA induce la respuesta al estrés iniciado en el ER y las mitocondrias en las células de cáncer de próstata
WA induce la apoptosis mediada por ER estrés en células de carcinoma renal humano [4] y
Xenopus laevis
A6 renales células epiteliales [28]. Gene Ontología análisis de los datos de microarrays de ADN (Fig S5) utilizando el sistema de NextBio confirmó que los conjuntos de genes enriquecidos de alta clasificación contenían ER UPR genes relacionados con el estrés (ID, GO: 0006986; S4 figura). Para determinar si el estrés ER fue inducida a diferentes grados en TIG-1 y PC-3 después del tratamiento WA, se realizó un análisis de Western a los 2, 4 y 8 horas después de 4 micras tratamiento WA. En PC-3, se observó la inducción de la expresión de CHOP y la activación de la caspasa 3 y la escisión de PARP, que sugiere que la respuesta de estrés ER través de la activación de CHOP es importante (Fig 4). Sin embargo, la precipitación mediada por siRNA de CHOP CHOP sugieren que no juega un papel en la activación de la caspasa 3 (S6 Fig). Por el contrario, la fosforilación de Ser51 en eIF2α era ineficiente, posiblemente debido a la activación débil de PERK; en consecuencia, los eventos aguas abajo tales como la activación de caspasa 3 y la escisión de PARP eran apenas detectables en TIG-1 (paneles más a la izquierda en la figura 4). Esta respuesta débil al estrés ER puede explicar por qué TIG-1 es resistente al tratamiento WA (véase la figura 1B). En LNCaP, activación de caspasa 3 y la escisión de PARP no se observaron a 8 h; Por lo tanto, en esta línea celular la respuesta de estrés ER se activó en un nivel intermedio entre los de TIG-1 y PC-3; la resistencia de LNCaP a WA puede ser debido a este retraso en eventos aguas abajo. Sin embargo, aunque se indujo el nivel de CHOP después del tratamiento WA en DU-145, poco activación de caspasa 3 y PARP se observó escisión (paneles más a la derecha en la figura 4). Por lo tanto, la muerte celular apoptótica de DU-145 puede ser debido principalmente al aumento de la expresión de c-fos y la reducción de expresión FLIP en lugar de la respuesta de estrés ER (ver figura 3).
(A) análisis de transferencia Western para detectar IRE -1α, Perk, Ps51-eIF2α, CHOP, caspasa 3, PARP, bip, y GAPDH (control de carga) en TIG-1, LNCaP, DU-145, y las células PC-3 a las 4, 8 y 24 h después de 4 tratamiento mu M WA. NT: no tratado. (B) Representación esquemática de las proteínas analizadas en la ruta apoptótica inducida por el estrés ER. (C) Las imágenes de fluorescencia típicas de TIG-1 (i), LNCaP (ii), PC-3 (iii), y DU-145 (iv) que se trataron con 4 M WA durante 24 h y posteriormente se trata con reactivos de detección de ROS el uso de la imagen-live kit de detección de ROS verde. imágenes fusionadas se muestran las señales citoplasmáticas de ROS (verde) y las señales de ADN nuclear teñidas con Hoechst33342 (azul). barra verde, 100 micras. barra de color negro, de 10 micras.
Ashwagandha
que contiene extracto de hoja de WA hace que las células de cáncer de mama para generar ROS, que es una respuesta de estrés iniciado en la mitocondria [29]. Se examinó si el tratamiento con WA también induce la generación de ROS en células de cáncer de próstata y fibroblastos normales por un método detector de fluorescencia. En primer lugar confirmó la detección de ROS señales cuando las células se trataron con
terc -butil hidroperóxido
(TBHP), un inductor de la generación de ROS. Todas las células de la prueba mostraron señales citoplasmáticas (verde) derivados de la producción de ROS (Fig S7A). Tras el tratamiento con 4 mM WA durante 24 h, sólo se detectó un bajo nivel de citoplásmica ROS en TIG-1 (Fig 4B-i) y KD (S7B Fig), que es similar a la conclusión de un informe anterior que TIG-3 generar ROS poco después del tratamiento WA [29]. Por el contrario, se detectaron fuertes señales de ROS en LNCaP, PC-3 y DU-145 (Fig 4C-ii, -iii, y iv). Estos resultados sugieren que TIG-1 y KD, a diferencia de LNCaP, PC-3 y DU-145, no generan ROS después del tratamiento WA, lo que puede explicar por qué TIG-1 y KD son resistentes a WA.
WA induce la autofagia mediada por BAG3 en células PC-3
WA induce la autofagia en las células del cáncer de mama, pero el mecanismo detallado sigue siendo difícil de alcanzar [30]. Nuestros datos de microarrays de ADN (Tabla S1) indicaron que el nivel de ARNm de athanogene asociada a Bcl-2 3 (BAG3), un miembro de la familia BOLSA co-chaperona implicado en la autofagia [31], es regulado por el seguimiento después del tratamiento WA. Por lo tanto, se investigó si WA induce la autofagia en PC-3 mediante la expresión de EGFP-etiquetados cadena ligera de la proteína asociada a los microtúbulos 3 (LC3), un marcador de autofagia que específicamente las etiquetas membranas autophagosomal [32]. De hecho, puntos lagrimales EGFP-LC3 apareció después de 2 mM o 4 mM tratamiento WA (Fig 5A) a una frecuencia similar a la de las células privadas de suero (Fig 5B).
A) Observación de EGFP y EGFP-LC3 señales por microscopía de inmunofluorescencia. Bar, 10 micras. (B) Los gráficos de barras que muestran el porcentaje de células que contienen punteada EGFP-LC3; flechas muestran que los valores aumentaron gradualmente bajo las condiciones indicadas. Los datos se representan como la media ± SEM de tres experimentos independientes; flechas verdes indican aumentos estadísticamente significativas (**,
P Hotel & lt; 0,01). (C) Análisis de transferencia Western para detectar LC-3 y GAPDH (control de carga) en PC-3 en las condiciones indicadas. (D) Los gráficos de barras que muestran la viabilidad celular (%) en las condiciones indicadas. (E) Análisis de transferencia Western para detectar BAG3, LC-3, y GAPDH (control de carga) en células PC-3 en presencia de las condiciones indicadas de siBAG3 o siGL2 (control negativo). gráficos (F) de barras que muestra la viabilidad celular (%) en las condiciones indicadas. (D, F) Los datos se representan como la media ± SEM de tres experimentos independientes; Las flechas rojas indican reducciones estadísticamente significativas en la viabilidad celular (**,
P Hotel & lt; 0,01). (A-F) Las muestras se recogieron a las 4 h después del tratamiento WA. perfiles (G) Expresión de las proteínas relacionadas con la autofagia-BAG3 y LC3 en las células PC-3 en 4, 8, y 24 h después del tratamiento con 4 M WA. NT:. No tratado
Para determinar si la autofagia mediada por WA afecta a la viabilidad celular, agregamos inhibidores farmacológicos de la clase III fosfatidilinositol 3-quinasas, 3-metiladenina (3-MA) o wortmanina, que suprime la autofagia canónica, para las células PC-3 en presencia (+) o ausencia (-) de 4 tratamiento mu M WA. El análisis de Western indicó que WA indujo la expresión LC3 independientemente de la presencia de 3-MA o wortmanina (Fig 5C). Por otra parte, ninguno de los fármacos suprime la reducción de la viabilidad celular (Fig 5D).
Debido BAG3 activa autofagia noncanonical provocada por los inhibidores del proteasoma MG132 tales como [33], se investigó si la precipitación mediada por siRNA de BAG3 afectaría PC- 3 la viabilidad celular. siBAG3 suprimido con éxito la expresión BAG3 comparación con siGL2, un control negativo (panel superior de la figura 5E). Como era de esperar, la expresión fue suprimida por LC3 siBAG3 ya sea después de tratamiento con DMSO, 2 M MG132, MG132 20 mM o 4 mM WA (panel central de la Figura 5E). Además, la viabilidad celular se redujo después del tratamiento siBAG3 WA (Fig 5F), probablemente debido a la inhibición de la actividad anti-apoptótica de BAG3. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que BAG3 inducida por WA media la autofagia no canónica, que protege a las células PC-3 contra la muerte celular.
análisis de transferencia Western mostraron que la intensidad de la banda kDa ~ 70 de BAG3 (flecha en la Fig 5 g) se redujo en TIG-1 a las 24 h después del tratamiento WA (Fig 5G, carril 4), mientras que su nivel ya era alta (carriles 9 y 13) y sin cambios después del tratamiento WA en PC-3 (carriles 10-12) y DU-145 (carriles 14-16). Por otra parte, la banda kDa ~ 62 de BAG3 (una forma procesada putativa de BAG3) se incrementó notablemente en el PC-3 y DU-145 (punta de flecha en la figura 5G); sigue siendo difícil de alcanzar si 62 kDa BAG3 es más activo que 70 kDa BAG3 o está inactivo. Estos resultados indican que el nivel de proteína BAG3 es mayor en PC-3 y DU-145 que en TIG-1 y LNCaP. No obstante, el nivel de LC3 fue baja en PC-3 y DU-145 (paneles medias en la figura 5G), lo que sugiere que un mecanismo regulador que une actividad BAG3 y producción LC3-II fue alterada en estas células. De hecho, un informe reciente mostró que el DU-145 no puede producir LC3-II debido a una deficiencia genética de la vía de la autofagia [34]. Por el contrario, la expresión LC3 fue alta en TIG-1 y LNCaP (paneles intermedios en la figura 5G). Queda por analizar si estos resultados sugieren que estas células están de alguna manera protegidos de la muerte celular inducida por WA similar a la protección de las células Caco-2 de la muerte celular inducida por oxaliplatino [35].
TIG-1 y PC-3 muestran distintos patrones de localización subcelular vimentina después del tratamiento WA
asociados WA con vimentina y provoca una rápida reorganización de los filamentos de vimentina intermedios (VIF) en agregados perinuclear en fibroblastos humanos BJ-5ta [12]. Aunque los niveles de ARNm de vimentina eran altos e inalterada después del tratamiento WA en TIG-1, LNCaP, PC-3 y DU-145 (flechas negras en S1 Fig), análisis de Western indicó que los niveles de proteína vimentina fueron elevados después del tratamiento WA en PC- 3 (Fig 6A). Por el contrario, el nivel de vimentina era ya elevado antes del tratamiento WA, y se mantuvo elevada, en DU-145 (Figura 6A). En TIG-1, el nivel de vimentina se redujo, con productos de escisión de la vimentina [10] evidente a las 24 h (puntas de flecha Fig 6A), mientras que ninguna banda de vimentina se detectó en LNCaP (Fig 6A). Estas observaciones son consistentes con el hecho de que PC-3, pero no LNCaP, se sometieron a la EMT para adquirir la expresión de vimentina.
(A) análisis de transferencia Western para detectar la vimentina y actina en TIG-1, LNCaP, PC- 3 y DU-145 a las 4, 8, y 24 h después del tratamiento con 2 M o 4 M WA. NT: no tratado. (B) Las imágenes típicas de TIG-1 (i) y PC-3 (ii) teñido con anticuerpo anti-vimentina, faloidina (por F-actina) y Hoechst 33342 (para ADN) a los 2, 4, y 6 (h ) después del tratamiento WA. NT: no tratado. flechas rosa y amarillo indican vimentina colocalizó y agregados de F-actina. imágenes fusionadas se muestran en la fila inferior. Bar, 10 micras. (C) Porcentaje de todas las células observadas que contienen puntos de vimentina agregada o no agregada se muestran para TIG-1 (i) y PC-3 (ii). Células que albergan más de 10 vimentina agregados se calificaron como "agregados", mientras que las células con vimentina no agregada se calificaron como "no agregado". Los datos se representan como medias ± SEM de tres experimentos independientes; asteriscos indican cambios estadísticamente significativos en la viabilidad celular (**,
P Hotel & lt; 0,01; ***,
P Hotel & lt; 0,001). (D) Jasplakinoloide (JSP) no influyó en PC-3 viabilidad celular. (I) Esquema del diseño experimental. (Ii) Los gráficos de barras que muestran la viabilidad celular (%) en presencia (+) o ausencia (-) de 4 M WA o Jasp 8 h después de la adición de WA. NT: no tratado. Los gráficos de barras representan las medias ± SEM de tres experimentos independientes. Rosa, azul, verde y las flechas indican reducciones estadísticamente significativas en la viabilidad celular (*,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01).
inmunotinción a los 2, 4, y 8 h después de 4 tratamiento mu M WA causó agregación vimentina alrededor de la membrana de plasma en TIG-1 (flechas de color rosa, la figura 6B-i). Por el contrario, PC-3 exhibió una distribución homogénea de la vimentina, sin tales agregados (Fig 6B-i y 6B-ii); esto sugiere que la vimentina expresó después de la EMT en PC-3 tiene una función diferente que lo hace en las células mesenquimales. En particular, el volumen citoplásmico de PC-3 era menor que la de TIG-1. El porcentaje de células que albergan estos agregados aumentó notablemente en TIG-1 (Fig 6C-i) en relación con PC-3 (Fig 6C-ii).
Immuno-microscopio electrónico reveló señales de vimentina en FI en el citoplasma en la ausencia de tratamiento WA (S8A Fig), confirmando el origen mesenquimal de TIG-1. Notablemente, muchas señales vimentina desplazan a la región periférica del citoplasma cerca de la membrana de plasma, en un patrón que refleja la presencia de los agregados vimentina antes mencionados (véase la figura 6B-i), después de 4 h de 4 mM tratamiento WA (S8B Fig) . Por el contrario, sólo se observaron señales de vimentina dispersas en PC-3 en ausencia de tratamiento WA (S8C Fig);